Threespine sticklebacks में transgenesis और जीनोम एडिटिंग के लिए Microinjection

Developmental Biology

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Summary

ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ और जीनोम संपादन कार्यात्मक जीन और सीआईएस -regulatory तत्वों की भूमिका के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहाँ जीनोमिक संशोधनों (Tol2 की मध्यस्थता फ्लोरोसेंट संवाददाता transgene निर्माणों, TALENS, और CRISPRs सहित) की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत microinjection प्रोटोकॉल आकस्मिक मॉडल मछली, threespine की छोटी के लिए प्रस्तुत किया है।

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Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

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Abstract

threespine की छोटी मछली रूपात्मक, शारीरिक की एक विस्तृत विविधता के आनुवंशिक आधार अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली, और व्यवहार phenotypes के रूप में उभरा है। उल्लेखनीय विविध phenotypes कि के रूप में समुद्री आबादी अनगिनत मीठे पानी के वातावरण के लिए अनुकूल विकसित किया है, समुद्री और मीठे पानी रूपों को पार करने की क्षमता के साथ संयुक्त, एक दुर्लभ कशेरुकी प्रणाली है जिसमें आनुवांशिकी जीनोमिक क्षेत्रों नक्शा करने के लिए विकसित लक्षण नियंत्रित किया जा सकता है प्रदान करते हैं। उत्कृष्ट जीनोमिक संसाधनों अब उपलब्ध हैं, विकसित परिवर्तन की आणविक आनुवंशिक विच्छेदन की सुविधा। जबकि मानचित्रण प्रयोगों दिलचस्प उम्मीदवार जीन की सूची उत्पन्न, कार्यात्मक आनुवंशिक जोड़तोड़ इन जीनों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं। जीन विनियमन ट्रांसजेनिक संवाददाता प्लास्मिड और बेक्स जीनोम Tol2 Transposase प्रणाली का उपयोग करने में एकीकृत के साथ अध्ययन किया जा सकता है। विशिष्ट उम्मीदवार जीन और सीआईएस -regulatory तत्वों के कार्य को निशाना बनाया उत्प्रेरण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकताTALEN और CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन अभिकर्मकों के साथ म्यूटेशन। सभी तरीकों निषेचित एक सेल की छोटी भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड शुरू करने की आवश्यकता होती है, एक काम की छोटी भ्रूण की मोटी जरायु और अपेक्षाकृत छोटे और पतले blastomere से चुनौतीपूर्ण बना दिया। इधर, एक प्रकार की छोटी भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति और समारोह का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन अनुप्रयोगों, साथ ही transgenesis की सफलता का आकलन करने और स्थिर लाइनों को ठीक करने के लिए तकनीक के लिए वर्णित है।

Introduction

समझ कैसे पैदा होती है जैव विविधता प्रकृति में विकसित प्ररूपी परिवर्तन के आनुवंशिक और विकास के ठिकानों का निर्धारण किया जाता है में से एक मौलिक घटक है। Threespine की छोटी मछली, Gasterosteus aculeatus, विकास के आनुवंशिक आधार के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में उभरा है। Sticklebacks कई अनुकूली विकासवादी बदलाव आया है के रूप में समुद्री मछली उत्तरी गोलार्द्ध भर में अनगिनत मीठे पानी वातावरण उपनिवेश है, नाटकीय रूपात्मक, शारीरिक, जिसके परिणामस्वरूप और व्यवहार में बदलाव 1। इक्कीस की छोटी आबादी से व्यक्तियों के जीनोम अनुक्रम किया गया है और इकट्ठे हुए, और एक उच्च घनत्व संबंध नक्शा आगे विधानसभा 2,3 सुधार करने के लिए उत्पन्न किया गया है। जेनेटिक मैपिंग के प्रयोगों जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान की है अंतर्निहित विकसित phenotypes 4 - 6, और कुछ मामलों में, विशिष्ट उम्मीदवार जीन की कार्यात्मक भूमिका 7.8 परीक्षण किया गया है। रूपात्मक परिवर्तन अंतर्निहित जीनोमिक क्षेत्रों के एक नंबर का वादा उम्मीदवार जीन के साथ पहचान की गई है, लेकिन इन उम्मीदवारों नहीं अभी तक कार्यात्मक 9 परीक्षण किया गया है - 12। इसके अलावा, sticklebacks जनसंख्या आनुवंशिकी / जीनोमिक्स 13,14, 15 स्पेशिएशन, व्यवहार 1, Endocrinology 16, ईकोटोकसीकोलौजी 17, इम्यूनोलॉजी 18 और परजीवी 19 के अध्ययन के लिए आम मॉडल हैं। इन क्षेत्रों में से प्रत्येक में भविष्य के अध्ययन sticklebacks में कार्यात्मक आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने की क्षमता से लाभ होगा। उनकी कोडिंग दृश्यों में हेर-फेर करने के अलावा, उम्मीदवार जीन की भूमिका उनकी सीआईएस -regulatory दृश्यों का अध्ययन करके और कार्यात्मक रूप में वृद्धि, कम, या उम्मीदवार जीन की अभिव्यक्ति को नष्ट करने से मूल्यांकन किया जा सकता है। Sticklebacks में Microinjection और transgenesis तरीकों अच्छी तरह से 7,8,20 स्थापित कर रहे हैं और शुरू में विकसित किए गए प्रयोग एक meganuclease की मध्यस्थताविधि 21 पहले medaka 22 में वर्णित है। संशोधित microinjection यहाँ प्रस्तुत विधि दोनों Tol2 की मध्यस्थता transgenesis के लिए अनुकूलित किया गया है और हाल ही में TALENS और CRISPRs सहित जीनोम संपादन अभिकर्मकों विकसित की है।

सीआईएस -regulatory तत्वों में परिवर्तन, रूपात्मक विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है के रूप में सीआईएस -regulatory परिवर्तन म्यूटेशन 23 कोडिंग के नकारात्मक pleiotropic परिणामों से बचने कर सकते हैं। इसलिए, परीक्षण और ख्यात सीआईएस -regulatory दृश्यों की तुलना विकासवादी अध्ययन के एक बढ़ती हुई संख्या के एक केंद्रीय लक्ष्य बन गया है। इसके अलावा, सबसे मानव रोग वेरिएंट नियामक वेरिएंट 24,25, और मॉडल कशेरुकी सिस्टम कष्टदायी सीआईएस -regulatory तत्व समारोह और तर्क का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं। मछली है कि उनके भ्रूण बड़ी संख्या में बाहर से खाद सीआईएस -regulation अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली कशेरुकी सिस्टम प्रदान करते हैं। Tol2 transposon प्रणाली, जिसमें foreiजीएन डीएनए जीनोम में एकीकृत किया जा Tol2 Transposase बाध्यकारी साइटों और से घिरे हुए है Tol2 Transposase mRNA के साथ सह इंजेक्शन, सफलतापूर्वक एकीकृत करने प्लाज्मिड मछली जीनोम 26 में निर्माणों के लिए उच्च दक्षता के साथ काम करता है - 28। आमतौर पर, एक संभावित बढ़ाने एक बेसल प्रमोटर (जैसे hsp70l 29) के रूप में और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन ऐसे EGFP के रूप में (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या mCherry एक Tol2 रीढ़ की हड्डी में नदी के ऊपर क्लोन और Transposase mRNA 26 के साथ इंजेक्शन है। अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की, या तो इंजेक्शन भ्रूण या स्थिरतापूर्वक एकीकृत transgenes साथ संतानों में से अवलोकन, जीन अभिव्यक्ति के spatiotemporal विनियमन ख्यात बढ़ाने के द्वारा संचालित के बारे में जानकारी प्रदान करता है। आगे के प्रयोगों में, मान्य enhancers ब्याज की जीन के ऊतक विशेष overexpression ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

बड़ा सीआईएस -regulatory क्षेत्रों का विश्लेषण, उच्च गुणवत्ता वाले बड़े डालने के लिए Genomजीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बेक्स) का उपयोग आईसी पुस्तकालयों दोनों समुद्री और मीठे पानी sticklebacks 30 के लिए निर्माण किया गया है। ये बेक्स एक बड़े (150-200 केबी) के संदर्भ में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन जीनोमिक क्षेत्र 31 के साथ एक जीन को बदलने के लिए recombineered जा सकता है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में तो बीएसी के भीतर विनियामक दृश्यों द्वारा निर्धारित एक spatiotemporal पैटर्न में व्यक्त किया जाता है। मछली में पढ़ाई के लिए, Tol2 साइटों जीनोमिक एकीकरण की सुविधा के लिए 32,33 बीएसी करने के लिए जोड़ा जा सकता है। विकास के बाद के चरणों जब सीटू संकरण में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, बीएसी के फ्लोरोसेंट readout, जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न का अध्ययन करने के रूप में की छोटी हड्डी morphogenetic प्रोटीन 6 (Bmp6) 20 के लिए दिखाया गया है इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक व्यक्ति में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति पैटर्न समय है, जो सीटू संकरण में से पूरा नहीं किया जा सकता है पर नज़र रखी जा सकती है। बेक्स भी एक additiona जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएक जीनोमिक क्षेत्र के एल कॉपी ब्याज की एक जीन की खुराक बढ़ाने के लिए।

जीन समारोह के अध्ययन के लिए, जीनोम संपादन एक विस्फोट के विस्तार क्षेत्र है कि जीवों 34 की एक विस्तृत विविधता में जीनोमिक दृश्यों के लिए लक्षित परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) मॉड्यूलर, अनुक्रम विशिष्ट न्युक्लिअसिज़ मूल संयंत्र रोगज़नक़ों कि ठीक पसंद का एक जीनोमिक अनुक्रम को सीधे बाँध और एक डबल कतरा तोड़ 35,36 उत्पन्न करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता से अलग कर रहे हैं। संकुल नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / कैस सिस्टम मूल रूप से बैक्टीरिया में पाया जाता है और एक गाइड शाही सेना और Cas9 प्रोटीन का प्रयोग कर एक लक्ष्य डीएनए अनुक्रम गाइड 37 के पूरक में एक को तोड़ने उत्पन्न करने के लिए किया गया। अक्सर दोनों TALENS और CRISPRs द्वारा बनाई गई डबल कतरा तोड़ के बाद मरम्मत एक छोटे से सम्मिलन या विलोपन, जो लक्ष्य अनुक्रम का कार्य बाधित कर सकते हैं पीछे छोड़ देता है35-37। Sticklebacks में, TALENS एक बढ़ाने को लक्षित 20 से जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और दोनों TALENS और CRISPRs सफलतापूर्वक दृश्यों (अप्रकाशित डेटा) कोडिंग में म्यूटेशन का उत्पादन किया है। Zebrafish में उपयोग के लिए CRISPRs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता sticklebacks 38 के लिए CRISPRs विकसित करने के लिए।

ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन प्रयोगों एक नव निषेचित एक सेल भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की शुरूआत की आवश्यकता होती है। ट्रांस्जीन या जीनोम संपादन उपकरण विकास में जल्दी शुरू करके, भ्रूण में आनुवंशिक छेड़छाड़ बेटी कोशिकाओं की संख्या अधिकतम है। इंजेक्शन भ्रूण तो नेत्रहीन प्रतिदीप्ति के लिए जांच कर रहे हैं या molecularly जीनोम संशोधनों के लिए जांच की। germline के लिए योगदान दे कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लक्षित कर रहे हैं, तो ट्रांस्जीन या उत्परिवर्तन वंश के एक सबसेट को पारित किया जा सकता है, यहां तक ​​कि जब बाद इंजेक्शन मारक अधिक है। पच्चीकारी मछली outcrossed जा सकता है याintercrossed और उनके वंश उत्परिवर्ती alleles या ब्याज की एक स्थिरतापूर्वक एकीकृत transgene ठीक करने के लिए जांच की। इस प्रोटोकॉल एक सेल की छोटी भ्रूण में ट्रांसजीन और जीनोम संपादन अभिकर्मकों शुरू करने और सफल जीनोमिक संशोधन के लिए निगरानी के लिए विधियों का वर्णन।

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Protocol

सभी मछली काम कैलिफोर्निया-बर्कले विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या R330) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. इंजेक्शन के लिए न्यूक्लिक एसिड तैयार

  1. Tol2 प्लाज्मिड transgenesis (फिशर 26 से अनुकूलित)।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए आपूर्ति बफर में 10 माइक्रोग्राम Transposase प्लाज्मिड (पीसीएस-TP) 10 यू चना के साथ 39 कट linearize करने के लिए।
      नोट: सामग्री हस्तांतरण समझौते Tol2 plasmids प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    2. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 40 सोडियम एसीटेट के साथ isoamyl शराब और इथेनॉल वेग: क्लोरोफॉर्म: 24: फिनोल के 1 मिश्रण एक 25 के साथ कटौती प्लाज्मिड निकालें। 50 μl RNase मुक्त पानी में Resuspend प्लाज्मिड।
      नोट: फिनोल के क्लोरोफॉर्म एक डाकू में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और ठीक से अपशिष्ट संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक SP6 प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेट करें।
    4. एक आरएनए isol का प्रयोग करेंव्यावहारिक किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को साफ करने के लिए; 50 μL RNase मुक्त पानी में resuspend आरएनए।
    5. शाही सेना के एक 1 μl विभाज्य निकालें। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट denature के लिए माध्यमिक संरचनाओं तो तुरंत बर्फ पर ठंडा। -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष प्रतिलेखन प्रतिक्रिया रुक।
    6. 0.5x TAE में एक 1% agarose जेल (Tris आधार, एसिटिक एसिड, ethylenediaminetetraacetic एसिड) एक लेन में एक शाही सेना आकार के मानक के साथ बफर चलाने पर आरएनए विभाज्य चलाएँ। अपेक्षित उत्पाद 2,200 बीपी है; त्यागने अगर> कुल शाही सेना के 5% एक धब्बा छोटे से 2,200 बीपी, जो व्यापक गिरावट इंगित करता है (चित्रा 1) में दिखाई देता है।
    7. यों आरएनए 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग। -80 डिग्री सेल्सियस (कम से कम दो साल के लिए अच्छा) पर 350 एनजी / RNase मुक्त पानी और दुकान 1 μl aliquots में μl को पतला।
    8. क्लोन Tol2 संवाददाता प्लाज्मिड सीआईएस के साथ (उदाहरण के लिए, Tol2 किट 41 से pT2HE 8 या plasmids प्रयोग करने के लिए)- हित के नियामक तत्व। संक्षेप में, पीसीआर प्लाज्मिड में पाया प्रतिबंध साइटों युक्त प्राइमरों के साथ ब्याज की एक जीनोमिक डीएनए अनुक्रम बढ़ाना, पीसीआर उत्पाद और एंजाइम (एस), वेक्टर में डालने ligate साथ वेक्टर पचाने और सक्षम में जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड बदलना कोलाई 40। एक किट है कि निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक endotoxin कुल्ला शामिल है के साथ प्लाज्मिड अलग।
    9. एक पीसीआर शुद्धि निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट के साथ Tol2 प्लाज्मिड का एक दूसरा शुद्धि प्रदर्शन करना। 30 μl RNase मुक्त पानी में elute।
      नोट: इस कदम से उपज कम हो सकता है (इनपुट प्लाज्मिड की कभी कभी के तहत 50%)।
    10. ~ 125 एनजी / RNase मुक्त पानी में μl को प्लाज्मिड पतला।

आकृति 1
चित्रा 1. Transposase mRNA जेल। शुद्ध प्रतिलेखन प्रतिक्रिया समर्थकवाहिनी (1 μl) 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया था, बर्फ पर ठंडा, और 0.5x TAE 100 वी पर चल बफर kilobases में शाही सेना सीढ़ी के आकार (केबी) के साथ एक 1% agarose जेल पर चलने के बाईं ओर संकेत कर रहे हैं । पूरी लंबाई Transposase mRNA ~ 2.2 केबी पर एक उज्ज्वल बैंड है। अपमानित या अधूरा mRNA की एक छोटी लेकिन स्वीकार्य राशि 2.2 केबी नीचे देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. बीएसी transgenesis (बीएसी Recombineering तकनीक के लिए Suster 32,33 देखें)
    1. से बीएसी तैयार कोलाई निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बीएसी शुद्धि किट का उपयोग। एक मानक सोडियम एसीटेट इथेनॉल निकासी 40 और resuspend डीएनए RNase मुक्त पानी में ~ 250 एनजी / μl में डीएनए के साथ ठीक करने के लिए इथेनॉल का प्रयोग करें।
    2. धारा 1.1 के रूप में Transposase mRNA तैयार करें।
  2. TALENS साथ उत्परिवर्तन प्रेरण (Cermak देखें
  3. ब्याज 42 के जीन के लिए TALENS डिजाइन करने के लिए वेब आधारित अनुप्रयोग का प्रयोग करें। यदि संभव हो तो, डिजाइन TALENS प्रतिबंध एंजाइम कटौती साइट को बाधित करने के लिए आणविक विश्लेषण की सुविधा।
  4. प्रतिलेखन के लिए क्लोन TALENS और तैयार plasmids प्रोटोकॉल 35 प्रकाशित बाद।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक SP6 प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के साथ TALEN mRNA टाइप और धारा 1.1.4 में Transposase के लिए वर्णित mRNA साफ। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ यों और 200 एनजी / RNase मुक्त पानी में μl के लिए पतला। एक जेल पर TALEN mRNA भागो यह उचित आकार और कदम 1.1.6 में वर्णित के रूप में अपमानित नहीं सुनिश्चित करने के लिए।
  6. पीसीआर प्राइमरों की एक जोड़ी डिजाइन लगभग 100-200 TALEN लक्ष्य अनुक्रम एक किताब डिजाइन उपकरण और लक्ष्य डीएनए अनुक्रम 43 का उपयोग कर आसपास बीपी बढ़ाना। लक्ष्य साइट पर घावों कदम 1.3.1 के आधार पर परीक्षण करने के लिए उचित प्रतिबंध एंजाइम आदेश।
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  • CRISPR transgenesis (टैलबोट और डिजाइन और CRISPRs की तैयारी के लिए Amacher 38 देखें):
    1. डिजाइन और तैयार CRISPRs और Cas9 mRNA प्रोटोकॉल 38 के अनुसार, और आदेश में उचित सत्यापन प्राइमरों और प्रतिबंध एंजाइमों के रूप में कदम 1.3.4 में वर्णित है।
  • 2. इंजेक्शन अभिकर्मकों तैयार

    1. के रूप में नीचे वर्णित उपयोग Borosilicate केशिकाओं सुई तैयार करते हैं।
      नोट: इन केशिकाओं मानक zebrafish microinjection के लिए इस्तेमाल किया केशिकाओं नहीं कर रहे हैं, और एक मोटा और मजबूत कांच कि मुश्किल की छोटी जरायु पंचर करने के लिए महत्वपूर्ण है के बने होते हैं।
      1. जब सुई खींच हमेशा nitrile या लेटेक्स दस्ताने पहनते हैं, और सुई त्वचा या त्वचा तेलों संपर्क करने की अनुमति नहीं है।
      2. micropipette खींचने के निर्माता के निर्देशों का पालन रैंप परीक्षण द्वारा अनुभव से micropipette खींच मानकों का निर्धारण। उदाहरण के लिए, एक बॉक्स रेशा के साथ, निम्नलिखित मानकों को रोकते थेइष्टतम किया जा खनन किया: (हीट = 515, खींचो = 60, वेग = 60, देरी = 85, दबाव = 500)। ये सेटिंग्स एक सुई उसके लिए ~ 2 मिमी तेजी से लगभग 12 डिग्री और फिर एक लंबे समय तक विस्तार है कि लगभग tapers ~ 6 मिमी (चित्रा 2) के लिए 2 डिग्री tapers का उत्पादन।
        नोट: उचित मानकों को खींचने और फिलामेंट द्वारा अलग अलग होंगे, और आँख बंद करके रैंप परीक्षण के माध्यम से पहली मापदंडों का निर्धारण करने के लिए स्थायी रूप से खींचने का रेशा, जो कठिन और जगह महंगा है नष्ट कर सकते हैं बिना एक प्रोग्राम का उपयोग।
      3. निर्माता के निर्देशों 2.1.2 में निर्धारित सेटिंग्स के साथ borosilicate ग्लास से कम से कम 4 micropipette सुई खींचने के लिए का पालन करें।
      4. खड़ी तेज अंत नीचे का सामना करना पड़ के साथ केशिका भंडारण जार में स्टोर सुइयों।
      5. इंजेक्शन लगाने से पहले, बर्फ पर जगह केशिका भंडारण जार सुइयों ठंडा करने के लिए। एक बार सुई भर रहे हैं वाष्पीकरण को रोकने के जार को नम कागज तौलिया का एक टुकड़ा जोड़ें।
    2. खाद अंडे (सभीआरटी पर प्रदर्शन किया कदम)
      1. धीरे पेट फैलाएंगे और एक पूर्वकाल में पथपाकर दिशा पीछे गंदा नाला के माध्यम से और एक 35 x 10 मिमी 2 पेट्री डिश में अंडे बाहर धक्का द्वारा सगर्भा महिला की छोटी से पट्टी अंडे क्लच। आर्द्रता चैम्बर बनाने के लिए पेट्री डिश के एक तरफ (अंडे को छू नहीं) पर कागज तौलिया का एक टुकड़ा नम जोड़ें। पेट्री डिश पर ढक्कन रखें ताकि अंडे नम रहते हैं।
      2. 0.025% Tricaine-एस में 0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ बफर में पुरुष की छोटी euthanize।
      3. पेट खोलने के कट, वृषण हटाने और 250 μl हांक समाधान (हांक समाधान तैयार करने के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए Westerfield 44 देखें) में पानी में डालकर रखना।
      4. 50 μl शुक्राणु समाधान के साथ ज्यादा से ज्यादा 100 अंडे की खाद और धीरे विंदुक टिप के साथ हलचल सुनिश्चित करने के लिए सभी अंडे निषेचित कर रहे हैं। क्लच> 100 अंडे है, तो यह सुनिश्चित करें कि सभी भ्रूण इंजेक्शन के समय में एक एक सेल चरण में हैं अंडे का आधा बाद में खाद डालना। अंडे unfertilized छोड़ा जा सकता हैआरटी पर एक घंटे तक के लिए, और शुक्राणु आम तौर पर हांक समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-7 दिनों के लिए रहता है।
      5. निषेचन के बाद पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर भ्रूण रखें सुखाने को रोकने के लिए। उभरने और (इस समय के दौरान इंजेक्शन सामग्री तैयार) को प्रफुल्लित करने के लिए पहली सेल के लिए 20-25 मिनट की अनुमति है।
      6. की छोटी पानी के साथ एक 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश भरें। (एक प्रकार की छोटी पानी बनाने के लिए, पहले 10% सोडियम बाइकार्बोनेट विआयनीकृत पानी में भंग कर दिया। 3.5 ग्राम कृत्रिम समुद्री जल मिश्रण तैयार तब जोड़ सकते हैं और प्रति विआयनीकृत पानी का 1 एल .217 मिलीलीटर 10% सोडियम बाइकार्बोनेट, और हलचल / सख्ती से हिला नमक भंग करने के लिए।)
    3. इंजेक्शन समाधान (अंडे Fertilizing कर रहे हैं) तैयार
      1. बर्फ पर 1 टेबल और दुकान के अनुसार इंजेक्शन समाधान तैयार है।
        नोट: कुछ न्यूक्लिक एसिड की सांद्रता की छोटी blastomere की वृद्धि की मात्रा के कारण zebrafish के लिए प्रकाशित उन से बढ़ा दी गई है।
    <टीआर>
    अभिकर्मक Tol2 इंजेक्शन बीएसी इंजेक्शन TALEN इंजेक्शन CRISPR इंजेक्शन
    Tol2 mRNA 350 एनजी 350 एनजी - -
    डीएनए 150-200 एनजी प्लाज्मिड 200-300 एनजी बीएसी - -
    TALEN mRNA - - 200 एनजी प्रत्येक -
    CRISPR गाइड आरएनए - - - 200 एनजी
    Cas9 mRNA - - - 400 एनजी
    0.5% फिनोल लाल inDulbecco के पीबीएस 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl
    RNase मुक्त पानी 5 μl करने के लिए 5 μl करने के लिए 5 μl करने के लिए 5 μl करने के लिए

    तालिका 1:। इंजेक्शन अभिकर्मकों सभी मिश्रण 5 μl पर कुल मात्रा के लिए तैयार है और बर्फ पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

    1. भरें सुई (बर्फ पर, सुई को भरने के लिए अनुमति दें कम से कम 10 मिनट)।
      1. सुई जबकि सुई केशिका भंडारण जार में खड़ी लटक रहे हैं की कुंद शीर्ष अंत पर 0.5 μl इंजेक्शन समाधान pipetting द्वारा कम से कम तीन सुइयों backfill। सावधान कि ड्रॉप शीर्ष पर रहता है और नीचे की ओर ड्रिप नहीं है और बुलबुले से बचने रहें।
      2. बाद लाल तरल ज्यादातर सुई की ओर इशारा टिप करने के लिए सूखा है, सुई की कुंद अंत करने के लिए एक और 0.5 μl जोड़ें और यह पलायन करने की अनुमति देते हैं।

    3. इंजेक्षन रिग और सुई microinjection के लिए तैयार

    नोट: ये कदम गएक आम तौर पर अंडे निषेचन के बाद किया जा सकता है।

    1. विदारक माइक्रोस्कोप के लिए transillumination प्रकाश पर बारी और 15 सेमी प्लास्टर के साथ माइक्रोस्कोप प्रकाश आधार पर एक ~ 13 सेमी x 13 सेमी गिलास प्लेट जगह कांच की प्लेट 7 के शीर्ष पर ब्लेड देखा। सुई धारक की ओर का सामना करना पड़ indentations के साथ इंजेक्शन तंत्र को सीधा ओरिएंट देखा।
    2. हवा की आपूर्ति को चालू करें और सुनिश्चित दबाव नियामक से ~ 200 किलो पास्कल को तैयार है।
    3. नियंत्रण बॉक्स को चालू करें और सेटिंग्स समायोजित करें। सेट दबाव ~ 150-175 किलो पास्कल के लिए। 180 मिसे के लिए इंजेक्शन अवधि सेट करें।
    4. सुई धारक ढीला है, जब तक रबर धारक के विरोध को महसूस किया जा सकता धारक में एक भरा सुई डालने, और उंगली तंग जब तक कस लें।
    5. लगभग 45 डिग्री करने के लिए सुई कोण समायोजित करें।
    6. तो अंत देखने के क्षेत्र में केंद्रित है सुई समायोजित करने के लिए micromanipulator नियंत्रण का प्रयोग करें। ~ 40x बढ़ाई के लिए ज़ूम इन और सुई की नोक, जो छू नहीं किया जाना चाहिए पर ध्यान केंद्रितनीचे गिलास।
    7. धीरे घड़ीसाज़ संदंश के साथ लोभी द्वारा सुई की नोक टूट गया। आदर्श रूप में, लंबरूप तोड़ नहीं है, बल्कि एक ~ 60 डिग्री के कोण पर। टिप (अंत से दूर नहीं अधिक से अधिक 2-3 संदंश चौड़ाई, चित्रा 2) के करीब तोड़ो।

    चित्र 2
    चित्रा 2. अभंग और टूटी microinjection सुइयों। शीर्ष सुई अटूट है और नीचे सुई की नोक के साथ संदंश (तीर) टूट गया है। सुई एक समाधान युक्त 0.05% फिनोल लाल के साथ भर रहे हैं। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. इंजेक्शन पैर पेडल कई बार परीक्षण करने के लिए है कि क्या सुई टूट गया है दबाएँ। कुछ नल के बाद, छोटे लाल बूंदों टी के बाहर आने के लिए शुरू करना चाहिएवह खत्म होता है। यदि नहीं, तो सुई से थोड़ा अधिक तोड़ने की कोशिश।
    2. सुई एक हवाई बुलबुले है, तो वापस दबाव बढ़ाने के लिए और इकाई पेडल कई बार जल्दी से प्रेस बुलबुला बाहर काम करने के लिए।
    3. वापस दबाव समायोजित करें:
      1. कांच की प्लेट पर की छोटी पानी की कुछ बूँदें जगह के लिए डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें।
      2. धीरे पानी में सुई कम है।
      3. जब तक गुलाबी तरल पदार्थ की एक बेहोश धारा सुई से उभर (सकारात्मक दबाव का संकेत है) वापस दबाव बढ़ाएँ।
        नोट: यदि वहाँ पर्याप्त वापस दबाव नहीं है, सुई केशिका क्रिया द्वारा कोशिका द्रव्य को आकर्षित करेगा। अगर कोई बहुत ज्यादा वापस दबाव है, इंजेक्शन की मात्रा अनजाने में भी बड़ा हो सकता है।
      4. जहां तक ​​संभव हो, ताकि यह जबकि भ्रूण की तैयारी कर क्षतिग्रस्त नहीं किया जाएगा सुई वापस लेना (देखें नीचे)।
    4. तो यह है कि तरल पदार्थ की एक निरंतर मजबूत धारा सुई डब्ल्यू बाहर निकालता वैकल्पिक रूप से, एक उच्च दबाव स्थापित करने के लिए वापस दबाव को समायोजितमुर्गी यह पानी में डूबे हुए है। फिर, इंजेक्षन करने के लिए पैर पेडल दबाने अनावश्यक हो जाता है; हालांकि, इंजेक्शन जल्दी से इंजेक्शन से बचने के लिए किया जाना चाहिए।
      नोट: इस तकनीक का प्रयास न करें जब पहली इंजेक्षन करने के लिए सीखने।

    4. Microinjection

    1. निषेचन के बाद लगभग 25 मिनट, दो 10 μl pipet सुझावों का उपयोग क्लच और कांच की प्लेट को हस्तांतरण से 5-10 भ्रूण को हटा दें।
    2. फिर भी pipet सुझावों का प्रयोग, धीरे देखा ब्लेड के व्यक्तिगत indentations में भ्रूण अलग। सावधानी भ्रूण पंचर करने के लिए नहीं प्रयोग करें।
    3. अंत के साथ एक हस्तांतरण pipet काट इसलिए की छोटी भ्रूण के अंदर फिट होगा का उपयोग करना, भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त पानी की छोटी जोड़ने 3-5 सेकंड के लिए, तो pipet के साथ अतिरिक्त पानी निकालने, पानी कोटिंग की एक छोटी मात्रा छोड़ने पर पानी छोड़ प्रत्येक भ्रूण।
      नोट: बहुत ज्यादा पानी chorions कठोर और सुई को तोड़ने के लिए कारण होगा, लेकिन पानी की एक छोटी मात्रा चर्चा उठाने के लिए आवश्यक हैसेल और जर्दी से दूर ओरियन (चित्रा 3 ए - बी)।
    4. भ्रूण दूर दूर के साथ शुरू, कांच की प्लेट स्लाइड और में ज़ूम इतना है कि पहले भ्रूण दर्शन के क्षेत्र के लगभग 25% भरता है।
    5. दर्शन के क्षेत्र में सुई कम है, तो 10 μl pipet टिप का उपयोग धीरे भ्रूण बारी बारी से करने blastomere, एक दानेदार, थोड़ा पीला उठाया कोशिका द्रव्य की जर्दी (चित्रा 3 बी) के शीर्ष पर टक्कर की पहचान करने के लिए, और उसके बाद तो यह है कि बारी बारी से (जबकि देखा ब्लेड, चित्रा -3 सी के खरोज में भ्रूण रखते हुए) blastomere सुई के अंत करने के लिए सीधा सीधे है।
      नोट: जर्दी बूंदों के रूप में स्थानांतरित कर सकते हैं भ्रूण घुमाया जा रहा है, तो उन्हें blastomere के स्थान के लिए एक संदर्भ के फ्रेम के रूप में प्रयोग नहीं करते।
    6. कोशिका द्रव्य में सुई कम लेकिन अंतर्निहित जर्दी के माध्यम से धक्का नहीं है। दबाव धीरे-धीरे और समान रूप से लागू होते हैं जब जरायु भेदी सुई को तोड़ने से बचने के लिए। यदिसुई झुकता गंभीर रूप से वापस लेना और एक अलग स्थान में फिर से प्रयास करें।
    7. पैर पेडल दबाना 3-4 बार है कि थोड़ा फैलाना किनारों के साथ एक लाल सांस के बारे में ~ 1/8 कोशिका द्रव्य का व्यास भरता है इसलिए इंजेक्षन करने के लिए (चित्रा 3 डी देखें)।
      1. तेज किनारों कि फैलाना है, जो कोशिका द्रव्य (चित्रा 3E) के नीचे जर्दी में इंजेक्शन इंगित करता है नहीं शुरू करते हैं के साथ एक लाल सांस प्राप्त करने से बचें।
      2. एक उज्ज्वल गुलाबी-लाल जगह जल्दी diffuses हैं, तो blastomere पंचर करने के लिए आगे सुई डालें।
      3. इंजेक्शन सांस तुरन्त पीले रंग बदल जाता है, तो भ्रूण blastomere लक्षित किया गया है सुनिश्चित करने के लिए और फिर इंजेक्षन (चित्रा 3F) घुमाएगी।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. की छोटी भ्रूण की उपस्थिति से पहले और इंजेक्शन के बाद। सभी भ्रूण वें से तैयार कर रहे हैं(सी 'और जी के लिए छोड़कर) माइक्रोस्कोप के माध्यम से नीचे देख के ई परिप्रेक्ष्य। (ए) पानी जोड़ने से पहले, निषेचित भ्रूण की जर्दी के शीर्ष के निकट चल तेल की बूंदों के साथ एक समान भूमिका है। (बी) पानी, जरायु पहुँच जाती है, उनका कहना है एक blastomere कि जर्दी से protrudes और प्रोफ़ाइल में दिख रहा है खुलासा करने के बाद। (सी) भ्रूण के रोटेशन इतना है कि सुई जरायु और blastomere के लंबवत प्रवेश करती है। (सी) एक सुई कि कोशिका द्रव्य में टिप के साथ जरायु की हवा निकाल दी है की पार्श्व दृश्य। (डी) फैलाना किनारों कि समय के साथ फीका के साथ एक लाल जगह में कोशिका द्रव्य परिणामों में इंजेक्शन। (ई) की जर्दी परिभाषित किनारों के साथ एक लाल जगह में कोशिका द्रव्य परिणाम अंतर्निहित में इंजेक्शन। (एफ) पीले रंग के लिए लाल से एक पीएच प्रेरित रंग पारी में कोशिका द्रव्य परिणाम विपरीत जर्दी में इंजेक्शन। (G) पार्श्वइंजेक्शन परिणामों उप आदर्श इंजेक्शन स्थानों पर Xs के साथ, के देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. सुई वापस लेना, 10 μl pipet टिप का उपयोग भ्रूण नीचे पकड़ करने के लिए अगर यह सुई से चिपक micromanipulator नियंत्रण का प्रयोग करें।
    2. सुई से मुकर जाने के बाद, सुई के साथ अगले भ्रूण के लिए पंक्ति में कांच की प्लेट स्लाइड।
    3. सभी भ्रूण इंजेक्शन लगाने के बाद, 150 मिमी पेट्री की छोटी जल से भरी थाली में हस्तांतरण पिपेट और जगह में भ्रूण के लिए पानी जोड़ने के लिए, तो इकट्ठा करने के लिए उन्हें हस्तांतरण pipet का उपयोग करें।
    4. एक कागज तौलिया के साथ कांच की थाली से दूर सूखी बहुत अधिक पानी जमा करने से बचने के लिए।
    5. ताजा भ्रूण बांटो पर देखा और दोहराने 4.10 के माध्यम से 4.4 कदम।
    6. रखें ~ uninjected नियंत्रण के रूप में भ्रूण का 10% सुनिश्चित करने के लिए कि uninjected भ्रूण सामान्य रूप से विकसित और टी के लिए जंगली प्रकार के नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिएवह आणविक assays के नीचे वर्णित है।

    5. पोस्ट इंजेक्शन की देखभाल

    1. 10 अंडे सेने तक इंजेक्शन के बाद 18 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश में भ्रूण सेते हैं। अंडे सेने के बाद, एक्वेरियम में पीछे लार्वा वर्णित 10 के रूप में।
    2. धीरे इंजेक्शन के बाद एक दिन की छोटी टपकना पानी और ताजा पानी की छोटी के साथ बदलें। कम से कम नए सिरे से की छोटी पानी उसके बाद हर दूसरे दिन के साथ बदलें।
    3. दैनिक मृत या विकृत भ्रूण के लिए जाँच करें। पानी को दूषित से क्षय को रोकने के लिए इस तरह के भ्रूण निकालें।

    6. इंजेक्शन परिणाम विश्लेषण

    1. फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के इंजेक्शन के लिए, एक GFP या आरएफपी फिल्टर (फ्लोरोसेंट transgene पर निर्भर करता है) के साथ एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक अंधेरे कमरे में दैनिक भ्रूण की निगरानी। डिजिटल फोटो और / या लिखित विवरण और विभिन्न एक्सप्रेशंस के साथ मछली की संख्या के सारणीकरण के साथ जीन अभिव्यक्ति के रिकार्ड संरचनात्मक पैटर्नसायन डोमेन (आंकड़े 4 और 5)।
      नोट: sticklebacks, autofluorescent है तारामय वर्णक कोशिकाओं है कि 4 दिन बाद निषेचन (DPF) में शुरुआत GFP फिल्टर के तहत दिखाई दे रहे हैं।
      1. स्थिर लाइनों उत्पन्न detectable प्रतिदीप्ति के साथ भ्रूण बचाने के लिए और के रूप में 10 में वर्णित वयस्कता के लिए विकसित करने के लिए।
      2. Outcross जंगली प्रकार मछली को वयस्क मछली इंजेक्शन कदम 6.1 में वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट संतानों के लिए देखने के लिए, सफल ट्रांस्जीन संचरण का संकेत इन विट्रो निषेचन प्रक्रिया खंड 2.2 और प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन संतानों में वर्णित का उपयोग कर।
      3. रची, मुक्त तैराकी लार्वा में प्रतिदीप्ति कल्पना, मछली चतनाशून्य और जब तक छवि के लिए चलती मछली रोक इंतजार करने के लिए 150 मिमी पेट्री डिश के लिए 500 μl 0.8% Tricaine जोड़ें। इसके तत्काल बाद अवलोकन और इमेजिंग के बाद नए सिरे से की छोटी पानी के साथ कई बार कुल्ला।
      4. वैकल्पिक रूप से, आगे इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति संरक्षित करने के लिए, में लार्वा euthanize0.025% (250 मिलीग्राम / एल) Tricaine 0.1% सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde में 4 घंटे के लिए तय कर लो। अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 1x पीबीएस में स्टोर।
        नोट: समय के साथ पृष्ठभूमि ऑटो प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है।
    2. नैदानिक ​​पीसीआर / CRISPRs या TALENS साथ उत्परिवर्तन शामिल करने के लिए पाचन जीनोटाइपिंग - बेस्ट 2 दिन बाद निषेचन में प्रदर्शन किया।
      1. 12 अच्छी तरह से पीसीआर पट्टी ट्यूब के पहले 10 कुओं में 10 इंजेक्शन भ्रूण (2 DPF, अभी भी chorions में) जगह के लिए एक हस्तांतरण pipet का प्रयोग करें। पिछले दो कुओं में uninjected नियंत्रण मछली रखें।
      2. अतिरिक्त की छोटी पानी निकाल दें।
      3. 50 μl lysis बफर (10 मिमी Tris पीएच 8.3, 50 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.3% बीच 20, और 0.3% एनपी 40) प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें।
      4. ट्यूब पर जगह टोपियां और एक thermocycler में 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
        नोट: जर्दी उबलते कदम के बाद सफेद और रबड़ बंद हो जाएगा।
      5. पलकों हटाने और एक अलग CLE का उपयोगएक 1,000 μl pipet टिप प्रत्येक ट्यूब में भ्रूण पानी में डालकर रखना करने के लिए।
        नोट: व्हाइट मलबे ट्यूब के नीचे एकत्रित करेगा।
      6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के 2.5 μl जोड़ें।
      7. पलकों की जगह है और प्रोटीन को पचाने के लिए 1 घंटा, 95 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते -20 डिग्री सेल्सियस पर proteinase लालकृष्ण स्टोर को निष्क्रिय करने के लिए आचारण विकास से बचने के लिए।
      8. एक उच्च निष्ठा पोलीमर्स निर्माता के निर्देशों का पालन का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करना। डीएनए टेम्पलेट के रूप में भ्रूण lysate का प्रयोग करें।
        नोट: डीएनए टेम्पलेट के लिए ट्यूब के ऊपर से तरल निकालने के लिए सावधान रहो, ट्यूब के नीचे किसी भी दृश्य जरायु या जर्दी मलबे से परहेज।
      9. प्रतिबंध एंजाइम मास्टर 1x एंजाइम विशिष्ट बफर और 0.25 नमूना प्रति μl एंजाइम युक्त मिश्रण के साथ बराबर मात्रा में पीसीआर उत्पाद मिश्रण। हमेशा एक जेल पर परख करने के लिए पुष्टि करने के लिए पीसीआर उत्पादों की भविष्यवाणी आकार के होते हैं काटा हुआ पीसीआर उत्पाद के आधे से बचाने के लिए। पीसीआर के लिए उपयुक्त परिस्थितियों में एंजाइम के साथ मिश्रित सेतेप्रतिबंध एंजाइम।
        नोट: कुछ एंजाइमों पीसीआर उत्पाद के लिए एंजाइम बफर के अन्य अनुपात आवश्यकता हो सकती है; बफर एकाग्रता समायोजित यदि uninjected नियंत्रण पूरा पाचन नहीं दिखाते।
      10. पाचन के बाद, एक डीएनए आकार सीढ़ी के बगल में एक 1% agarose जेल पर चलने के उत्पादों की उम्मीद है और उत्पाद के आकार की पुष्टि करने के लिए।
        नोट: इंजेक्शन भ्रूण में बिना खतना बैंड आणविक घावों की उपस्थिति (चित्रा 6) से संकेत मिलता है और uninjected नियंत्रण पूरी तरह से परिणामों की व्याख्या करने के लिए पचा जाना चाहिए।
      11. घावों की पुष्टि, agarose जैल से काटा हुआ बैंड बाहर में कटौती और एक जेल निकालना किट के साथ डीएनए को शुद्ध करने के लिए। सेंगर अनुक्रमण का प्रयोग करें, आदर्श एक अनुक्रमण प्राइमर पीसीआर प्राइमरों के लिए आंतरिक उपयोग करते हुए, घावों पुष्टि करने के लिए। एफ 0 इंजेक्शन भ्रूण में, घावों का एक मिश्रण की संभावना है, उपस्थित रहेंगे सेंगर की गुणवत्ता के कारण लक्ष्य स्थल के निकट नीचा करने के लिए पढ़ें।
      12. एक स्थिर लाइन का निर्माण करने के लिए, चंगुल कि आणविक घावों के लिए सकारात्मक स्क्रीन से सभी इंजेक्शन भ्रूण को बचाने के। जीमछली, outcross अप पंक्ति, और फिर कदम 6.2.1 में वर्णित के रूप में 6.2.11 के माध्यम से एफ 1 आणविक घावों के लिए भ्रूण की एक सबसेट स्क्रीन। विषमयुग्मजी वाहक की पहचान कर रहे हैं, तो शेष एफ 1 भ्रूण वयस्कता और एक दुम फिन क्लिप से निकाले गए डीएनए का उपयोग विषमयुग्मजी व्यक्तियों की पहचान करने के लिए बढ़ता है।

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    Representative Results

    पत्रकार जीन ट्रांसजीन बढ़ाने गतिविधि है कि के लिए, सफल इंजेक्शन ट्रांस्जीन (चित्रा -4 ए, 4C) के विशिष्ट, सेलुलर अभिव्यक्ति में परिणाम होगा। इंजेक्शन मछली तो स्थिर लाइनों (बीएसी स्थिर चित्रा 4 बी में दिखाया गया लाइन का उदाहरण) का उत्पादन करने के लिए outcrossed जा सकता है। इंजेक्शन लगाने की छोटी भ्रूण में डीएनए में आम तौर पर अकेले आरएनए तुलना में कहीं अधिक मारक में यह परिणाम है। यह 50% तक देखने के लिए विशिष्ट है (कभी कभी भी अधिक) मारक या कुरूपता (देखें चित्र 4D - एफ, 4I) Tol2 संवाददाता इंजेक्शन लगाने के बाद constructs (पहले से वर्णित विधि meganuclease 21 के समान)। लेकिन, परिणाम व्यापक रूप से विशिष्ट निर्माण, भ्रूण आकृति विज्ञान, और कौशल के स्तर के आधार पर बदलती हैं। एक सक्रिय बढ़ाने के लिए, भ्रूण के 40-50% आम तौर पर मंझला और छाती पर का कवच पंख में उदाहरण के लिए ऊतक विशेष transgene अभिव्यक्ति दिखाएगा, (एफigure 5)। पृष्ठभूमि और अविशिष्ट प्रतिदीप्ति की डिग्री (चित्रा 4 जी - मैं) व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रमोटर के आधार पर भिन्न होता है; zebrafish hsp70l प्रमोटर, टपका हुआ होना करने के लिए विशेष रूप से मांसपेशियों और तंत्रिका ऊतक में जाता है, और बेक्स की जर्दी में उच्च पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति (चित्रा 4 जी के समान) हो जाते हैं। कार्प बीटा actin 41 प्रमोटर कम टपका हुआ है, लेकिन यह भी काफी हल्का GFP अभिव्यक्ति ड्राइव। Tol2 प्लाज्मिड transgenes की ट्रांसमिशन ज्यादा हो सकती है, GFP + एफ 0 मछली उत्पादन ट्रांसजेनिक वंश (तालिका 2) के ऊपर से 100% के साथ। हालांकि, transgene ले जाने के वंश का प्रतिशत, व्यापक रूप से भिन्न से <1% 72% (तालिका 2) करने के लिए। केवल + GFP इंजेक्शन भ्रूण की बचत आम तौर पर संचरण क्षमता बढ़ जाती है। बेक्स एफ 0 इंजेक्शन की छोटी उम्मीद ऊतकों में प्रतिदीप्ति दिखा भ्रूण का केवल 10% के साथ अब तक कम transgenesis दर है, करते हैं। ट्रांसबेक्स के मिशन के लिए दर प्लाज्मिड निर्माणों की तुलना में कम है, जांच की छोटी बीएसी (तालिका 2) है, जो zebrafish 32 में 15% की सूचना संचरण दर के समान है संचारण के ही अप करने के लिए 14% के साथ।

    बीएसी transgenesis की अपेक्षाकृत कम क्षमता के विपरीत, जांच की मछली की आम तौर पर 70-100% TALENS के साथ इंजेक्शन पच्चीकारी घावों राशि (एन में = 10 इंजेक्शन चंगुल कि घावों के लिए जांच की गई)। यह संख्या एक कम कुशल TALEN जोड़ी के साथ कम हो सकता है, और इंजेक्शन की गुणवत्ता के साथ भिन्न हो सकते हैं। चित्रा 6 TALENS Tfap2a के भीतर एक PvuII कटौती साइट लक्ष्य के साथ इंजेक्शन एक भी क्लच से 10 भ्रूण के लिए एक पीसीआर / प्रतिबंध पाचन पता चलता है। इंजेक्शन भ्रूण (गलियों 1-10) में से प्रत्येक में एक काटा हुआ amplicon इंगित करता है कि प्रत्येक भ्रूण में कोशिकाओं के एक हिस्से को लक्ष्य ठिकाना पर घावों ले, हालांकि प्रत्येक भ्रूण एक महत्वपूर्ण प्रकार के जंगली कटौती बैंड के साथ अत्यधिक पच्चीकारी है। गुगलियों में 11-12 uninjected भ्रूण से ई amplicon पूरी तरह PvuII साथ पचा रहे हैं। TALEN प्रेरित म्यूटेशन आसानी से अगली पीढ़ी के लिए प्रेषित कर रहे हैं। दो अलग अलग TALEN सेट के साथ, 50% और की जांच की एफ 0 90% संतानों को प्रेषित घावों, सकारात्मक चंगुल (3 टेबल) में घावों को ले जाने के वंश का 20-90% के साथ। CRISPR / Cas9 दक्षता एक CRISPR गाइड को निशाना Pitx2, एक से तीन इंजेक्शन भ्रूण से बाहर CRISPR लक्ष्य की एक पीसीआर उत्पाद की सेंगर अनुक्रमण के आधार पर घावों था के साथ की छोटी में अनुकूलित नहीं किया गया है, वहीं (काटा हुआ बैंड प्रतिबंध पाचन, चित्रा निम्नलिखित अनुक्रम था 7)। भविष्यवाणी की कटौती साइट पर अनुक्रम गुणवत्ता की हानि को इंगित करता है आणविक घावों का एक मिश्रण मौजूद हैं। फिन कतरन वयस्क एफ 0 मछली और एक पीसीआर और प्रतिबंध पाचन परख का उपयोग घावों के लिए स्क्रीनिंग पंख में दैहिक घावों के साथ 10/22 मछली पाया। इन जानवरों का एक प्रतिनिधि सबसेट 8 चित्रा में दिखाए जाते हैं </ Strong>; जबकि व्यक्तिगत # 2 घावों के साथ डीएनए के कम प्रतिशत है अलग-अलग # 3, घावों के साथ डीएनए के एक उच्च प्रतिशत है।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. इंजेक्शन भ्रूण के उदाहरण हैं। (ए) मूसा भ्रूण एक बढ़ाने कि 5 दिनों के बाद निषेचन (DPF) पर का कवच (तारांकन) में GFP अभिव्यक्ति और मंझला पंख (नोक) ड्राइव के साथ इंजेक्शन। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (बी) के एक पत्रकार बीएसी कि 4 DPF पर भ्रूण दिल में GFP अभिव्यक्ति ड्राइव के स्थिर लाइन। (सी) मूसा भ्रूण एक Col2a1a बढ़ाने कि 4 DPF पर पृष्ठदंड में mCherry अभिव्यक्ति ड्राइव के साथ इंजेक्शन। Col2 A1A बढ़ाने प्राइमरों के साथ की छोटी डीएनए से क्लोन किया गया था 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG -3 'और 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT -3' जो संरक्षित orthologous बढ़ाने डेल और Topczewski में सूचना दी बढ़ाना2011 45। (डी) एक सामान्य रूप से इंजेक्शन विकासशील भ्रूण का उदाहरण है। (ई - एफ) इंजेक्शन आघात के साथ विकृत भ्रूण के उदाहरण; ई बाईं आंख की कमी है और एफ दाईं ओर (तीर) के साथ परिगलित ऊतक है। (G) की जर्दी में फैलाना GFP अभिव्यक्ति, जर्दी बजाय blastomere में इंजेक्शन की संभावना परिणाम का उदाहरण है। (एच) एपिडर्मिस (नोक) में गैर विशिष्ट GFP अभिव्यक्ति का उदाहरण है। (मैं) उज्ज्वल, गैर विशिष्ट, बारीक GFP अभिव्यक्ति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. संवाददाता का निर्माण इंजेक्शन की दक्षता। दस चंगुल एक 190 बीपी की छोटी Bmp6 बढ़ाने कंस्ट्रक्शन कंपनी के साथ इंजेक्शन थेUCT कि 20 DPF 5 पर का कवच पंख और मंझला पंख अभिव्यक्ति ड्राइव। प्रत्येक क्लच से, कम से कम 20 भ्रूण ऊतक विशेष (कवच और / या मंझला पंख) और / या अविशिष्ट (सभी अन्य ऊतकों) GFP अभिव्यक्ति होने के लिए रन बनाए थे। गैर विशिष्ट और ऊतक विशेष अभिव्यक्ति वाले सभी जीवित रहने का इंजेक्शन भ्रूण का प्रतिशत एक boxplot के रूप में दिखाया गया है। क्षैतिज लाइनों प्रथम चतुर्थांश, मंझला और तीसरे चतुर्थक संकेत मिलता है; मूंछ पहले और तीसरे चतुर्थक के 1.5 IQR (अन्तःचतुर्थक श्रेणी) के भीतर दत्त के लिए करता हूं। डेटा एरिक्सन एट अल। 2015 से अनुकूलित कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6 पीसीआर और प्रतिबंध पाचन TALEN प्रेरित घावों के लिए स्क्रीन करने के लिए। एक TALEN जोड़ी को निशाना Tfap2a एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।


    7 चित्रा से पच्चीकारी एफ 0 CRISPR सेंगर अनुक्रमण / Cas9 इंजेक्शन भ्रूण। एक CRISPR गाइड आरएनए (5'-GTGGACCAACCTCACGG -3 ') Pitx2 के खिलाफ (शीर्ष पर दिखाया गया है) सह इंजेक्शन Cas9 mRNA (के रूप में वर्णित 38 pCS2-nCas9n प्लाज्मिड से लिखित) और भ्रूण के साथ एक प्रतिबंध एंजाइम परख का उपयोग घावों के लिए जांच की गई थी। काटा हुआ बैंड जेल निकाले और सेंगर अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम था। अनुक्रम गुणवत्ता (नीचे तीर) इंजेक्शन भ्रूण में मौजूद घावों की पच्चीकारी के मिश्रण के कारण भविष्यवाणी की दरार साइट पर degrades। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8
    8 चित्रा सीआरआई का विश्लेषणएसपीआर एफ 0 दुम फिन क्लिप। डीएनए एफ से पंख क्लिप तैयार किया गया था 0 किशोरों Pitx2 के खिलाफ CRISPRs के साथ इंजेक्शन भ्रूण से उठाया। CRISPR / Cas9 लक्ष्य प्राइमरों 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA -3 'और 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT -3' के साथ परिलक्षित किया गया था, और उत्पाद EcoRI के साथ पचा गया था। चार व्यक्तियों को दिखाया जाता है; एक काटा हुआ पीसीआर उत्पाद पर छोड़ दिया है और पच पीसीआर उत्पाद प्रत्येक गिने व्यक्ति के लिए सही पर है। उत्पाद काटा हुआ बैंड (~ 230 बीपी) पचा लेन में के आकार के एक घाव की उपस्थिति इंगित करता है। व्यक्तियों 2, 3 और 4 के लिए आणविक घाव के सभी शो के संकेत, तारों के साथ संकेत दिया व्यक्तियों के बीच mosaicism के साथ अलग। प्रासंगिक सीढ़ी आकार बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    निर्माण GFP वंश / कुल F0 जांच की मछली (%) % F1 संतानों सकारात्मक ध्यान दें
    बीएसी एक 6/46 (13%) 4-19%
    बीएसी बी 1/41 (2%) 4%
    बीएसी सी 5/42 (12%) 3-40%
    बीएसी डी 3/22 (14%) 5-15%
    प्लाज्मिड 2/38 (5%) 2-5% सभी F0 भ्रूण जांच की, न सिर्फ + GFP
    प्लाज्मिड बी 3/16 (19%) <1-8% सभी F0 भ्रूण जांच की, न सिर्फ + GFP
    प्लाज्मिड सी 1/11 (9%) 10%
    प्लाज्मिड डी 2/11 (18%) 1-45% प्लाज्मिड डी में इंजेक्शन2 आनुवंशिक पृष्ठभूमि
    प्लाज्मिड डी 5/5 (100%) 16-72%
    प्लाज्मिड ई 2/3 (67%) 2-22%
    प्लाज्मिड एफ 2/6 (33%) <1-65%
    प्लाज्मिड जी 3/8 (38%) 2-56%
    प्लाज्मिड एच 3/18 (17%) रन बनाए नहीं
    प्लाज्मिड मैं 24/05 (21%) रन बनाए नहीं

    तालिका 2:। बेक्स और बढ़ाने निर्माणों के लिए ट्रांसजीन संचरण क्षमता एफ 0 इंजेक्शन भ्रूण वयस्कता के लिए उठाए गए थे और उसके बाद जंगली प्रकार मछली और एफ 1 संतानों के लिए outcrossed GFP प्रतिदीप्ति के लिए रन बनाए। कि ट्रांस्जीन प्रेषित एफ 0 व्यक्तियों की संख्या expr हैके सभी जांच एफ 0 मछली एक प्रतिशत के रूप में essed। एफ 1 ट्रांस्जीन ले जाने संतानों के प्रतिशत की सीमा भी उन चंगुल कि GFP सकारात्मक मछली था के लिए दिखाया गया है।

    TALEN % F0 संचारण घावों % F1 संतानों सकारात्मक
    9/10 (90%) 20-90%
    बी 4/8 (50%) 20-72%

    तालिका 3:। दो TALEN जोड़े के लिए ट्रांसमिशन क्षमता एफ 0 इंजेक्शन भ्रूण वयस्कता के लिए उठाए गए थे और उसके बाद जंगली प्रकार मछली और एफ 1 संतानों TALEN घावों के लिए जांच करने के लिए outcrossed। घावों संचारण इंजेक्शन व्यक्तियों का प्रतिशत दिखाया गया है, उन लोगों के चंगुल में घावों के साथ संतानों के प्रतिशत के रूप में अच्छी तरह सीमाकि प्रेषित घावों। TALEN एक लक्षित एक Bmp6 बढ़ाने 20, talen बी Tfap2a (अप्रकाशित) को निशाना बनाया।

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    Discussion

    transgenesis या जीनोम संपादन के लिए इंजेक्शन एक सेल की छोटी भ्रूण तीन मुख्य चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, zebrafish भ्रूण के सापेक्ष, की छोटी भ्रूण जरायु कठिन है और अक्सर सुइयों टूट जाएगा। इस समस्या को आंशिक रूप से मोटा और मजबूत कांच micropipettes का उपयोग कर और जरायु को सीधा इंजेक्शन लगाने के द्वारा दूर किया जा सकता है (प्रोटोकॉल, चित्रा 2 देखें)। यह सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में रूप में है कि कम पानी की भ्रूण में जोड़ा जाता है (बस पर्याप्त जरायु प्रफुल्लित और सेल से दूर लिफ्ट करने के लिए प्रेरित करने के लिए) जरायु कठोरता को कम करने में मदद करता है। जरायु समय के साथ मज़बूत बनाता है, इसलिए भ्रूण moistening के बाद जल्दी से काम करना जरूरी है। इंजेक्शन से पहले एक आर्द्रता चैम्बर में भ्रूण रखते हुए इतना है कि वे बाहर सूखी नहीं भी महत्वपूर्ण है। कुछ चंगुल और यहां तक ​​कि व्यक्तिगत भ्रूण बस बहुत मोटा और मुश्किल chorions है; कभी कभी अगले भ्रूण पर जाने से या एक नया क्लच के साथ की कोशिश कर सबसे आसान उपाय है। यह एक घ छोड़ करने के लिए बहुत आसान है ifficult भ्रूण एक क्षतिग्रस्त सुई की जगह की तुलना में। बैकअप सुइयों तैयार होने इंजेक्शन सुई टूटना के मामले में जारी रखने के लिए अनुमति देगा। जब बेक्स इंजेक्शन लगाने के लिए, यह सुई रोकना करने के लिए आम बात है। सुई धीरे स्क्रैप या संदंश के साथ टिप फिर से तोड़कर unclogged जा सकता है, या रोकना शुद्ध करने के लिए निरंतर हवा के दबाव स्विच का उपयोग करके।

    दूसरा, भ्रूण में पहले कक्ष की पहचान चुनौतीपूर्ण है; यह अक्सर काफी चपटा है और मुश्किल शुरुआती देखने के लिए, और विशेष रूप से अदृश्य है जब उस पर सीधे देख रहे हैं। अक्सर blastomere केवल प्रोफ़ाइल में एक थोड़ा उठाया टक्कर के रूप में देखा जा सकता है। इसलिए, यह प्रोफाइल में सेल की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा है (चित्रा 3 बी) और फिर धीरे से भ्रूण आगे बारी बारी से और टीम के लिए तो सेल कोणीय सुई के अंत का सामना करना होगा (हालांकि सेल अक्सर इस कोण से अदृश्य हो जाएगा; चित्रा 3 में blastomere के काले रंग स्पष्टता के लिए अतिरंजित है)।

    e_content "> तीसरा, कोशिका द्रव्य को निशाना भी विशेष रूप से अगर पहली सेल विशेष रूप से फ्लैट है मुश्किल है। blastomere (आमतौर पर केंद्र) की fattest भाग के लिए लक्ष्य। कोशिका द्रव्य में इंजेक्शन लगाने की संभावना को बेहतर बनाता है कोशिका द्रव्य के पास की जर्दी में इंजेक्शन लगाने जबकि सफलतापूर्वक ट्रांसजेनिक मछली उत्पादन कर सकते हैं, दक्षता, 25 मिनट से अधिक समय बढ़ाया जा रहा है और मारक कमी आई है जब कोशिका द्रव्य एक एकल सुई पंचर के साथ लक्ष्य रखा गया है। कभी कभी, व्यक्तिगत चंगुल विशेष रूप से पतली blastomeres, कि इस तरह की जर्दी से बचने के लिए लगभग असंभव है होगा। वेटिंग शुरू करने के लिए इंजेक्शन की मदद कर सकते हैं (कुछ चंगुल एक पूर्ण आकार blastomere तक ~ 45 मिनट के बाद निषेचन फार्म नहीं है), लेकिन blastomeres आकार में वृद्धि कभी नहीं करते हैं, तो यह बार की तुलना में अंडे की एक नई क्लच प्राप्त करने के लिए चपटा कोशिकाओं इंजेक्षन करने की कोशिश करने के लिए आसान है ।

    अत्यधिक मारक निम्नलिखित इंजेक्शन कई कारणों से हो सकता है। ब्लंट सुइयों और / या बहुत बड़ा एक सुई बोर आकार का कारण बन सकता है टीऊ सेल और / या कारण कोशिका द्रव्य को बहुत नुकसान बाहर रिसाव। कुछ डीएनए निर्माणों विशेष रूप से घातक होने लगते हैं; डीएनए की एकाग्रता को कम अस्तित्व लेकिन कम transgenesis दर में सुधार कर सकते हैं। एक midiprep किट कि एक endotoxin कुल्ला एक दूसरी पीसीआर सफाई किट के द्वारा पीछा के साथ पहली बार होता है plasmids को सफाई विषाक्तता का निर्माण कम कर देता है। अंत में, जीनोम संपादन समारोह उत्परिवर्तन है कि भ्रूण के विकास के लिए घातक है की हानि का उत्पादन हो सकता है। CRISPR या TALEN mRNAs की एकाग्रता को कम करने भ्रूण मारक को रोकने के लिए की mosaicism बढ़ा सकते हैं, लेकिन उत्परिवर्ती एलील वसूली क्षमता को कम कर सकता है।

    एक meganuclease विधि का उपयोग कर 21 ट्रांसजेनिक sticklebacks पैदा करने के लिए एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल एफ 0 संस्थापक मछली से एक 4-7% ट्रांस्जीन germline संचरण दर की सूचना दी। Tol2 विधि यहां बताया परिणामस्वरूप में एफ 0 संस्थापक मछली से एक 72% ट्रांस्जीन germline संचरण दर करने के लिए (यह दर्शाता कई जीनोमिक एकीकृतआयनों)। पिछले एक meganuclease पद्धति का उपयोग करके अध्ययन विशिष्ट GFP अभिव्यक्ति, यहां बताया कि इसी तरह दिखा इंजेक्शन भ्रूण के 40% की सूचना दी। इस प्रकार, जबकि ट्रांसजेनिक एफ 0 संस्थापकों में से समान दर दोनों meganuclease और Tol2 तरीकों द्वारा उत्पन्न ट्रांसजेनिक मछली के लिए मनाया जाता है, germline संचरण दर Tol2 मध्यस्थता ट्रांसजेनिक्स के लिए काफी ज्यादा होता है।

    जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों अग्रिम करने के लिए जारी है, और भी अधिक विशिष्ट आनुवंशिक जोड़तोड़ की छोटी और अन्य मछली प्रजातियों में संभव हो जाएगा। उदाहरण के लिए, निर्देशित मरम्मत 46 और मुताबिक़ पुनर्संयोजन समुद्री और मीठे पानी की छोटी जीनोम, और संशोधित CRISPRs के बीच एलील स्वैप विशेष रूप से करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सक्रिय या जीन अभिव्यक्ति 47 को बाधित की अनुमति देगा। जीनोम संपादन और विश्लेषण के लिए इन रोमांचक प्रौद्योगिकियों कई दिलचस्प रूपात्मक, शारीरिक के आनुवंशिक आधार के बारे में नए अंतर्दृष्टि, और stic में व्यवहार phenotypes को बढ़ावा मिलेगाklebacks और अन्य मछली प्रजातियों।

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    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    इस काम के हिस्से में एनआईएच R01 # DE021475 (सीटीएम), एक एनआईएच predoctoral प्रशिक्षण अनुदान 5T32GM007127 (पीएई), और एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (NAE) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम कैथरीन Lipari CRISPR सेंगर अनुक्रमण डेटा पैदा करने के लिए बीएसी recombineering और इंजेक्शन, निक Donde के प्रदर्शन के लिए केविन Schwalbach धन्यवाद, और इंजेक्शन प्रोटोकॉल पर उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
    Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
    Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
    Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
    Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
    Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
    Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
    Iron plate (magnetic base) Narishige IP
    Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
    Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
    0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
    #5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
    Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
    6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
    13 cm x 13 cm glass plate any hardware store -
    Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
    150 x 15mm Petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
    35 mm x 10 mm Petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
    Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
    Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
    Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
    Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
    RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
    QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
    Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
    Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
    NotI NEB R0189L
    Phusion polymerase Fisher F-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
    QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
    Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
    Sodium acetate Sigma S2889-250G
    Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
    Agarose Sigma A9539
    50x Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
    0.5-10 Kb RNA ladder ThermoFisher 15623-200
    Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
    Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
    10x PBS ThermoFisher 70011-044
    1 kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
    Potassium Chloride Sigma P9541-500G
    Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
    NP-40 ThermoFisher 28324
    Tween 20 Sigma P1379-500ML
    Tris pH 8.3 Teknova T1083
    12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

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    References

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