Myokardinfarkts bei neugeborenen Mäusen, ein Modell von Cardiac Regeneration

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Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. J. Vis. Exp. (111), e54100, doi:10.3791/54100 (2016).

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Abstract

Myokardinfarkt durch Koronararterie induziert Ligierung wurde in vielen Tiermodellen als Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen der Herzwiederherstellung und Regeneration verwendet werden, und neue Ziele für Therapeutika zu definieren. Seit Jahrzehnten Modelle von kompletten Herzregeneration gab es in Amphibien und Fische, sondern ein Säugetier-Gegenstück war nicht verfügbar. Die jüngste Entdeckung eines postnatalen Fenster, während der Mäuse regenerative Fähigkeiten besitzen hat zur Einrichtung eines Säugetiermodell des Herzregeneration geführt. Ein chirurgisches Modell von Säugerherzregeneration in der Neugeborenen-Maus wird hier vorgestellt. Kurz gesagt, werden postnatalen Tag 1 (P1) Mäuse auf einem Eis-Pad von Isofluran und platziert narkotisiert Hypothermie zu induzieren. Nachdem die Brust geöffnet wird, und die linke vordere Koronararterie (LAD) abwärts visualisiert wird, wird eine Naht um die LAD zu platziert myokardiale Ischämie im linken Ventrikel zuzufügen. Der chirurgische Eingriff dauert 10-15 Minuten. Visualisierung der Koronararterievon entscheidender Bedeutung für die genaue Nahtplatzierung und Reproduzierbarkeit. Herzinfarkt und Herzfunktionsstörungen werden durch Triphenyl-Tetrazolium Chlorid (TTC) Färbung und Echokardiographie bzw. bestätigt. Vollständige Regeneration 21 Tage nach Myokardinfarkt durch Histologie bestätigt. Dieses Protokoll kann als ein Werkzeug verwendet werden Mechanismen von Säugerherzregeneration nach Myokardinfarkt aufzuklären.

Introduction

Myokardinfarkt (MI) ist eine führende Todesursache weltweit und bleibt für etwa ein Drittel der Herzinsuffizienz Fälle verantwortlich 1. Während das Aufkommen der perkutanen Interventionen und kontinuierliche Optimierung der Verwendung von Thrombolytika tritt dennoch Reperfusion folgenden MI, cardiomyocyte Tod und Verlust kontraktiler Myokard erhöht. Es bleiben auch eine große Anzahl von "no-Option" Patienten, die keine Kandidaten für eine mehr oder nicht sehen, profitieren von diesen Maßnahmen. Diese Patienten weiterhin zu deaktivieren Ischämie zu erleben führende Bildung Narbe und schädlichen ventrikuläre Remodeling als Mechanismus der Infarktheilung. Dieser Prozess führt schließlich zu Herzversagen, für die Prognose trotz optimaler pharmakologischer Management mit Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) Hemmer und Betablocker schlecht bleibt. Leider bleibt die Ein-Jahres-Sterblichkeit bei Patienten mit stark eingeschränkter linksventrikulärer Funktion noch alshoch wie 26% 2. Herztransplantation ist die letzte Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit Herzinsuffizienz. Allerdings ist der begrenzten Spender für eine Herztransplantation nicht für die meisten Patienten dies ein gangbarer Weg zu machen. Somit bleibt die Entdeckung neuer therapeutischer Mittel, die beschädigte Myokards zur Wiederherstellung von größter Bedeutung für die Herzkrankheit Problem zu lösen. Reliable Tiermodellen von Herzschäden werden daher als wichtige Komponente dieses Verfahrens erforderlich.

Traditionelle Dogma hat diktiert , dass adulte Kardiomyozyten sind post-mitotische, terminal differenzierte Zellen, unfähig , Dividieren oder De-Differenzierung des geschädigten Myokard 3 zu ersetzen. Als solche könnte ein erwachsener Säugetiere Herz nie vollständig von der Verletzung erholen und verloren Kardiomyozyten würde mit Fasergewebe ersetzt werden. So hat sich die Forschung konzentriert sich in erster Linie auf therapeutische Mittel Infarktausdehnung zu minimieren und die Narbenbildung zu verringern. vor kurzem jedoch mehr ist, hat ein Paradigmenwechsel stattgefundenHerzheilung und viele Forschungsanstrengungen im Denken umgebenden wurden auf das Potenzial für die Herzregeneration 4 zu konzentrieren umgeleitet.

Bis vor kurzem in vivo - Untersuchung von Herzregeneration wurde auf nicht-Vertebraten - Modelle beschränkt, wie sie in urodele Amphibien und Knochenfischen 5-7. Allerdings hat die Entdeckung der Fähigkeit für die Herzregeneration in der neonatalen Maus zur Entwicklung von zwei chirurgischen Modelle von Säugerherzregeneration führte: Resektion der Herzspitze und der koronaren Arterienverschluss zu Myokardinfarkt 8,9 induzieren. Im Jahr 2011 wurde eine Maus Spitze Resektion Modell, dass eine vollständige Herzregeneration möglich am postnatalen Tag 1 (P1) zu zeigen, verwendet. Allerdings sinkt diese Kapazität schnell nach der ersten Neugeborenenperiode. Das Säugetier-Herz seine regenerative Potenzial verliert kurz nach der Geburt bei P7 als Vorläuferzellzahlen sinken, und Kardiomyozyten binukleäre geworden, verlierenihre proliferative Kompetenz und permanent in den Zellzyklus 10,11 verlassen. die grundlegenden Unterschiede zwischen dem Neugeborenen und Erwachsenen Säugetier-Herz Verstehen können neue Einblicke in die Herzregeneration führen.

Während in der Tat Spitze Resektion Einblick in erneute Wachstum von kontraktilen Gewebe bietet, so gilt das Modell nicht typisch menschliche Herzschädigung, zu simulieren und somit nicht selbst auf die Entwicklung von Therapeutika als auch nicht verleihen. Die Koronararterienokklusion Modell simuliert jedoch mehr direkt die pathophysiologischen Aspekte der MI Pathologie, und somit nützliche Einblicke in Mechanismen bereitzustellen, die zur Anwendung beim Menschen zu therapeutischen Fortschritt anwendbar sein können.

Chirurgische Koronarligatur wurde als nützliche experimentelle Technik in vielen Tiermodellen 12-14 verwendet. Im Erwachsenen-Modell Koronararterienligatur werden die Tiere narkotisiert und intubiert Öffnung der Brusthöhle zu ermöglichen, während respirati Aufrechterhaltungauf. Das Herz weiterhin regelmäßig zu schlagen, ermöglicht die Visualisierung der Koronargefäße und die die präzise Nahtplatzierung. Darüber hinaus bleibt das Herz rosa als Perfusion weiter, und nach Ligatur der Myokard erscheint blass, was auf erfolgreiche Koronararterienligatur. Das Protokoll für neonatale Mäuse beschrieben, ist jedoch weniger zuverlässig als die Koronararterie nicht sichtbar gemacht wird , und der Chirurg muss schätzen , wo die Naht 15 zu platzieren. Obwohl die allgemeine Anatomie des koronaren Vaskulatur ist die gleiche, einzelne Tier - Variabilität in der Richtung und der Verzweigung der LAD 16 existiert. Wenn also "in erblinden", die Arterie leicht übersehen werden konnte. Andere Techniken wie Echokardiographie werden dann erforderlich erfolgreiche Induktion von MI zu bestätigen, und alle Operationen in ähnlicher Infarktgröße führen zu gewährleisten. Beschrieben wird hier eine Verbesserung gegenüber einer kürzlich veröffentlichten Verfahren 15, wo die Position der LAD Estab werden kannfentlicht und damit LAD kann reproduzierbar ligiert werden, um MI induzieren.

Diese Technik erfordert keine Intubation oder mechanische Beatmung, wie Thorakotomie in einem hypothermischen Zustand in der Neugeborenen-Maus nicht zu einer Lungenkollaps. Jedoch in dem zuvor beschriebenen Verfahren, schwere Hypothermie muss bis zu dem Punkt sowohl vollständige Apnoe und Aufhören des Herzrhythmus 15 induziert werden. Die wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Koronararterie nicht perfundierten länger und das Herz wird blaß noch bevor LAD Ligation. In dem beschriebenen Ansatz hier ist Koronararterie Visualisierung möglich an einem Punkt der Erstarrung vor tiefer Hypothermie und Herzrhythmus Aufhören mit voller Erholung der Neugeborenen Maus nach der Operation. Dieses Verfahren bietet einen großen Vorteil von 100% Reproduzierbarkeit.

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Protocol

Brutpaare von C57BL / 6 und CD-1-IG-S-Mäuse wurden von Charles River erworben. Tiere in dieser Studie verwendet wurden, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care behandelt und Studienprotokolle wurden durch den Einsatz von Tieren Subcommittee an der Western University, London, Kanada zugelassen.

1. Animal Care

  1. Nach Geburt abgeschlossen ist und Welpen haben für ein paar Stunden von ihrer Mutter zunächst gestillten gewesen, legen Sie sie in einem anderen Käfig mit einem CD-1-Pflegemutter. CD-1 Mütter zeigen eine ruhigere Phänotyp mit einer starken Förderung Instinkt, und haben eine geringere Neigung 15 verletzten Jungen zu kannibalisieren.

2. Chirurgie

  1. Induce Anästhesie durch den Welpen in einem verschlossenen Isofluran Kammer platzieren (ca. 500 ul 100% v / v Isofluran erlaubt mehr als 1.300 cm 3 Kammer abzuführen). Halten Sie die Maus in die Kammer, bis Beendigung der Bewegung (ca. 30 sec).
  2. entfernen Sie moVerwenden von Isofluran Kammer und induzieren hypothermic Anästhesie mit der Maus auf nassem Eis legen. Erfrierungen, legen Sie Eis in einem sterilen OP-Handschuh, wickeln Sie die Maus im Handschuh und decken den Handschuh mit Eis oder wickeln Sie die Maus in sterilen nassen Gaze und legen Sie es auf Eis zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Mäuse kühlen schneller, wenn sie Kontakt mit Eis über eine größere Fläche ist, und als solche geschmolzene Eis kann Hypothermie Induktionszeit zu verkürzen.
  3. Bestätigen Anästhesie durch den Mangel an Bewegung als Reaktion auf Zehen und Schwanz kneifen.
    HINWEIS: Die Einstellung der provozierten Bewegung tritt bei einer Körpertemperatur von 15 ° C und 8 ° C. (Kühlzeit auf dieser Temperatur ca. 1 min). Komplette Apnoe und Asystolie ist NICHT für LAD - Ligation erforderlich.
  4. Bewegen Sie das Eis Bett auf den OP-Bereich mit einem Operationsmikroskop ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass die Maus Welpen während des gesamten chirurgischen Eingriffs auf Eis bleibt.
    HINWEIS: Der OP-Bereich, Gaze und chirurgische Instrumente sollten sterilisiert werden. maintain sterilen Bereich während des gesamten Verfahrens und den einmaligen Gebrauch, sterile OP-Handschuhe tragen. Augensalbe ist nicht erforderlich , da Mäuse geboren sind mit ihren Augen 17 geschlossen.
  5. Platzieren Sie die Maus pup in der rechten Seitenlage. Desinfizieren Brust vorsichtig mit Povidon-Jod-Lösung durch eine Ethanol Tupfer gefolgt abwischen.
  6. Führen Hautschnitt auf der linken Brust entlang der mittleren Axillarlinie durch die Haut zwischen dem Xyphoid und linken Achselhöhle ein paar Millimeter unterhalb des linken Vorderbeins zu schneiden. mit einer Schere auch durch die darunter liegenden Brustmuskel Schicht zu schneiden.
  7. Führen Sie eine Linksthorakotomie im 4. ICR durch Rippen und Intercostalmuskeln mit einer Pinzette zu trennen.
    HINWEIS: Neonatal Rippen sehr zerbrechlich sind und leicht gebrochen werden können. dies, sanft getrennte Rippen zu vermeiden, durch die Zange entlang der intercostal Muskel (anstatt Greifen Rippen) zu öffnen.
  8. Visualisieren Sie die linke vordere absteigende Koronararterie (LAD), die aus dem linken aurICLE hinter der Lungenvene und jenseits der großen Herzvene absteigt.
    HINWEIS: In dieser frühen neonatalen Fenster wird der Thymus oft sichtbar gemacht und kann ein Teil des Herzbasis abdecken. Die LAD kann neben der Position des Thymus gesehen abzuzeichnen, abhängig von dem Winkel der thorakalen Inzision.
  9. Ligieren der LAD durch einen 11-0 Nylonfaden vorbei (0,007 mm Durchmesser Nadel) unter der Arterie durch die Mitte Ventrikel unterhalb des linken Vorhofs (Abbildung 1C). Ischemia mit blanchiert des Myokards unter der Naht Stelle (1G) bestätigt.
  10. Schließen Sie die Brust-Schnitt mit 8-0 Nylonnaht (0,15 mm Durchmesser Nadel). Verwenden Sie zwei Fäden, die Rippen zu schließen. Zeigen beide Rippennähte vor Ligieren der Nadel, um sicherzustellen, nicht in die Lungen durchstechen, wenn sie durch die Körperhöhle verläuft.
  11. Nachdem die Rippen zu schließen, die Maus aus dem Eis Bett zu entfernen. Halten Sie die Maus im OP-Bereich und legen Sie sie direkt auf dem sterilen OP zuwel über einen warmen Heizkissen bei 37 ° C Erwärmung zu beginnen.
  12. Einmal auf dem sterilen beheizten Fläche, schließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit 8-0 Nylonnaht (0,15 mm Durchmesser Nadel). Verwenden Sie eine Naht für die Muskelschicht und mit zwei Fäden für die Hautschnitt.
    HINWEIS: Muskel- und Hautschichten können auf einem Heizkissen geschlossen Hypothermie Belichtungszeit zu verringern. Maus Temperatur beginnt auf dem Heizkissen einmal platziert zu steigen, bleibt aber genug für die Anästhesie Wartung während der Muskel und Hautverschluss ausreichend niedrig.

3. Chirurgische Erholung

  1. Weiter schnelle Erwärmung an einem warmen Heizkissen bis zur Rückkehr der spontanen Bewegung. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Entfernen PVP-Jod und Blut durch vorsichtiges Verletzungsstelle mit Ethanol Tupfer abwischen.
  2. Nach ausreichender Erholung aus der Narkose, entfernen Sie es aus sterilen OP-Bereich, schmiert es mit Bettwäsche von PflegeMutter Käfig und Rückkehr Welpen zu fördern Mutter. Dies hilft mütterlichen Ablehnung oder Kannibalisierung verhindern.
    Hinweis: Schließen Sie an einen Käfig mit anderen Tieren nicht Welpen zurück, bis vollständig erholt. Wenn eine ganze Wurf nicht benutzt worden ist, und littermates bleiben mit Pflegemutter, legen Sie erholt Welpen in der Mitte des Wurfes. Wenn mehr als eine Operation durchgeführt wird, füllen Sie alle für einen einzelnen Wurf erforderlich Operationen vor Mäusen, um ihre Pflegemutter zurückkehrt.
  3. Beobachten Sie das Verhalten der Pflegemutter in Richtung der Welpe jede 10 bis 15 Minuten für 2 - 3 Stunden Akzeptanz des Welpen zu gewährleisten. Wenn die Mutter Aggression gegenüber den verletzten Welpen zeigt, entfernen Sie den Welpen und einschläfern von Isofluran Überdosierung (> 5%, bis Atemstillstand), durch Enthauptung gefolgt. HINWEIS: Perioperative Analgesie Medikamente sind nicht als die zentrale Schmerzreflexe erforderlich sind , nicht vollständig 15 in diesem frühen Alter entwickelt.

4. Messung der myokardialen Infarktgröße 4 -6 Stunden Post-MI

  1. Lassen Sie Welpen in der Obhut eines CD-1-Pflegemutter für einen Zeitraum von 4 zu erholen - 6 Stunden. Entfernen Sie den Welpen aus Käfig mit Mutter und einschläfern es von Isofluran Überdosis, gefolgt von Enthauptung mit großen Schere.
  2. Excise das Herz unter Binokular, vorsichtig, nicht das Myokard zu rippen.
    1. Schneiden Sie die Haut vom Xyphoid Prozess an die Spitze des Thorax. Offene Bauchwand unterhalb des Brustkorbs. Fassen Sie den unteren Brustkorb und schneiden durch die Rippen und die Muskulatur in Längsrichtung entlang der linken mittleren Axillarlinie von der Membran auf der Achselhöhle.
    2. Halten einer Schere in der Querebene und sorgfältig durch Membran geschnitten von der rechten Seite nach links zu. Stellen Sie sicher, Schere unter dem Niveau des Herzens anzuordnen, um eine Beschädigung der Spitze zu vermeiden.
    3. Fassen Brustkorb und schnitt rechten Seite der Rippen und der Muskulatur entlang der rechten mittleren Axillarlinie. Entfernen Sie alle Gefäßverbindungen in das Herz mit einer Schere. Entfernen Sie das Herz aus der Brust Hohlraum durch Ergreifendie Basis.
  3. Abschnitt das Herz in drei Teile, ein chirurgisches Kohlenstoffstahl Rasierklinge. Bilden den ersten Schnitt entlang der kurzen Achse des Herzens in der Mitte zwischen der Naht und der Herzspitze. Machen Sie den zweiten Schnitt auf der Ebene der Naht (3A).
    HINWEIS: Dies lässt einen Scheitelschnitt etwa 0,75 mm dick mit einem Gewicht von 0,0018 g; ein mittelBasisSchnitt etwa 1 mm dick, mit einem Gewicht von 0,0065 g; und die Basis des Herzens.
  4. Platzieren Sie die Herzschnitte in 1% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei Raumtemperatur für 10 bis 15 min. Sorgfältig Probe beobachten Überfärbung zu vermeiden.
  5. Zur Erhöhung der Kontrast, fix gefärbten Herzscheiben mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Um% Infarktbereich, Fotografie Herzschnitte berechnen und Infarktbereich auf Bildbearbeitungssoftware messen. Die vitales Myokard färbt rot , während der Infarktbereich als weiße 18 abgegrenzt ist.

5. Messung derHerzfunktion durch Echokardiographie Post-MI

  1. Lassen Sie Welpen in der Obhut eines CD-1-Pflegemutter für einen Zeitraum von 24 zu erholen - 48 Stunden. Induce Anästhesie durch den Welpen in einem verschlossenen Isofluran Kammer platzieren (5% Isofluran). Halten Sie die Maus in die Kammer, bis Beendigung der Bewegung (ca. 30 sec).
  2. Sichern Sie den Welpen in der Rückenlage auf einer beheizten Dock (Temperatur 37 ° C) mit der Nase in einem Kegel 0,5 zu liefern - 1% Isofluran (für Anästhesie Wartung). Legen Sie vorgewärmte Echo Gel auf der linken Thoraxbereich.
  3. Besorgen Sie sich eine parasternal Langachsenansicht des linken Ventrikels (LV). Sicherzustellen, werden die Bilder unter der Höhe der Naht in der LV erhalten. Nach der Position zu erwerben, schalten Sie die Ultraschallsonde (40 MHz) um 90 ° eine parasternal Kurzachsen Ansehen und Aufnehmen von M-Mode-Echokardiographie Bilder zu erhalten.
  4. Messen Sie die Ende diastolischen und systolischen Ende der linksventrikulären Innendurchmesser der kurzen Achse M-Modus-Bilder. Berechnen Ejektionsfraktion und fractional Verkürzung.

6. Messung der myokardialen Infarktgröße 24 h Post-MI

  1. Lassen Sie Welpen in der Obhut eines CD-1-Pflegemutter für einen Zeitraum von 24 Stunden zu erholen. Entfernen Sie den Welpen aus Käfig mit Mutter und einschläfern es von Isofluran Überdosis, gefolgt von Enthauptung mit großen Schere.
  2. Öffnen Sie die Brusthöhle, wie in Schritt 4.2. Bevor das Herz herausgeschnitten, fassen Sie vorsichtig die Brustaorta knapp über der Membran mit einer feinen Pinzette. Halten einer feinen Schere in der koronalen Ebene, flach an der Brustwand, und schneiden Sie die Brustaorta von der hinteren Brustwand Schere in der Schädel Richtung bewegt.
  3. Schneiden Sie die Aorta frei von der Brustwand und alle anderen Verbindungen, bis es das Herz erreicht. Excise das Herz durch die obere Hohlvene Greifen und alle anderen Gefäßverbindungen auf den Körper zu schneiden.
  4. Spülen Sie das Herz (mit Aorta angebracht) in Kochsalzlösung. kanülieren vorsichtig die Brustaorta mit einer 30-Gauge-Nadel und eine Krawatteorta zu Kanüle mit 8-0 Nylon Nähfaden.
  5. Perfundieren das Herz mit 1 ml Kochsalzlösung durch die Aorta über eine 30-Gauge-Nadel mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min. Perfundieren das Herz mit 150 ul 2% Evans-Blau-Lösung mit einer Rate von 1 ml / min. Entfernen Sie das Herz aus der Kanüle, Abschnitt es in drei Stücke und färben sie mit TTC, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
  6. Um die Infarktgröße, Fotografie Herz Abschnitte und messen Infarktbereich auf Imaging-Software berechnen. Die vitales Myokard Flecken blau, das Gebiet gefährdet Flecken rot und der Infarktbereich ist als weiß abgegrenzt.

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Representative Results

Der Myokardinfarkt Verfahren bei P1 in 10 abgeschlossen sein - 15 min und hat eine Mortalitätsrate von 7,8% (5 von 64 Welpen). Nach der Operation, Mäuse von hypothermen Anästhesie innerhalb der nächsten 5 erholen - 20 min (Zeit der Erholung hängt von der Körpertemperatur während der Anästhesie und die Geschwindigkeit des Chirurgen erreicht). Wenn P7 Welpen (zum Vergleich mit einer nicht-regenerativen Myokard), wird eine längere Kühlung erforderlich Torpor zu erreichen. P7 Welpen sind viel größer und mehr Schwierigkeiten haben, sowohl von Herzschädigung und Hypothermie erholt, was zu einer deutlich höheren Mortalitätsrate von 26,9% (14 von 52 Welpen).

Ergebnisse aus früheren Studien werden hier bestätigt, bei knapp 10 ° C (zwischen 8 ° C und 15 ° C) 19 Induktion von Hypothermie Anästhesie anzeigt. Innerhalb dieses Temperaturfenster, tut Herzfrequenz langsam,aber Rhythmus weiter mit Raten zwischen 24 bpm und 11 bpm. Die niedrige Herzfrequenz auf dieser Ebene der Kühlung deutlich reduziert intraoperative Blutungen. Die LAD kann leicht bei diesen Temperaturen (Figur 1) sichtbar gemacht und ligiert werden. Die LAD bleibt sichtbar , bis Körpertemperaturen zwischen 9,6 ° C und 4,9 ° C erreichen, was Senkung der Herzfrequenz auf 2 bpm oder Asystolie.

Nach LAD Ligation bei P1, erholen Welpen vollständig und dass zu einer Körpergröße wachsen vergleichbar von littermate Kontrollen. Einmal mit ihrer Pflegemutter gelegt zurück, wieder Welpen Bewusstsein und Fütterung Fähigkeiten vergleichbar mit littermates in ca. 10 min. Bei der histologischen Untersuchung 3 Tage post-MI, gibt es Anzeichen für Infarkt, mit Entzündungszellen infiltriert, eine typische Postinfarkt Antwort (Abbildung 2). Am Tag 7 post-MI, erscheint die linksventrikuläre Gewebe normal. Am Tag 21 post-MI, komplette cardiac Regeneration stattgefunden hat.

2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Anfärben 4 - 6 Stunden nach der MI wurde als Bestätigung der konsequenten Induktion von MI verwendet. Der rote Bereich stellt vitales Myokard und der weiße Bereich repräsentiert ischämischen abgestorbenem Gewebe. In insgesamt 13 LAD Ligierung Operationen, 100% der infarzierten Herzen waren, mit einer mittleren Infarktgröße von 36% (Abbildung 3). TTC - Färbung mit Evans - Blau - Perfusion wurde auch bei 24 Stunden nach der MI durchgeführt Persistenz von Infarktgewebe zu demonstrieren und die Infarktgröße auf Risikobereich (Abbildung 4) auf der Basis messen. In diesen Herzen, Flecken vitales Myokard blau, das gefährdete Gebiet Flecken rot und der Infarktbereich ist als weiß abgegrenzt. Infarktgröße wurde als Prozent der Risikobereich berechnet. In 4 LAD Ligierung Operationen, 100% der infarzierten Herzen waren, mit einer mittleren Infarktgröße von 49% des Risikobereichs (Abbildung 4).

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Infarktinduktion zu bestätigen, Echokardiographie bei 24 und 48 Stunden nach der MI durchgeführt wurde. Bei 24 Stunden post-MI, Ejektionsfraktion (EF) wurde von 84% auf 74% signifikant reduziert und fractional shortening (FS) signifikant reduziert von 50% bis 40% (Abbildung 5). Nach 48 h post-MI wurde EF weiter auf 46% reduziert, wie in der Kontrollgruppe auf 80% verglichen und FS wurde ebenfalls signifikant auf 25% verringert, wie in der Kontrollgruppe auf 50% verglichen. Darüber hinaus gab es eine signifikante Reduktion der systolischen linksventrikulären Innendurchmesser bei 48 h (Figur 6). LV vordere Wandstärke verringert entweder 24 oder 48 Stunden nach der MI nicht signifikant war (5 und 6).

Abbildung 1
Abbildung 1. Coronary Artery sichtbar Während Neonatal LAD Prozedur. P1 neonatalen Maus after hypothermic Anästhesie, Hautschnitt, Muskel Schnitt und laterale Thorakotomie im vierten Intercostalraum. A) linke vordere Koronararterie (LAD) absteigend sichtbar ist . BD) 11-0 Nylonfaden durch die Mitte Ventrikel geleitet. E) LAD ist ligierten Blanchieren unter der Naht Stelle beobachtet. F) und G) sind Vergrößerungen von A) und E) jeweils. Occ. KOP, verstopfte linke vordere absteigende Arterie. LA, linken Vorhof. LV, linke Ventrikel. GCV, große Herzvene. Weißer Pfeil, LAD. Schwarzer Pfeil Kopf, Blendung durch Beleuchtung. Maßstabsbalken sind 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Der Nachweis von Complete Cardiac Regeneration nach LAD Ligatur in neugeborenen Mäusen. Masson Trichrom - Färbung nach LAD - Ligation in P1 - Mäusen. Ganze Herzen und Vergrößerungen an den Infarktbereiche werden am Tag 3, 7 und 21 nach der LAD-Ligation gezeigt. Hinweis myocyte Verlust und Entzündungszellen infiltrieren in der Infarktregion am Tag 3 post-MI (weißer Pfeil). Vollständige Regeneration Infarktzone beginnend am Tag 7 nach der MI. Wenig Anzeichen einer Fibrose festgestellt, am Tag 21 post-MI. Maßstabsbalken sind 200, 100 und 50 & mgr; m für 40X, 200X und 630X Vergrößerungen sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Neonatal LAD Ligatur ist 100% Reproduzierbare. A) Die Linien der von ganzem Herzen sectioning für TTC eine 0,75 mm Spitze Stück und einem 1 mm Mitte Basisstück zu schaffenFärbung. B) Repräsentative Bilder von TTC gefärbten Scheinkontrolle und LAD ligiert Herzen. Maßstabsbalken sind 1 mm. C) Infarktgröße in 13 LAD Ligationen in P1 neugeborenen Mäusen. Herzen gesammelt 4 - 6 Stunden nach der MI und der Infarktgröße nach der TTC-Färbung gemessen. Rot zeigt vitales Myokard; Weiß zeigt Nekrose. Daten sind Mittelwerte ± SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Neonatal LAD Ligatur Ergebnisse in Reliable Infarkt. A) Infarktgröße in% des ischämischen Bereich nach LAD Ligation in P1 neugeborenen Mäusen (n = 4). Die Herzen wurden 24 Stunden nach der MI und die Infarktgröße gesammelt wurde nach Evans-Blau und TTC-Färbung gemessen. Blau zeigt vitales Myokard; Rot zeigt Bereich gefährdet; Weiß zeigt necrosis. Daten sind Mittelwerte ± SEM. B) Repräsentative Bilder von Evans - Blau und TTC gefärbten LAD ligiert Herzen nach LAD - Ligation. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Neonatal LAD Ligatur Ergebnisse in kardiale Dysfunktion bei 24 Stunden nach der MI. Die Herzfunktion wurde durch Echokardiographie beurteilt. A) Repräsentative M-Modus Bilder für beide scheinoperierten und LAD ligiert Mäusen. End-Diastole und End-Systole sind durch Pfeile. B) Die Messungen der fraktionierten Verkürzung, Ejektionsfraktion und linksventrikulären Innendurchmesser an beiden Diastole und Systole angegeben. Daten sind Mittelwerte ± SEM. N = 8 und 7 für Schein und Koronararterienligatur (CAL), die jeweils. * P <0. 05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Neonatal LAD Ligatur Ergebnisse in kardiale Dysfunktion bei 48 Stunden nach der MI. Die Herzfunktion wurde beurteilt durch Echokardiographie. A) Repräsentative M-Modus - Bilder zeigen End-Diastole (lange Pfeile) und End-Systole (kurze Pfeile) für beide Schein betrieben und LAD ligiert Mäusen. B) Messungen funktionelle Herz durch Echokardiographie einschließlich fraktionelle Verkürzung, Ejektionsfraktion und linksventrikulären Innendurchmesser an beiden Diastole und Systole. Daten sind Mittelwerte ± SEM. N = 4 und 6 für Schein und Koronararterienligatur (CAL) sind. * P <0,05, ** p <0,01.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die chirurgische LAD Ligierung hierin gezeigt, ist eine zuverlässige Methode zur Herstellung von MI in neonatalen Mäusen. Dieses Modell bietet Forschern ein reproduzierbares Modell, mit dem Säuger-Herzregeneration zu studieren. Visualisierung der Koronargefäße ist ein wichtiger Bestandteil dieses Verfahrens korrekte Nahtplatzierung zu gewährleisten und damit die Reproduzierbarkeit gewährleistet. Während adulte Mäuse nicht poikilothermic Fähigkeiten besitzen, wird die Körpertemperatur und die Stoffwechselrate von neugeborenen Mäusen eng mit der Umgebungstemperatur verbunden. Darüber hinaus macht sie die geringe Größe von neugeborenen Mäusen ideal für hypothermische Induktion durch Oberflächenkühlung. Der Zeitpunkt der Operation und Mauskörpertemperatur entscheidend für die Genauigkeit dieser Verfahren Replizieren und somit sorgfältig überwacht werden müssen. Ligierung so bald wie möglich nach der Erstarrung erreicht wird, liefert die Möglichkeit des Myokards post-Ligation zu visualisieren Blanchierens bestätigt chirurgischen Erfolg.

Es gibt multiple Methoden, die verwendet werden können, um MI Induktions bestätigen. Dazu gehören TTC-Färbung, Echokardiographie und histologische Analyse. TTC-Färbung ist kostengünstig, reproduzierbar und zuverlässig und leicht mit hoher Durchsatz durchgeführt. Aus diesen Gründen wurde TTC-Färbung verwendet. Die Echokardiographie kann nicht-invasiv Monitor Änderungen in der Herzfunktion nach der MI im Laufe der Zeit verwendet werden. Definitive Beweis MI kann durch histologische Analyse nachgewiesen werden. In der vorliegenden Studie wurden alle drei der oben genannten Techniken wurden eingesetzt, um erfolgreiche Induktion von MI verifizieren.

Visualisierung von LAD ist entscheidend für die erfolgreiche MI-Induktion. Wenn die Ermittler Schwierigkeiten erlebt die LAD Visualisierung (wahrscheinlich aufgrund tiefer Hypothermie-Induktion), kann sich die linke Ohrmuschel leicht mit einer Pinzette angehoben werden, da die Hauptwurzel der LAD größer als die mehr distalen Segmenten und kann leichter sichtbar sein. Wenn die LAD nicht sichtbar gemacht werden kann, sollte der Prüfer nicht Arterie lo vermutenKation. Dieser Welpe sollte nicht für experimentelle Ligation verwendet werden und könnte eher verwendet werden als eine Farce Steuerung.

Eine korrekte Eingabe in die Brusthöhle am 4. ICR ist wichtig , eine optimale Visualisierung und Raum für LAD - Ligation zu gewinnen. Dies kann durch eine sorgfältige Zählung der Intercostalräume erreicht werden. Außerdem, wenn eine geringe Menge der Blutung während des Verfahrens auftritt, kann es mit steriler Gaze entfernt werden. Wenn die Blutung signifikant ist, jedoch hat der Chirurg wahrscheinlich die Maus nicht ausreichend gekühlt werden, bevor das Verfahren beginnt, und eine weitere Kühlung erforderlich ist. Bitte beachten Sie, dass der Grad der Abkühlung sorgfältig Herzfrequenz bei rund 20 bpm, um sicherzustellen, die Koronararterie zu visualisieren kontrolliert werden sollte.

Aufgrund der geringen Größe von neugeborenen Mäusen wird eine hohe Auflösung erforderlich Echokardiographie klar M-Modus-Bilder für die Analyse der Herzfunktion zu erhalten. Für beste Ergebnisse sorgen Herzfrequenzetwa 400 bpm mit leichter Anästhesie (0,5-1% Isofluran Inhalation) und die normale Körpertemperatur (beheizte Dock und wärmte Echo-Gel). Die Bilder werden am besten erfasst , wenn der Körper leicht in Richtung der rechten Schulter geneigt ist (~ 5 ° kranial und 5 ° nach rechts). Achten Sie auf ausreichende Echo Gel angewendet wird Rauschen zu minimieren.

Obwohl dieser Ansatz 100% Reproduzierbarkeit anbietet, kann die Größe des Infarkts etwas variabel sein , abhängig von der Koronararterie Anatomie des einzelnen neonate Verzweigungs (Abbildung 3). Als Ergebnis höhere n Zahlen können bei der Bestimmung der Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungen oder genetische Manipulationen auf die kardiale Regeneration statistische Signifikanz zu erreichen , erforderlich sein. Jedoch gilt diese Vorgehensweise große Vorteile gegenüber sowohl neonatal apex Resektion und cryoinjury als die Pathophysiologie dieser Mechanismen der Schädigung von MI ganz verschieden sein können und somit nicht genau wiedergegenwärtigen menschlichen MI 8,20. Dieser Ansatz ahmt direkt typische Verletzungen und verwendet werden können, Herzregeneration bei der Einstellung von Säugetier-MI zu studieren.

Dieses Modell ist einzigartig, da es für die Untersuchung der Unterschiede in den Mechanismen der Wiederherstellung von Herzschädigung zwischen dem nicht regenerativen (adult) und der regenerative (neonatale) Säuger Myokard ermöglicht. Zum Beispiel können die adulten Maus MI-Modell führt zu einer dauerhaften Narbenbildung. Ventrikulären Bruch tritt häufig als Folge der Infarktexpansion. Nach unserer Erfahrung mit diesem Modell (> 100 Operationen, nicht veröffentlichte Daten), eine vollständige Regeneration ist offensichtlich, 21 Tage nach dem Infarkt und ventrikuläre Bruch wurde nicht beobachtet. Die Informationen, die aus der Benutzung dieses Modells aufgelaufenen können neue Einblicke in Mechanismen bieten, die Herzregeneration bei Erwachsenen fördern kann.

Neuere Erkenntnisse zeigen Kardiomyozyten Proliferation einen wichtigen Beitrag zur kardialen Regeneration 9 4,21 identifiziert. Weitere Forschung das Protokoll hier vorgestellten verwendet, kann für die Induktion der kardialen Regeneration post-MI zu therapeutischen Ziele zeigen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-0 Nylon Suture Microsurgery Instruments 8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd H1101
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09
Small forceps Fine Science Tools 11063-07
Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope Zeiss 300002
Isoflurane Baxter CA2L9100
Isoflurane Chamber Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) Sigma T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 Zeiss 435400
AxioVision 8.0 Zeiss
Axiocam Icc5 Zeiss 426554
Heat pad Sunbeam  731A0-CN
Sterile Gloves VWR 414004-430
Gauze Sponges Ducare 90212
Ice
Ultrasound imaging system, Vevo2100 Visual Sonics VEVO2100
Ultrasound transducer, 40 MHz Visual Sonics MS400

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References

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