신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델

Medicine

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Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. J. Vis. Exp. (111), e54100, doi:10.3791/54100 (2016).

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Abstract

관상 동맥 결찰에 의해 유도 된 심근 경색 심장 수선과 재생의 기전을 연구하고 치료제에 대한 새로운 타겟을 정의하는 수단으로 여러 동물 모델에서 이용되고있다. 수십 년 동안, 전체 심장 재생의 모델은 양서류와 물고기에 존재하지만, 포유 동물 상대는 사용할 수 없습니다. 마우스는 재생 기능을 가지고있는 동안 윈도우 생후 최근 발견은 심장 재생의 포유 동물 모델의 확립하게되었다. 신생아 마우스에서 포유류의 심장 재생의 수술 모델이 여기에 표시됩니다. 간단히, 출생 후 하루 1 (P1) 마우스는 이소 플루 란으로 마취 및 저체온증을 유도하는 얼음 패드에 배치됩니다. 흉부가 개방되어, 관상 동맥 (LAD)를 좌전 하행이 가시화되면, 봉합은 좌심실의 심근 허혈을 가하기 위해 LAD 주위에 배치된다. 수술은 10 ~ 15 분 소요됩니다. 관상 동맥된다 시각화정확한 봉합 배치 및 재현성이 매우 중요. 심근 경색 및 심장 기능 부전은 각각 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색 및 심장 초음파에 의해 확인된다. 전체 재생 이십일일 후 심근 경색은 조직 학적으로 확인됩니다. 이 프로토콜은 심근 경색 후 포유류 심장 재생 메커니즘을 규명하는 도구로 이용 될 수있다.

Introduction

심근 경색 (MI)는 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며, 심부전 케이스 (1)의 약 1/3을 담당 남아있다. 경피적 중재 및 혈전 용해제의 사용의 지속적인 최적화의 출현은 MI, 심근 사망과 심근 수축성 손실 다음 재관류 증가되었지만, 그럼에도 불구하고 일어난다. 또한 후보자하지 않거나이 개입에서 혜택을 볼 수 없습니다 "노 옵션"환자의 다수가 남아있다. 이 환자들은 경색 치료의 메커니즘으로 형성과 해로운 심실 리모델링 흉터로 이어지는 사용하지 허혈가 계속 발생. 이러한 과정은 결국 예후가 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 및 베타 차단제와 최적의 약물에도 불구하고 여전히 좋지 관리되는 심부전을 초래한다. 불행하게도, 심각하게 손상 좌심실 기능을 가진 환자의 1 년 사망률은 여전히​​ 남아있다26 %이 높은. 심장 이식은 심부전 환자의 최종 치료 옵션입니다. 그러나, 심장 이식에 대한 제한 기증자 풀이 대부분의 환자에 대한 실행 가능한 옵션하지 않습니다. 따라서, 심근 손상을 복구하는 신규 치료제의 발견은 심장 질환의 문제를 해결하는 가장 중요한 남아있다. 심장 손상의 신뢰할 수있는 동물 모델 따라서이 과정의 중요한 구성 요소로 필요합니다.

전통적인 교리는 성인 심근 세포가 분할 또는 손상된 심근 3를 대체하는 탈 분화 능력이 후 유사 분열, 말기 차별화 된 세포 것을 지시했다. 따라서, 성인 포유류의 심장은 완전히 부상에서 회복하지 수, 손실 심근는 섬유 조직으로 대체 될 것이다. 따라서, 연구가 경색 팽창을 최소화하고 흉터 형성을 감소시키기 위해 주로 치료제에 집중하고있다. 보다 최근에는 다소 패러다임 변화가 발생한심장 치유와 많은 연구 노력을 둘러싸는 생각에 심장 재생 4의 가능성에 초점을 리디렉션되었습니다.

최근까지, 심장 중생의 생체 내 연구는 이러한 urodele 양서류 및 경골 어류 5-7에서와 비 척추 동물 모델에 제한되었다. 그러나, 신생 마우스의 심장 재생을위한 능력의 발견은 포유류 심장 수술 재생 두 모델의 개발을 주도하고있다 : 정점 심장 관상 동맥 폐쇄의 절제 심근 경색 8,9 유도. 2011 년, 마우스 정점 절제 모델은 전체 심장 재생이 출생 후 하루 1 (P1)에서 가능하다 보여주기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한 용량은 빠르게 초기 신생아 기 이후 감소. 포유 동물의 심장이 곧 전구 세포 수의 감소로 P7에서 출생 후 자사의 회생 가능성을 상실하고, 이핵 될 심근 잃을그들의 증식 능력, 영구적는 세포주기 10, 11을 종료합니다. 신생아 및 성인 포유류의 심장 사이의 근본적인 차이를 이해하는 것은 심장 재생에 대한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다.

정점 절제술이 실제로 수축 조직의 재 성장에 대한 통찰력을 제공하지만,이 모델은 치료제의 개발뿐만 아니라 적합하지 않습니다 따라서 일반적인 인간의 심장 부상을 시뮬레이션하지 않습니다. 관상 동맥 폐쇄 모델은, 그러나, 더 직접적으로 인간의 사용을위한 치료 발전에 적용 할 수있다 메커니즘에 더 유용한 통찰력을 제공 할 수있다, 따라서 MI 병리의 병태 생리 학적 측면을 시뮬레이션합니다.

사지 동맥 결찰 많은 동물 모델에서 12-14 유용한 실험적 기술로서 사용되어왔다. 성인 관상 동맥 결찰 모델에서, 동물을 마취 respirati 유지하면서 흉강의 개방을 허용하도록되어 삽관에. 심장은 관상 혈관의 시각화를 허용하고 정확한 봉합 배치를 허용, 정기적으로 이길하고 있습니다. 또한 관류가 계속 심장 분홍색을 유지하고 결찰 후 허혈성 심근 성공적인 관상 동맥 결찰을 나타내는, 창백한 나타납니다. 관상 동맥이 가시화되지 않고 외과 봉합사 (15)를 배치하는 위치를 추정해야하므로 신생아 쥐에 대해 기재된 프로토콜은 그러나, 덜 신뢰할 수있다. 관상 혈관의 일반적인 해부학 방향에있어서 동일한 개별 동물 가변성이며 LAD의 분기 (16)이 존재하더라도. "블라인드 것"때 따라서, 동맥 쉽게 놓칠 수 있습니다. 심장 초음파 등과 같은 다른 기술이어서, MI의 성공적인 도입을 확인하고, 모든 수술 유사한 경​​색 크기 될 수 있도록 요구된다. 개선은 LAD의 위치가 맛 음료 할 수있는 최근에 출판 된 방법 (15), 여기에 있습니다 설명졌으 따라서 LAD가 재현 MI를 유도하기 위해 결찰 할 수있다.

이 기술은 폐 붕괴가 발생하지 않는 신생아 마우스의 저체온 상태에서 개흉술과 같은 기관 내 삽관 또는 기계 환기를 필요로하지 않습니다. 그러나, 전술 한 방법에서, 심한 저체온증 완전한 무호흡 및 심장 리듬 (15)의 중단 두 지점으로 유도한다. 이 방법의 중요한 한계는 관상 동맥 관류 더이상 것이없고 심장도 LAD 결찰 전 담색 나타난다. 여기에 기술 된 방법에서는 관상 동맥의 시각화는 수술 후 신생아 마우스의 전체 복구 깊은 체온과 심장 박동 정지, 이전에 무기력의 지점에서 가능하다. 이 방법은 100 % 재현성의 중요한 이점을 제공한다.

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Protocol

C57BL / 6, CD-1 IG-S 쥐의 번식 쌍은 찰스 강에서 구입 하였다. 본 연구에 사용 된 동물은 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 처리하고, 연구 프로토콜 웨스턴 대학, 런던, 캐나다에서 동물 사용 분과위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물 관리

  1. 출산이 완료되고 새끼가 처음 모유 공급 몇 시간 동안 자신의 어머니가되었습니다 후, CD-1 수양 어머니와 함께 다른 케이지에 배치합니다. CD-1의 어머니는 강한 육성 본능을 가진 조용한 표현형을 표시하고 부상당한 새끼 (15)를 잠식하는 낮은 경향이있다.

2. 수술

  1. 밀폐 된 이소 플루 란 챔버에 강아지를 배치하여 마취를 유도 (약 100 % V / V의 이소 플루 란의 500 μL는 3cm 1,300 실을 발산 할 수). 이동 (약 30 초) 중단 될 때까지 실에서 마우스를 유지합니다.
  2. 미주리 제거이소 플루 란 챔버에서 사용하고 젖은 얼음에 마우스를 배치하여 저체온 마취를 유도한다. 동상을 방지하기 위해, 멸균 수술 장갑 내부에 얼음을 배치 장갑 내에서 마우스를 싸서 얼음 장갑을 포함 또는 멸균 젖은 거즈에 마우스를 포장하고 얼음에 놓습니다.
    주 : 마우스는 얼음과 접촉 큰 표면적 상에있을 때 더 빠른 냉각과 같은 녹은 얼음으로 저체온 유도 시간을 단축 할 수있다.
  3. 발가락과 꼬리 핀치에 운동 응답의 부족으로 마취를 확인합니다.
    참고 : 자극 운동 중단은 15 ° C, 8 ° C 사이의 체온에서 발생한다. (이 온도 약 1 분 시간을 냉각). 전체 무호흡증과 심장 무 수축은 LAD 결찰 필요하지 않습니다.
  4. 운영 현미경을 갖춘 외과 영역에 얼음 침대를 이동합니다. 마우스 강아지가 전체 수술하는 동안 얼음에 남아 있는지 확인합니다.
    참고 : 외과 영역, 거즈 및 수술 도구를 소독해야한다. 터 유지 보수절차 전반에 걸쳐 무균 필드 및에 하나의 사용, 무균 수술 장갑을 착용하십시오. 그들의 눈 (17) 폐쇄와 마우스가 태어나으로 안과 연고가 필요하지 않습니다.
  5. 오른쪽 측면 욕창 위치에 마우스 강아지를 놓습니다. 부드럽게 에탄올 면봉 다음에 포비돈 - 요오드 용액으로 닦아 가슴을 소독.
  6. 왼쪽 앞다리 아래 xyphoid과 왼쪽 겨드랑이 사이에 몇 밀리미터 피부를 절단하여 중간 액와 선을 따라 왼쪽 가슴에 피부 절개를 수행합니다. 또한 기본 가슴 근육 층을 잘라 가위를 사용합니다.
  7. 집게로 갈비와 늑간 근육을 분리하여 4 번째 늑간 공간에서 좌측 개흉술을 수행합니다.
    주 : 신생아 갈비뼈가 매우 연약하고 쉽게 나눌 수 있습니다. 늑간 근육을 따라 집게를 열고 (가 아닌 갈비뼈를 파악)하여, 부드럽게 별도의 갈비뼈를 방지합니다.
  8. 왼쪽의 AUR에서 신흥 왼쪽 전방 관상 동맥 (LAD)를 내림차순를 시각화폐 정맥 뒤에 icle과 큰 심장 혈관 이상으로 내림차순.
    참고 :이 초기 신생아 창에서 흉선은 종종 가시화되고 심장베이스의 일부를 커버 할 수있다. 젊은이는 흉부 절개 각도에 따라, 흉선의 위치 옆에 부상을 알 수있다.
  9. 왼쪽 귓바퀴 (그림 1C) 아래의 중간 뇌실을 통해 동맥 아래 11-0 나일론 봉합사 (0.007 mm 직경의 바늘)을 전달하여 LAD을 결찰. 허혈 봉합 부위 (도 1G) 아래의 심근 희게으로 확인된다.
  10. 8-0 나일론 봉합사 (0.15 mm 직경의 바늘)를 사용하여 흉부 절개를 닫습니다. 갈비뼈를 닫 두 봉합을 사용합니다. 체강 통과 할 때 폐 천공하지 않는 바늘을 확인하기 전에 두 리브 결찰 봉합사를 놓는다.
  11. 리브을 닫은 후, 얼음 침대에서 마우스를 제거합니다. 외과 영역 내에서 마우스를 유지하고에 무균 수술에 직접 배치37 ° C에서 따뜻한 가열 패드를 통해 아 온난화를 시작합니다.
  12. 일단 가열 살균 영역, 8-0 나일론 봉합사 (0.15 mm 직경의 바늘)를 사용하여 근육 및 피부 층을 닫는다. 근육층에 대해 하나의 봉합사를 사용하여 피부를 절개 두 봉합사를 사용한다.
    주 : 근육과 피부 층 저체온증 노광 시간을 단축하는 가열 패드를 폐쇄 할 수있다. 마우스 온도는 한 번 가열 패드에 배치 상승하기 시작하지만, 근육과 피부 폐쇄시 마취 유지를위한 충분한 충분히 낮은 남아있다.

3. 수술 복구

  1. 자발적인 운동의 반환 될 때까지 따뜻한 가열 패드 빠른 온난화를 계속합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 부드럽게 에탄올 면봉으로 부상 사이트를 닦아 포비돈 - 요오드 및 혈액을 제거합니다.
  2. 마취에서 충분히 회복 한 후 위탁에서 침구를 얼룩, 무균 수술 영역에서 제거어머니의 케이지, 및 반환 강아지는 어머니를 육성합니다. 이것은 어머니의 거부 또는 잠식을 방지하는 데 도움이됩니다.
    참고 : 완전히 회복 될 때까지 다른 동물과 케이지에 새끼를 반환하지 마십시오. 전체 쓰레기를 사용하고, 한배 새끼가 수양 어머니와 함께 유지되지 않은 경우, 쓰레기의 중간에 복구 새끼를 배치합니다. 하나 이상의 수술을 수행하는 경우, 완전한 자신의 수양 어머니로 쥐를 반환하기 전에 개별 쓰레기에 필요한 모든 수술.
  3. 강아지의 수용을 보장하기 위해 3 시간 - 2 15 분 - 강아지를 향해 매 10을 수양 어머니의 행동을 관찰한다. 어머니가 부상당한 강아지를 향해 공격을 표시하는 경우, 강아지를 제거하고 이소 플루 란 과다 복용으로 안락사 (> 5 %, 호흡 중단까지), 잘린 하였다. 참고 : 중앙 통증 반사가 완전히 초기 15 세에서 개발하지 않는 한 수술 전후 통증의 약물 치료는 필요하지 않습니다.

4. 측정 심근의 경색 크기 4 -6 시간 후 MI

  1. 6 시간 - 새끼 4의 기간 동안 CD-1 수양 어머니의 보호에 복구 할 수 있습니다. 어머니와 함께 케이지에서 강아지를 제거하고 큰 가위로 잘린 다음에 이소 플루 란 과다 복용하여 안락사.
  2. 해부 현미경으로 마음을 절제, 조심하지 심근를 추출 할 수 있습니다.
    1. 흉부의 상단에 xyphoid 과정에서 피부를 잘라. 흉곽 아래 열기 복벽. 하부 흉곽을 잡고 겨드랑이에 다이어프램에서 왼쪽 중간 액와 선을 따라 길이 방향으로 갈비뼈와 근육을 잘라.
    2. 가로 평면에서 가위를 잡고 오른쪽 왼쪽에서주의 깊게 다이어프램을 잘라. 정점에 대한 손상을 방지하기 위해 심장의 수준 이하로 가위를 배치해야합니다.
    3. 흉곽을 잡고 오른쪽 중간 액와 선을 따라 오른쪽 갈비뼈의 측면과 근육을 잘라. 가위로 심장에 대한 모든 혈관 연결을 제거합니다. 잡고 흉강의 심장을 제거베이스.
  3. 제 수술 탄소 강철 면도날을 사용하여 세 가지로 마음. 봉합사 및 심장 정점 사이의 중간 점에서 마음의 짧은 축을 따라 첫 번째 컷을 확인합니다. 봉합사 (그림 3A)의 수준에서 두 번째 컷을 확인합니다.
    참고 :이 0.0018 g 무게 약 0.75 mm 두께의 정점 부분을 잎; 0.0065 g의 무게는 약 1mm 두께의 중앙베이스 부; 그리고 마음의 기초.
  4. 15 분 - 10 실온에서 1 % 2,3,5- 트리 페닐 클로라이드 (TTC)의 마음 섹션을 배치합니다. 조심스럽게 오버 얼룩을 방지하기 위해 표본을보세요.
  5. 밤새 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드와 스테인드 심장 조각, 대비를 증가 해결하려면. %의 경색 지역, 사진 심장 부분을 계산 및 이미징 소프트웨어에 경색 면적을 측정합니다. 경색 영역을 백색 (18)으로 경계가되는 동안 생존 심근 레드 얼룩.

5. 측정심 초음파 후 MI에 의한 심장 기능

  1. 48 시간 - 새끼가 (24)의 기간 동안 CD-1 수양 어머니의 보호에 복구 할 수 있습니다. 이소 플루 란 밀폐 챔버 (5 % 이소 플루 란)에서 강아지를 배치하여 마취를 유도한다. 이동 (약 30 초) 중단 될 때까지 실에서 마우스를 유지합니다.
  2. (마취 유지 보수) 1 % 이소 플루 란 - 0.5을 제공하는 콘에서 코와 가열 독 (온도 37 °에 C)에 앙와위에서 강아지를 고정합니다. 왼쪽 가슴 부위에 미리 예열 에코 젤을 배치합니다.
  3. 좌심실 (LV)의 흉골 긴 축보기를 얻습니다. 확인 이미지는 LV의 봉합사의 수준 이하로 얻어진다. 위치를 획득 한 후, 초음파 프로브 (40 MHz의) 90 °가 흉골 짧은 축보기를 얻기 위해, 기록 M 모드 심 초음파 이미지를 켭니다.
  4. 끝 확장기를 측정하고 짧은 축 M 모드 이미지에서 수축기 좌심실 내경을 종료. 구혈률과 fractio을 계산최종 단축.

6. 측정 심근의 경색 크기 24 시간 후 MI

  1. 새끼는 24 시간의 기간 동안 CD-1 수양 어머니의 보호에 복구 할 수 있습니다. 어머니와 함께 케이지에서 강아지를 제거하고 큰 가위로 잘린 다음에 이소 플루 란 과다 복용하여 안락사.
  2. 단계 4.2에서와 같이 흉강을 엽니 다. 심장을 절개하기 전에 신중하게 잘 집게로 다이어프램 위의 흉부 대동맥을 파악. 흉부 벽에 평면 관상면에서 미세 가위를 잡고 두개골 방향으로 가위를 움직이는 후방 흉부 벽 떨어져 흉부 대동맥을 잘라.
  3. 이 심장에 도달 할 때까지 흉부 벽과 다른 연결에서 무료로 대동맥을 잘라. 우수한 대정 맥을 잡고 몸에 다른 모든 혈관 연결을 절단하여 마음을 절제.
  4. 식염수에서 (첨부 대동맥과) 마음을 씻어. 조심스럽게 30 게이지 바늘과 흉부​​ 대동맥을 cannulate와 넥타이오르타는 8-0 나일론 봉합사 스레드와 캐 뉼러합니다.
  5. 1 ㎖ / 분의 속도로 30 게이지 바늘을 통해 대동맥을 통해 생리 식염수 1 ㎖로 심장을 관류. / 분 1 ML의 속도로 2 % 에반스 블루 용액 150 μL와 마음을 관류. 세 조각으로 부, 정맥에서 그것을 마음을 제거하고 4 절에 설명 된대로 TTC으로 얼룩.
  6. 경색 크기, 사진의 심장 부분을 계산 및 이미징 소프트웨어에 경색 면적을 측정합니다. 생존 심근 위험 얼룩의 면적이 적색, 청색 얼룩 및 경색 부분은 백색의 경계가된다.

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Representative Results

P1에서의 심근 경색 절차는 10에서 완료 할 수 있습니다 - 15 분 7.8 % (5 (64)의 밖으로 새끼)의 사망률이 있습니다. 수술 후, 마우스는 향후 5 내에서 저체온 마취에서 회복 - 20 분 (복구 시간은 체온 외과 의사의 마취 및 속도 동안 도달에 따라 다름). (비 - 재생성 심근과 비교) P7 새끼를 사용하는 경우, 냉각의 장기간이 무기력에 도달 할 필요가있다. P7 새끼는 훨씬 더 큰이며, 26.9 % (14 52 중 새끼)의 훨씬 더 높은 사망률의 결과로 심장 부상과 저체온증 모두 복구 많은 어려움이있다.

이전의 연구 결과는 19 일 (8 ° C ~ 15 ° C 사이)에 가까운 10 ° C에서 저체온 마취의 유도를 나타내는, 여기에서 확인된다. 이 온도 윈도우 내에서, 심박수, 느린 수행하지만 리듬은 24 BPM, 11 BPM 사이의 속도로 계속됩니다. 냉각이 레벨 낮은 심박수 크게 수술 출혈을 감소시킨다. 젊은이 쉽게 시각화하고이 온도 (그림 1)에서 결찰 할 수 있습니다. 몸의 온도가 2 BPM 또는 무 수축으로 심장 박동수의 저하의 원인, 9.6 ° C 4.9 ° C 사이에 도달 할 때까지 LAD는 계속 표시됩니다.

P1에서 LAD 결찰 한 후, 새끼 완전히 복구하고 한배의 새끼 컨트롤에 필적 몸 크기로 성장한다. 일단 자신의 수양 어머니와 함께 다시 배치, 새끼는 약 10 분의 한배 새끼에 필적 인식과 공급 능력을 회복. 조직 학적 검사 삼일 후 MI시, 염증 세포, 전형적인 포스트 경색 응답 (그림 2) 침투로, 경색의 증거가있다. 7 일 후 MI에서 좌심실 조직은 정상이 나타납니다. 21 일 후 MI함으로써, 완전한 Cardiac 재생가 발생했습니다.

(4) 염색 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) - 6 시간 후 MI는 MI의 일관된 유도 확인을 사용한다. 빨간색 영역은 실행 가능한 심근를 나타내고, 흰색 영역은 허혈성 죽은 조직을 나타냅니다. 13 LAD의 결찰 수술의 총, 마음의 100 %가 36 % (그림 3)의 평균 경색 크기, 경색이었다. 에반스 블루 관류와 TTC 염색도 위험 지역에 따라 경색 크기 (그림 4) 경색 조직의 지속성을 입증하고 측정 24 시간 후 MI에서 수행 하였다. 이러한 마음에서 생존 심근은 빨간색 위험 얼룩의 영역을 파란색 얼룩 및 경색 영역은 흰색으로 경계가된다. 경색 크기는 위험 영역의 백분율로 계산 하였다. 4 LAD의 결찰 수술에서, 마음의 100 %가 위험 지역의 49 %의 평균 경색 크기 (그림 4)와, 경색이었다.

<유지-together.within 페이지 = "1"> 경색 유도, 심장 초음파 검사는 24, 48 시간 후 MI에서 수행 된 확인하려면 : FO P 클래스 = "jove_content". 24 시간 후 MI에서 구출 률 (EF)는 크게 74 %에 84 %로 감소하고, 소수 단축 (FS)는 크게 40 % (그림 5)에 50 %로 감소. 컨트롤에 비해 80 % 및 대조군의 50 %와 비교하여 FS는 25 %로 현저하게 감소되었을 때 48 시간 후 MI함으로써 EF는 또한, 46 %까지 감소시켰다. 또한, 48 시간 (그림 6)에서 수축기 좌심실 내경의 상당한 감소가 있었다. LV 전벽 두께 중 24 또는 48 시간 포스트 MI에서 크게 저하하지 않았다 (도 5 및도 6).

그림 1
그림 1. 관상 동맥는 신생아 LAD 절차. P1 신생아 마우스 AF 동안 볼 수 있습니다관상 동맥 (LAD 내림차순 전방 왼쪽 네 번째 늑간. A))에 터 저체온 마취, 피부 절개, 근육 절개 및 측면 개흉술 볼 수 있습니다. BD) 11-0 나일론 봉합사는 LAD 결찰입니다 중반 뇌실. E) 통과 각각 봉합 사이트. F)G) (A)의 배율입니다)E) 이하로 관찰 창백. OCC. LAD는, 폐색 좌전는 동맥을 내림차순. LA는 심방을 떠났습니다. LV, 심실을 떠났습니다. GCV, 좋은 관상 동맥 정맥. 흰색 화살표, LAD. 검은 색 화살표 머리, 조명의 눈부심. 스케일 바 1mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
전체 CARDI 그림 2. 증거신생아 마우스의 LAD 결찰 후 교류 재생. P1 마우스의 LAD 결찰 후 메이슨의 트리 크롬 염색. 경색 영역에서 항목의 마음과 배율은 LAD의 결찰 후 3 일, 7, 21에 표시됩니다. 3 일 후 MI (흰색 화살표)에서 경색 영역에 침투 심근 손실 및 염증 세포를합니다. 7 일 후 MI에서 시작하여 전체 경색 영역 재생. 섬유증의 증거는 거의 21 일 후 MI에서 지적했다. 스케일 바는 200, 100, 40X 50 μm의이며, 200X 및 630X 배율, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 신생아 LAD 내고 100 % 재현이다. A) 0.75 mm 정점 조각을 만들기 위해 온 마음의 절편의 라인과 TTC에 대한 1 mm 중반 기본 조각염색. B) TTC 염색 가짜 제어 및 LAD 결찰 마음의 대표 이미지. 스케일 바는 1mm이다. P1 신생아 마우스에서 13 LAD의 결찰에 C) 경색 크기. 6 시간 후 MI 및 TTC 염색 후 측정 경색 크기 - 하트 사를 모았다. 레드 가능한 심근을 나타냅니다; 화이트 괴사를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 신생아 LAD 내고는 신뢰성 경색에 결과. P1 신생아 쥐 LAD 결찰 후 허혈 영역의 %로서 A) 경색 크기 (N = 4). 마음은 24 시간 후 MI를 수집하고 경색 크기는 에반스 블루와 TTC 염색 후 측정 하였다. 블루 생존 심근을 나타냅니다; 빨간색은 위험 지역을 나타냅니다; 흰색은 N을 표시ecrosis. 데이터는 평균 ± SEM 있습니다. B) LAD의 결찰 후 에반스 블루와 TTC 염색 LAD 결찰 마음의 대표 이미지. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
24 시간에 심장 부전 그림 5. 신생아 LAD 내고 결과는 포스트 MI. 심장 기능은 모두 가짜 운영 및 LAD 결찰 마우스에 대한 심 초음파. A) 대표 M 모드 이미지에 의해 평가되었다. 최종 이완기 및 최종 수축기는 화살표로 표시됩니다. B) 이완기 및 수축기 모두에서 분수 단축, 구혈률, 좌심실 내경의 측정. 데이터는 ± SEM 평균입니다. N = 가짜 각각 관상 동맥 결찰 (CAL) 8 7. * P <0. 05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
48 시간 후 MI에서 심장 부전 그림 6. 신생아 LAD 내고 결과. 심장 기능은 심 초음파. A)에 의해 평가 된 대표적인 M-모드를 모두 가짜에 대한 최종 이완기 (긴 화살표) 및 최종 수축기 (짧은 화살표)를 보여주는 이미지 운영 및 이완기 및 수축기 모두에서 분수 단축, 구혈률, 좌심실 내경을 포함한 심장 초음파 검사에 의해 LAD 결찰 마우스. B) 심장 기능을 측정. 데이터는 ± SEM 평균입니다. N = 각각 가짜 및 관상 동맥 결찰 (CAL), 4, 6. * P <0.05, ** P <0.01.대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 보여 수술 LAD 결찰 신생아 쥐에서 MI를 생산하는 신뢰할 수있는 방법이다. 이 모델은 포유류의 심장 재생을 연구하는있는 재현 모델과 연구자를 제공합니다. 관상 혈관의 시각화는 정확한 봉합 배치를 보장하고, 따라서 재현성을 보장하는이 방법의 핵심 구성 요소입니다. 성인 쥐 poikilothermic 기능을 갖고 있지 않지만, 체온 신생아 마우스 대사율 밀접 주위 온도와 관련된다. 또한, 신생아 쥐의 작은 크기는 표면 냉각에 의한 저체온 유도에 이상적이다. 수술 마우스 체온의 타이밍은이 절차를 복제 정확성에 매우 중요하며, 따라서주의 깊게 모니터링되어야한다. 결찰은 가능한 한 빨리 무기력에 도달 한 후 수술 성공을 확인, 심근 후 결찰의 창백 시각화 할 수있는 기회를 제공합니다.

무있다MI 유도을 확인하는 데 사용할 수 있습니다 ltiple 방법. 다음은 TTC 염색, 심장 초음파 검사 및 조직 학적 분석을 포함한다. TTC 염색, 재현성 및 신뢰성, 쉽게 높은 처리량을 수행 낮은 비용이다. 이러한 이유로, TTC 염색법 널리 사용되고있다. 심장 초음파 검사는 시간이 지남에 심장 기능 포스트 MI 비 침습적 모니터 변경에 사용할 수 있습니다. MI의 확실한 증거는 조직 학적 분석을 통해 입증 할 수있다. 본 연구에서, 상기 기술 된 모든 세 MI의 성공적인 도입을 확인하기 위해 사용 하였다.

LAD의 시각화에 성공 MI 유도에 매우 중요합니다. 연구자가 어려움 (깊은 저체온증 유도에 가능성으로 인해)에 LAD를 시각화가 발생하는 경우 LAD의 주요 루트가 더 먼 세그먼트보다 크고보다 쉽게​​ 볼 수있는 바와 같이, 왼쪽 귓바퀴는 집게로 약간 상승 할 수있다. LAD가 가시화 할 수없는 경우, 연구자는 동맥 보라를 가정하지 말아야양이온. 이 강아지는 실험 결찰에 사용하지 말아야하고, 가짜 제어 운영으로 대신 사용할 수 있습니다.

4 번째 늑간 공간에서 흉강에 올바른 항목은 LAD의 결찰에 대한 최적의 시각화 및 공간을 확보하는 것이 중요하다. 이것은 늑간 공간주의 계산을 통해 얻어 질 수있다. 출혈 소량의 과정 중에 발생하는 경우 또한, 그것은 멸균 거즈에 의해 제거 될 수있다. 출혈이 중요한 경우, 그러나, 외과 가능성 충분히 절차를 시작하기 전에 마우스를 냉각하지 않은, 또한 냉각이 요구된다. 냉각의 정도가 조심스럽게 관상 동맥을 시각화하기 위해 20 BPM에 심장 박동을 보장하기 위해 통제되어야 있습니다.

인해 신생 생쥐의 작은 크기로 고해상도 초음파 검사는 심장 기능 분석을위한 명확한 M 모드 영상을 얻기 위해 요구된다. 최상의 결과를 얻으에서 심장 박동을 확인가벼운 마취 약 400 BPM (0.5-1 %의 이소 플루 란 흡입) 정상 체온 유지 (가열 독과 에코 젤을 따뜻하게). 몸이 오른쪽 어깨쪽으로 약간 기울어 진 경우 이미지가 가장 취득 (~ 5 ° 두개쪽으로 5 ° 우측). 충분한 에코 겔을 보장하는 소음을 최소화하기 위해 적용된다.

이 방법은 100 % 재현성을 제공하지 않지만, 경색의 크기는 개별 신생아 해부학 분파 관상 동맥 (도 3)에 따라 다소 변할 수있다. 그 결과, 높은 N 번호는 다른 치료제 또는 심장 재생에 유전자 조작의 효과를 결정하는 통계적 유의성에 도달해야한다. 그러나,이 방법은 MI에서 완전히 다를 수 있습니다 부상의 이러한 메커니즘의 병태 생리 등 모두 신생아 정점 절제술 및 cryoinjury을 통해 주요 장점을 보유하고 있으며, 따라서 정확하게 다시하지 않을 수 있습니다본 인간 MI 8,20. 이러한 접근 방법은 더 직접적으로 전형적인 인체를 모방 한 포유류 MI의 설정에서 심장 재생을 연구하는데 사용될 수있다.

그것은 비 - 재생성 어른 사이 심장 손상으로부터 회복 메카니즘의 차이에 대한 연구를 허용하고 회생 (신생아) 포유류 심근으로이 모델은 독특하다. 예를 들어, 영구적 인 흉터 형성에 성인 마우스 MI 모델 결과. 심실 파열은 종종 경색 팽창의 결과로서 발생한다. 이 모델 (> 100 수술, 게시되지 않은 데이터)와 우리의 경험에 의하면, 전체 재생은 이십일일 후 경색과 심실 파열이 관찰되지 않았다 분명하다. 이 모델의 사용에서 발생한 정보는 성인의 심장 재생을 촉진 할 수있다 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

최근의 증거는 심근 증식이 심장 재생 9에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 나타냅니다 4,21의 중요 규제로 확인되었다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 추가 연구는 심장 재생 후 MI의 유도에 대한 치료 목표를 가리 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-0 Nylon Suture Microsurgery Instruments 8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd H1101
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09
Small forceps Fine Science Tools 11063-07
Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope Zeiss 300002
Isoflurane Baxter CA2L9100
Isoflurane Chamber Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) Sigma T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 Zeiss 435400
AxioVision 8.0 Zeiss
Axiocam Icc5 Zeiss 426554
Heat pad Sunbeam  731A0-CN
Sterile Gloves VWR 414004-430
Gauze Sponges Ducare 90212
Ice
Ultrasound imaging system, Vevo2100 Visual Sonics VEVO2100
Ultrasound transducer, 40 MHz Visual Sonics MS400

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References

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