Side Regissert Spin Merking og EPJ spektroskopiske studier av penta Ligand ionekanaler

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I løpet av det siste tiåret har den strukturelle forståelsen av penta ligand ionekanaler (pLGIC) vokst i sprang og grensene, på grunn av mengder av høyoppløselige strukturer av flere medlemmer av familien. Viktige faktorer som førte til dagens fremskritt innen inkluderer, oppdagelsen av prokaryote pLGIC kanaler, 1-3 store utvikler i eukaryote membran protein uttrykk, 4-6 og enorm gjennombrudd i strukturbestemmelse tilnærminger. 7 Disse strukturene gi en klar konsensus på den totale bevaring av den tredimensjonale arkitektur av pLGIC. Men to viktige områder som synes å sti bak er funksjonell karakterisering av disse kanal forberedelser og mekanistisk beskrivelse av kanalfunksjon.

Gating konformasjonsendringer er komplekse og forekommer i løpet av en 60 en avstand langs lengden av kanalen, og disse overgangene er i utstrakt moduleres avmembranlipider. Spesielt har negative lipider, kolesterol og fosfolipider blitt vist å modulere funksjon av pLGIC 8-11. Mens den nøyaktige rolle disse lipid bestanddeler i kanalfunksjon er fortsatt ukjent, ville en komplett molekylær forståelse av gating krever studere disse kanalene i sitt opprinnelige miljø. Site-Regissert Spin Merking (SDSL) og Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spektroskopi er de teknikker av valget for å studere protein dynamikk i rekonstituert systemer. EPR-spektroskopi er ikke begrenset av molekylstørrelse (som er NMR) eller den optiske egenskap av prøven (som er fluorescens-spektroskopi), og derved tillater målinger av full-lengde konstruksjonene rekonstituert i native lipid forhold. Teknikken er ekstremt sensitiv og har forholdsvis lave prøve krav (i pico-mol område). Begge disse forhold gjør teknikken godt egnet for å studere store membranproteiner som er vanskelig å uttrykke i løpet av milligrammengder.

Bruken av EPR-spektroskopi i kombinasjon med seterettet spinn Merkingen ble utviklet av Wayne Hubbell og kolleger, og har blitt tilpasset for å studere en rekke proteintyper. 12-24 EPR-data har blitt brukt for å undersøke sekundære strukturer, endringer i protein konformasjon, membran-innføringsdybder, og protein-protein / protein-ligand interaksjoner.

Fremgangsmåten omfatter cystein substitusjon i posisjonene av interesse ved seterettet mutagenese. For å sikre at sete-spesifikk merking, er det nødvendig å erstatte naturlige cysteiner med en annen aminosyre (f.eks., Serin) for å skape en cystein-mindre mal. Langt, er den mest populære spin etiketten en tiol-spesifikke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-Δ3-pyrroline-3-metyl) methanethiosulfonate som festes til protein gjennom en disulfidbinding bro. På grunn av sin høye spesifisitet, relativt liten størrelse (litt større enn tryptofan), og flexiheten av den linkerområde, har denne sentrifuge etiketten vist seg å ha utmerket reaktivitet selv med en nedgravd cystein. Videre, for å øke reaktiviteten, er merkingsreaksjonen av proteinet utføres i detergent-solubilisert form. Etter separering av overskytende fri spin-etiketten ved størrelseseksklusjons-kromatografi, er proteinet rekonstituert i liposomer eller bilag-ligne systemer med definert lipid sammensetning. Generelt er cystein mutagenese godt tolerert i de fleste deler av proteinet, og den relativt lille størrelsen på spin-sonden medfører minimal forstyrrelse for de sekundære og tertiære strukturer. For å sikre at modifiseringen beholdes vill-type-funksjoner, kan de merkede og rekonstituerte kanaler studeres av patch-clamp målinger.

Det merkede-funksjonelt protein blir deretter utsatt for spektroskopiske målinger, som i hovedsak gir tre hovedtyper av informasjon: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamikk etter lineshape analyse; tilgjengeligheten av proben til paramagnetiske avspenningsmidler; og avstand fordeling. 27 EPR avstander er målt ved to forskjellige metoder. Den første er basert på kontinuerlig bølge (CW) teknikk, hvor spektralutvidelse oppstår fra dipolare interaksjoner mellom ringmerker (i 8-20 avstand range). Brukes til å bestemme avstand 28,29 Den andre er en pulset-EPR metode hvor avstandsmålinger kan forlenges opp til 70 å. 30-34 i Double Electron Electron Resonance (hjort), er svingninger i spin-ekko amplitude analysert for å bestemme avstander og avstands distribusjoner. Her spinn ekko moduleres ved frekvensen til den dipolare interaksjoner. Sammen er disse parametere brukes til å bestemme protein topologi, sekundære strukturelle elementer, og protein-konformasjonelle endringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. seterettet mutagenese og Cys Mutasjoner

  1. Kloning og Mutagenese
    MERK: GLIC villtype (wt) 35 har en enkelt-innfødt cystein (C27), som er mutert til serin for å skape en cystein-lavere bakgrunn. Cystein-mutasjoner er innført på den cystein-mindre bakgrunn ved setestyrt mutagenese ved bruk av primere som bærer en cystein kodon ved den ønskede posisjon 36.
    1. Bland 5 pl 10x reaksjonsbuffer, 1 ul av 100 ng / mL cystein-mindre GLIC templat-DNA 35, 0,5 ul av hver av 40 uM forover og revers primer 36, 1 ul av dNTP (100 mM), og 41 ul deionisert vann . Pipetter prøven et par ganger for å blande det grundig, spinn (6000 rpm) og til slutt legge en mL av DNA polymerase.
    2. Sett termo cycler til følgende protokoll:
      1. Denaturering ved 95 ° C i 4 min.
      2. Denaturering ved 95 ° C i 30 sek.
      3. annealing på 55 ºC i 1 min.
      4. Forlengelse ved 68 ° C i 10 minutter (omtrent 1 min per kb plasmid lengde).
      5. Gjenta trinn 1.1.2.2 - 1.1.2.4 for 18 sykluser.
      6. En endelig forlengelse ved 68 ° C i 10 min.
      7. Å holde temperaturen ved 4 ºC
        MERK: annealing temperaturen er beregnet basert på primer Tm.
    3. Tilsett 1 pl av DpnI til reaksjonsblandingen, blandes grundig ved pipettering, og spinne ned (6000 rpm) i 1 min. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
  2. Transformation
    1. Tine E. coli-kompetente celler på is. Alikvoter 30 ul av celler i et 14 ml sterilt transformasjon rør og tilsett 1 pl av fordøyd DNA til cellene. Bland ved å trykke på siden av røret. Inkuber i 20 min på is.
    2. Plasser røret i en 42 ºC vannbad i 45 sek, og deretter plassere den tilbake på is i 2 min. Tilsett 400 mL sterilt SOC media og riste cellene i en incuBator ved 37 ºC i 1 time.
    3. Plate 100 ul celler på LB-plater inneholdende kanamycin (50 uM) og 1% glukose. Inkuber platene O / N ved 37 ºC.
    4. Høste en enkelt koloni fra platen og vaksinere i 5 ml O / N kulturer som inneholder LB / kanamycin media. Inkuber kulturen O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C i en risteinkubator.
    5. Utdrag DNA fra O / N kultur ved minipreparation 37. Kvantifisere utbyttet av DNA ved hjelp av et spektrofotometer ved å måle absorbansen ved 260 nm bølgelengde. Konsentrasjonen bør være ~ 100-200 ng / mL. Bekrefte tilstedeværelse av mutasjonen ved hjelp av standard rekombinante DNA-sekvensering strategier 38,39.

2. GLIC Expression og rensing

  1. Transformation
    1. Følge trinnene som er beskrevet i avsnitt 1.2, bearbeider 30 ul C43 kompetente celler med en mikroliter (~ 100-200 ng / mL) av plasmid som inneholder genet som koder for GLIC sammen med en menneskelig Rhinovirus (HRV) 3C proteasespaltningsstillingen (For plasmidet og gensekvensen, se supplerende tekst) 35 (fra trinn 1.2.5).
    2. Plate 100 ul celler på LB-agar plater inneholdende 1% glukose og 50 ug / ml kanamycin, og inkuber dem O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C i en inkubator.
    3. Sjekk visuelt for kolonier og sikre at de ikke er over-vokst eller viser tilstedeværelse av satellitt kolonier. Omgående forsegle plater med parafilm og lagre dem på 4 ºC.
  2. Sette opp O / N-kulturer og klargjøring av vekstmedier
    1. Plukk en enkelt isolert koloni ved hjelp av sløyfe inokulering av wire og overfør til en 100 ml steril flaske inneholdende 20 ml Luria-buljong (LB) media supplementert med steril 1% glukose og 50 ug / ml kanamycin. Inkuber dem O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C i en rystemaskin ved 250 opm.
    2. Autoclave 900 ml Terrific Buljong (TB) media (Se Media og Buffer sammensetning) i 2.8L Fernbach glasskolber for bakteriekultur i dampsyklus ved 121 ° C i 20 min.
  3. Sette opp store vekstkulturer
    1. Legg 100 ml steril kaliumfosfatbuffer (se Medier og buffersammensetning) til den autoklaveres TB media. Legg steril glukose (0,2% sluttkonsentrasjon), kanamycin (50 ug / ml), og 10 ml av O / N kultur. Inkuber ved 37 ° C i en rystemaskin ved 250 opm.
    2. Sjekk den optiske tettheten ved 600 nm bølgelengde (OD 600) ved hjelp av densitometer eller et spektrofotometer hver time inntil den når 0,5 (~ 2 timer). På dette punktet redusere hastigheten til 150 rpm og senke temperaturen til 18 ° C. Overvåk OD 600 hvert 30 min før den når 0,8 (~ 1 time).
    3. Tilsett 50 ml av glycerol og fortsette risting kulturen inntil OD 600 når 1,0 til 1,2 (~ 15-30 min).
      MERK: Under disse forholdene, det tar omtrent en time for kulturen å nå 18 ºC fra 37 ºC. Det er important som glyserol blir tilsatt til kulturen etter at den er avkjølt til 18 ° C.
    4. Fremkall cellene med 200 mikrometer IPTG (isopropyl-tio-β-galactoside) og nullstille shaker tilbake til 250 rpm og ruge videre for ~ 16 timer ved 18 ºC.
  4. protein Purification
    1. Sikre at OD 600 på slutten av 16 timer er ~ 16 - 18. Slakte cellene i 1,0 L sentrifugeflasker ved å spinne ved 8500 x g, 4,0 ° C i 15 min. Dekanter supernatanten og veie flasken med cellepelleten. Beregn vekten av pelleten ved å subtrahere vekten av den tomme flasken fra den totale vekten.
      MERK: forventet cellepellet vekt er ~ 30 - 35 g / l. Selv om det skal bemerkes at det kan være variasjon i den endelige OD 600 og cellepelleten vekt på tvers av mutanter.
    2. Re-suspendere den bakterielle pellet i 150 ml iskald buffer A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) pr 1,0 liter kultur. Legg DNase I (100 ug / ml) og protease-inhibitorer (fenylmetylsulfonylfluorid (1 mM), leupeptin (2,0 ug / ml), aprotinin (2,0 ug / ml) og pepstatin A (1 pg / ml)).
    3. Homogenisere cellene ved å føre dem gjennom en celle disrupter i en 4,0 ° C kaldt rom. Gjenta prosessen tre ganger, slik at de fleste bakteriene blir lysert. Sentrifuger cellene ved 14 000 xg i 15 min og pipettere supernatanten ut og overføres til et rent sentrifugerør. Kasser pelleten som inneholder un-lyserte celler og inklusjonslegemer.
    4. Sentrifuger supernatanten på 168 000 xg i 1 time. dekanter nøye supernatanten uten å forstyrre pelleten membranen.
    5. Pool membranen pellet fra 1 liter kultur og re-suspendere det i buffer A (supplert med 10% glycerol) til et sluttvolum på 50 ml. Tilsett 0,5 g n-Docecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) til membransuspensjonen og nutere i 2 timer ved 4,0 ° C.
    6. Etter membran solubilization, fjerne celleavfall fra lysatet ved sentrifugeasjon på 168 000 xg for 1t. I mellomtiden fremstille amylose harpiks. Transfer 3 ml harpiks ved hjelp av en pipette inn i en tom polypropylen kromatografikolonne. Vask harpiksen ved å føre 10 sjiktvolumer av vann 3 ganger og deretter med 10 sjiktvolumer av buffer A inneholdende 0,5 mM DDM.
    7. Etter sentrifugering, forsiktig ta supernatanten ut ved hjelp av en pipette og overføres til et rent 50 ml konisk rør. For satsvis binding, legge pre-likevekt amylose harpiks til konisk tube. Bind den utpakkede protein til amylose harpiks ved vipp blandingen i 2 timer ved 4,0 ºC.
    8. Passere hele oppslemmingen gjennom en kromatografikolonne og samle gjennomstrømnings. Deretter passerer det hele samlet gjennomstrømnings over harpiksen en gang til for å øke binding.
    9. Passere 10 sjiktvolumer buffer A med 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) og 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) for å fjerne ubundne proteiner.
    10. Eluer GLIC protein med 10 ml Buffer A inneholdende 40 mM maltose i tillegg til 0,5 mM DDM og 0,05 mM TCEP. TCEP forhindrer oksydasjon av cystein-sidekjeder. Samle hele elueres.
    11. Konsentrer eluert protein ved hjelp av sentrifugalkraften konsentrator (molekylvekt Cut-off = 50 kd) til 4-6 mg / ml og tilsett HRV-3C protease (200 mikrogram per 10 mg protein) og inkuberes O / N på 4,0 ºC.
      MERK: Fastslå ferdigstillelse av protease fordøyelsen ved å kjøre prøvene på SDS PAGE gel (Se trinn 2.5.5 og figur 1).
  5. Site-Regissert Spin-merking
    1. Gjør om lag 100 pl av 200 mM stamløsning av (1-oksyl-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyrrolin-3-metyl) MTSL 40 i DMSO og lagre lager ved -20 ° C i 25 mL alikvoter.
    2. Bruk protease-fordøyd prøve for spin-merking med MTSL. Tilsett 10-ganger molart overskudd av MTSL spin-etikett (GLIC monomer: MTSL i 01:10 molforhold). Inkuber på is i 1 time. Legg et andre skudd av spin etiketten på en 5 ganger molart overskudd-forhold og inkuberes i en time.
      MERK: For nedgravde posisjoner (med lav spin merking effektivitet, beskrevet nedenfor), er en 30 ganger molart overskudd av spin etikett tilsettes og protein inkuberes i 6 timer.
    3. Passere prøven gjennom en størrelsesutelukkelses Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) kolonne som er pre-ekvilibrert med buffer A og 0,5 mM DDM for å skille det spaltede MBP og det overskytende fri spin-etikett fra GLIC pentamerer. Samle 1 ml fraksjoner for en total av 30 ml eluering. Benytte de fraksjonene som inneholdt GLIC pentamerer (figur 1). Følg produsentens instruksjoner for å kjøre FPLC.
    4. Bestemme konsentrasjonen av prøven ved hjelp av et spektrofotometer ved å måle absorbansen ved 280 nm bølgelengde. Molar ekstinksjonskoeffisient og den beregnede molekylvekt på GLIC monomer er 49 850 M -1 cm -1 og 36 380 Da, respektivt. Konsentrere proteinløsning ved hjelp av en sentrifugal-konsentrator (MolecularVekt Cut-off = 50 kd) til en endelig konsentrasjon på ~ 8-10 mg / ml og plassere den på is. Prøven er nå klar for rekonstituering.
    5. Som en ekstra kvalitetssjekk for å sikre at preparatet er biokjemisk homogen, kjøre en reduksjon (1,0% β-ME) SDS-PAGE gel.
      MERK: commassie fargede gel bør vise et enkelt bånd ved ~ 33 kDa som svarer til den GLIC monomer (figur 1).
    6. For de ring merket mutanter som er mistenkt for å stille dipolart utvidelse, under-merke prøvene i nærvær av diamagnetisk etikett 41. Inkuber det eluerte protein med 0,1-ganger MTSL og inkuber på is i 1,0 timer. Deretter tilsettes 20-ganger molart overskudd av diamagnetisk etikett (1-acetoksy-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyrrolin-3-metyl) metan thiosulfonate.
      MERK: diamagnetic reagens brukt her er iso-sterisk til det paramagnetiske etiketten med en identisk merking kjemi.
    7. Inkuber prøven på is i 2 timer. Før prøven gjennom en size-kromatografi-kolonne som er pre-ekvilibrert med buffer A og 0,5 mM DDM som i trinn 2.5.3.
  6. Effektivitet av spin merking
    1. Spinn-merking effektiviteten er definert som forholdet mellom spinn-markør-konsentrasjonen til konsentrasjonen av cystein-sidekjede (GLIC-monomer). For å bestemme effektiviteten av spinn-merking av prøven, vil den integrerte intensitet av prøven sammenlignes med en standard av kjent konsentrasjon ved bruk av en kalibreringsplott. Lage oppløsninger av et EPR standard (for eksempel 2,2,6,6-tetrametyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) i et område av konsentrasjoner (minst 10 - 250 pm) ved oppløsning i vann.
    2. Mål EPR-signalet for hver av disse løsninger, og å bestemme arealet under kurven (dobbel integrasjon av EPR-signal) for hver konsentrasjon (som beskrevet i trinn 6.1). Generere en kalibreringskurve ved å avsette den målte området som en funksjon av TEMPO konsentrasjon og passer sammen med en rett linje.
      MERK: eret i henhold til et derivat EPR-signalet er en bedre beskrivelse av den spektrale intensitet enn den topp til topp amplitude. Integrering av den første-deriverte EPR-signalet vil gi absorpsjonsspektrum, vil en andre integrasjons deretter gi arealet under absorpsjonsspektrum (som er proporsjonal med spinn konsentrasjon). Sikre en konstant basislinje både i lav-felt og høy felt området av spekteret.
    3. Måle konsentrasjonen av spinn-merket protein i vaskemiddel ved hjelp av et spektrofotometer (som i trinn 2.5.4). Nå måle EPR-signalet fra prøven, og deretter bestemme området av den dobbelte integral av EPR-signalet følge fremgangsmåten i avsnitt 6.1. Ved å bruke kalibreringsplott, bestemme konsentrasjonen av etiketten som tilsvarer den målte EPR-signalet. Beregn spinn merking effektivitet som det molare forholdet mellom spinn etikett og proteinkonsentrasjon.

3. GLIC Tilberedning i Asolectin Membraner

  1. Skyll en ren 25 ml rundkolbe med 5 ml kloroform og tørk kolben i en strøm av N2-gass i avtrekksskap. Overfør 10 mg asolectin (soya polar ekstrakt 25 mg / ml lager i kloroform) i kolben og tørke lipider under en kontinuerlig strøm av N2 gass.
    MERK: Valg av lipider for tilberedning er basert på funn fra eksperimenter i § 4.
  2. Når kloroformen er fordampet, plassere kolben i et vakuum i 1 time for å sikre fullstendig tørking. Tilsett 1 ml av rekonstituering buffer A til det tørkede lipid og vortex kolben kraftig for å få lipid pellet i suspensjon.
  3. For å fremstille små unilamellære vesikler, sonikere lipid suspensjon i et kaldt bad sonikator inntil vesikkel-løsningen blir mer eller mindre gjennomskinnelig og ingen klumper er observert (omtrent 10 - 15 min). Til denne blandingen, tilsett DDM til en sluttkonsentrasjon på 4 mM og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
<li> Tilberedning
  1. Legg til det rensede proteinet fra trinn 2.5.4 til lipidblandingen.
    MERK: protein til lipid-forhold avhenger av type eksperiment. For makroskopiske strømmålinger, en 1: er forholdet 10000 brukes. For EPR studier er rekonstitusjon gjort på et høyere protein til lipid-forhold (1: 2500) for å maksimalisere signal. Det er tidligere vist at ved disse konsentrasjoner, ingen lateral aggregering observert 42.
    MERK: Typisk arbeids mengde GLIC for EPJ er ~ 1 mg, men basert på posisjonen analysert, vil lavere mengder fungerer også.
  2. Inkuber prøven ved 4 ° C i 1 time med forsiktig rotasjon deretter fortynne prøven til 15 ml med Buffer A.
    MERK: Dette trinnet bringer vaskemiddel konsentrasjon under den kritiske micelle konsentrasjon (CMC).
  3. Fjern det gjenværende vaskemiddel i suspensjonen ved tilsetning av polystyren-kuler (med hydrofobe porer som felle vaskemiddel). Legg 80 mg av ren perler og inkuber liposome suspensjon O / N på en nutator ved 4 ºC.
    1. For å forberede perlene for bruk, veie ~ 100 mg og overføre dem til en 50 ml konisk tube. Tilsett 10 ml metanol, rist kraftig, spinne ned perlene ved 8000 x g i 2 min, og dekanter metanol. Gjenta denne fremgangs metanol vask tre ganger. Gjenta den samme prosessen med 30 ml avionisert vann, vasking tre ganger.
  4. Den neste dag, overfører liposomet til et 25 ml rør ultrasentrifuge ved bruk av en kolonne filter for å fjerne perlene, og ytterligere fortynne prøven til 25 ml. Sentrifuger prøvene ved 168 000 xg i 2 timer. Dekanter supernatanten og re-suspendere pelleten ved hjelp av 100 ul buffer B.

4. Bestem Optimal fettsammensetning for Tilberedning av FRET

  1. Bruke en fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -basert assay for å bestemme membransammensetning som opprettholder den proteinet monodisperse.
  2. rens vekt
  3. Ved å følge fremgangsmåten i del 3.2 for rekonstituering fremstille tre forskjellige prøver for hvert lipid-preparat som skal testes, først, fluorescein-merket GLIC i et molart forhold på 1:. 1500 (pentamer: lipid) For det andre, rhodamin-merket GLIC i et molforhold av 1: 1500 (pentamer: lipid). For det tredje blande vaskemiddel oppløst fluorescein og rhodamin-merket GLIC (1: 1 molforhold). Rekonstituer denne blanding i 1: 750 (pentamer: lipid) forhold.
    MERK: Vi brukte tre lipid systemer: asolectin, POPC: POPG (3: 1 molar ratio), og E. coli polar ekstrakt. Proteinet til lipid rekonstitusjon forhold i FRET forsøket er høyere enn den som anvendes for EPR-målinger (1: 750 i forhold til 1: 1500 brukes til EPR-studier).
  4. Fortynnetliposomsuspensjonen (for å redusere lysspredning signal; ~ 5 ul i 995 ul buffer A) og deretter pipettere prøven inn i en kvartskuvette og plassere den i et fluorimeter.
  5. Still eksitasjonsbølgelengde på 490 (som tilsvarer den absorbsjonsmaksima for donor: fluorescein). Ved hjelp av produsentens instruksjoner, ta opp emisjonsspekter fra 500 nm til 660 nm.
    MERK: For fluorescein-merket GLIC prøve, vil du se en topp på 518 nm (tilsvarende fluorescein utslipp) med ingen topp på 572 nm (tilsvarende rhodamine utslipp). For rhodaminmerkede GLIC prøve, vil du ikke se en topp på 518 nm, men i stedet ved 572 nm som følge av direkte eksitasjon av rhodamine på 490 nm. For prøven som inneholdt både fluorescein og rhodamin etiketter, en reduksjon i fluorescein toppintensitet og en tilsvarende økning i rhodamin topp er et FRET signal som er egnet til en indikator for lateral aggregering av proteinet på membranen.
  6. Overvåkamplitude av rhodamine utslipp på 572 nm ved forskjellige tidsintervaller (0-24 timer) opptak på hver time for første seks timer og deretter etter O / N inkubasjon (figur 2). For hvert intervall, å måle fluorescensintensiteten ved 572 nm (for rhodamin: Ia) og ved 518 nm (for fluorescein: Id). Trekk bidrag direkte rhodamine aktivering (prøve 2 i trinn 4.3) fra Ia (Iac). Bestem FRET forholdet som IAC / (Iac + Ib). Sammenligne FRET på ulike tidsintervaller og på tvers av ulike lipid komposisjoner.
    MERK: Som en kontroll, utfører trinn 4.5 og 4.6 for vaskemiddel oppløst prøver og sammenligne emisjonsspektra for de fra rekonstituerte liposomer. Bruke en ekvimolar blanding av merket protein i detergent (er beskrevet i trinn 4,3) og fortynnet i buffer A supplert med 0,5 mM DDM. Det er forventet at vaskeprøver viser minimal FRET signal.

5. Funksjonell Målinger av patch-clamp Recordings

  1. Forbered proteoliposomes for patch-clamp målinger i nøyaktig samme måte som for EPJ-studier (§ 3.1).
    MERK: Men justere protein: lipid-forhold basert på den type måling blir gjort (Single-kanal vs Makroskopiske opptak). Flash-fryse proteoliposomes i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ºC inntil bruk. Typisk rekonstitueres GLIC på 1: 10.000 protein: lipid (molforhold) for makroskopisk strømmer og 1: 50000 molarforhold for enkeltkanalsopptak.
  2. Tine liposomer på is. Skyll et rent glass lysbilde med vann og etanol og tørke helt. Plasser en 10 pl dråpe av proteoliposome på midten av sleiden og tørre O / N i en eksikator ved 4 ° C under vakuum.
  3. Re-hydrat tørkede proteoliposomes ved å legge 20 mL Buffer B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) og plasser raset i en petriplate på toppen av en fuktig filterpapir. Dekk platen og la den rehydrering for å forløpe i omtrent 2 timer.
    MERK: Denne prosessen yieLDS gigantiske multi-lamellære liposomer som bidrar til lappe fra.
  4. Trekk patch pipetter fra tynne vegger borsilikatglass kapillærer (~ 1-2 mikrometer tip diameter) ved hjelp av produsentens anbefalte innstillingen på pipetten avtrekker. Heat-polsk hjelp av en brann-smi til en motstand på 1,5 - 2MΩ når de er fylt med buffer B.
  5. Fyll innspillingen kammer med buffer B ved hjelp av en pipette og fest Ag / AgCl jordelektroden. Ved hjelp av en 2 ul pipettespiss, forsiktig løsne liposomene fra kanten og overførings 1 mL av suspensjonen på opptakskammeret. Vent noen minutter for liposomene å bosette til bunnen.
  6. Fyll patch-pipette med buffer B ved hjelp av en metallisk sprøyte nål og montere den på forsterkeren head-scenen. Identifisere en enkelt isolert vesikkel å lappe. Påfør et lite overtrykk for å hindre at patch-pipette fra clogging, og sett spissen i opptakskammeret.
  7. Påfør Testpulsene å måle pipetten sveisince og kompensere for pipetten spenning offset. Tilnærming vesikkel, og når kontakt er gjort, bruke en liten negativ press for å trekke vesikkel mot lappen pipetten forsiktig for å danne en gigaohm segl.
  8. Overvåk motstanden av pipetten under hele prosessen. Når gigaohm forseglingen er dannet, trekke pipetten forsiktig bort fra liposomer for å danne en inside-out patch. Slå av test puls.
  9. Sett holde potensial til -100 mV, og bruke en pH puls. Lav pH-verdien ble oppnådd ved anvendelse av 10 mM natriumcitrat-buffer C (150 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0). (Figur 3)
    MERK: Opptakene er gjort på en samplingsfrekvens på 10 kHz for makroskopisk og 40 kHz for enkeltkanalmålinger.

6. EPJ Målinger

  1. Kontinuerlig-Wave EPR spektroskopi
    1. Overfør liposom-suspensjonen fra trinn 3,2 til en 200 mL rør og pelletere prøvene ved hjelp av en sentrifuge. Kast supernatant og prøven er klar for EPJ-målinger.
      NB: For EPR-målinger, er det viktig å fjerne så mye buffer fra liposomet prøven som mulig. Siden vandige prøver absorbere den elektriske delen av mikrobølge resulterer i oppvarming og tap av følsomhet.
    2. For å utføre bufferbytte, overfør 20 pl av liposom pellet ved hjelp av en pipette til et mikrosentrifugerør. Legg 180 ul buffer D (100 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0) og inkuberes ved 42 ° C vannbad i 5 min. Sentrifuger prøven, fjern supernatanten ved hjelp av en pipette, og gjenta prosessen tre ganger for å sikre fullstendig bufferbytte.
      MERK: Alternativt kan bufferbytte fremstilles ved å utsette prøvene for flere fryse / tine sykluser.
    3. Gasspermeable plastkapillærer er egnet for målinger av både spektral-linje-former og oppløsningsmiddel tilgjengelighet. Trykk på kapillær på pelletert proteoliposome å trekke prøven inne og forsegle slutten med bein voks.
      IKKEE: Typisk prøvevolumer er ~ 5 mL og en ønskelig spin konsentrasjon er 150 mikrometer. Hvis målet er å måle linjeformer alene, kan man bruke 0,4 mm OD kvarts kapillarrør. Om nødvendig, kan en pipette brukes til fylling av prøven inne i kapillæret.
    4. Operere spektrometeret
      1. Utfør CW-EPJ målinger ved RT (292-297 K) på en X-band spektrometer utstyrt med en resonator som per produsentens bruksanvisning.
      2. Slå på vannkjøleren, strømforsyning, og mikrobølgeovn brokonsoll. La systemet til termisk likevekt i omtrent 30 min før opptaket. Åpne oppkjøpet programvare.
      3. Sett i prøverøret / kapillær til resonatoren, sørge for at den delen av røret fylt med prøven er ved midten av resonatoren hulrom. Tune resonatoren som per instruksjon på spektrometer manualen.
      4. Ta den første deriverte absorpsjonsspektrum av feltsveip påen innfallende mikrobølgeeffekt på 1,0 mW, en moduleringsfrekvens på 100 kHz og en sveipebredde på 100 G. Bestem optimal kraft for forsøket ved å utføre en progressiv kraft metning eksperiment hvor topp-til-topphøyde av den første deriverte CW EPR-signalet blir målt som en funksjon av kvadratroten av den innfallende mikrobølgeeffekt.
        MERK: Ved lavere mikrobølgeovn krefter, er intensiteten av signalet øker proporsjonalt med kvadratroten av kraften så lenge likevekt befolkningen i spinntilstander upåvirket. Men hvis strømmen økes ytterligere, spinn-gitter avslapning kan ikke lenger opprettholde likevekt befolkning forskjell på de to spinntilstander og signal amplitude begynner å platå eller "mette". Utover dette punktet, kan signal amplitude faktisk avtar med økende observere strømmen på grunn av befolknings inversjon av spin sates. I tillegg til utvidet spekteret med omfattende vinger hvor en veldefinert flat baseline er ikke vilig, forlenge tidsbredden til 150-200 G for å hindre område tap.
      5. Begynne med ved hjelp av et modulerings amplitude på 1,0 G.
        MERK: Denne verdien er sample-avhengig og justert for å redusere den lavfrekvente støyen i signalet. Hvis en for stor verdi anvendes, kan det forvrenge eller utvide signalet.
      6. Still inn tiden konstant og konvertering tid til 20,48 msek, feie tid til 20,97 sekunder, og oppløsningen til 1024 poeng.
        MERK: Tiden konstant er også basert på prøven og justeres for å filtrere ut høyfrekvent støy.
      7. Etter det første søket, stiller sentrum feltet i sentrum av EPR-signalet og velger tidsbredden slik at sporet omfatter signal og tilstrekkelig basislinje på hver side.
        Merk også, for å forbedre signal / støy-forholdet, øke antall skanninger basert på styrken av EPR-signalet. Inkluder sweep bredde og antall poeng
      8. Mål tilgjengeligheten av spin etiketten for å collisional avslappende midler O 2 27 beskrevet i trinn 6.1.4.4.
        MERK: Forbered Niedda som beskrevet tidligere 26.
      9. Først perfuse prøven i hulrommet med N2 i 5 minutter (for å spyle ut O 2). Mål spektra for hver mikrobølgeeffekt mellom 5-35 dB i trinn på 3 dB med et sveip bredde på 30 G.
      10. Deretter perfuse prøven i hulrommet med luft i 10 minutter og måle spektrene ved forskjellige mikrobølge krefter (5 - 35 dB i trinn på 3 dB) som i trinn 6.1.4.9.
      11. Inkuber 20 ul av liposom-pellet med 180 ul 50 mM Niedda (i buffer B eller buffer D) i et 42 ° C vannbad i 5 minutter. Sentrifuger prøven og fjern supernatanten ved hjelp av en pipette. Last prøven i kapillær og plasser den i resonansrommet. Gjenta trinn 6.1.4.9.
        MERK: Prinsippet bak forsøket er at samspillet med paramagnetiske relaxing midler gjennom Heisensentrifuge utveksling ville hindre metning av signalet og populasjonsinversjon. Vannoppløselige Niedda og fettløselige molekyl O 2 benyttes som reportere for vann (både bulk og intraprotein gangen) og membranen eksponert posisjoner på proteinet, henholdsvis.
  2. Dataanalyse:
    MERK: Analysen av EPJ data omfatter følgende trinn: 14,22,23,25-27
    1. Beregn mobilitet av spinnsonden (AH o -1), som den inverse av den sentrale linjebredden av den første deriverte absorpsjonsspekteret. AH o -1 er reflektert av den bevegelsesfrihet eller dynamikken i sonden.
    2. Beregn tilgjengelighets parameter (П), som er et estimat av tilgjengeligheten av proben til andre paramagnetiske collisional avslappende midler, ved hjelp av trinnene beskrevet nedenfor.
      MERK: Interaksjon av spin-sonde med paramagnetiske avslappende midlerforbedrer spin-gitter avslapning rate (T 1) av nitroksydet av Heisenberg spin utveksling. 27
      1. Estimer tilgjengelighets parameter (П) fra strømmetningseksperimenter (6.1.4.8) hvor den vertikale spiss-til-spiss amplituden av den sentrale linje av den første deriverte EPR-spekteret blir målt på forskjellige mikrobølgeeffekt. 25 Plot amplituden av signalet som en funksjon av kvadratroten av mikrobølgeeffekt og passform med den følgende ligning 27.
        ligning 1
        MERK: hvor A er amplituden av signalet, er et mål for homogeniteten til metning av resonans-linjen (som vanligvis er mellom 0,5 og 1,5), er jeg en skaleringsfaktor, P er innfallende kraft, og den representerer verdi ved hvilken den første deriverte amplitude er halvparten av dens umettet verdi.
  3. Beregn AP 1/2 verdier i nærvær (O to eller Niedda) og fravær (perfusert med N2) av paramagnetiske avslappende midler. Beregn tilgjengelighet parameter (П) ved hjelp av ligningen:
    ligning 2
    MERK: Der P 1/2 referanse og AH o referanse er det halvparten av maksimal kraft metningsverdi og den sentrale linjebredde, henholdsvis for referansestandard (for eksempel DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biokjemisk karakterisering av Spin-merket GLIC Mutants

Ved å følge den ovenfor beskrevne protokoll vil typisk gi GLIC-MBP-fusjonsprotein i området fra 10 - 12 mg / l kultur. Selv om denne verdien kan variere mellom ulike mutanter, spesielt for stillinger begravet i protein, kan avkastningen bli betydelig svekket. I disse tilfellene kan de kulturvolumer krever oppskalering. Spaltningen av fusjons konstruere ved HRV3C protease utføres O / N for enkelhets skyld. Ved å kjøre prøvene på SDS PAGE gel, fant vi ut at dette cleavage er fullført i løpet av 30 - 60 min. (Figur 1A). Renset GLIC på størrelseseksklusjons gelfiltreringskolonne eluerer hovedsakelig som en pentamer med et retensjonsvolum på 11,3 ml. MBP fraksjonen elueres ved 15 ml og aggregater eluere ved hulromsvolumet av kolonnen (~ 7,0 ml). Spin-label kommer påslutten av elueringen (~ 24 ml) (figur 1 B)

FRET baserte analysen for overvåking Aggregering av GLIC Rekonstituert i ulike membranlipider

FRET-analysen brukes til å evaluere aggregering av GLIC pentamers i utblandede vesikler (kom sammen innenfor en avstand <50 A på membranen). Figur 2 viser data fra GLIC vekt (med C27, merket med enten Fluorescein eller tetramethylrhodamine) og rekonstituert i E .coli polare lipider, POPC: POPG (3: 1), pave: POPG (3: 1) eller asolectin. Fluorescens målinger viser at GLIC rekonstituert i asolectin viste ingen gnage og selv fryse / tine prøven (betingelser kjent for å fremme aggregering) produsert minimal endring i gnage nivåer 43. Av denne grunn er asolectin lipidblandingen grepet av funksjonelle og spektroskopiske målinger som brukes i disse studør.

Makroskopisk Behavior av GLIC i Proteoliposomes

Funksjonelle egenskaper av renset GLIC er preget av patch-clamp måling i rekonstituert proteoliposomes. Representative makroskopisk aktuelle opptaket fra wt GLIC fra en innside-ut lapp som svar på en pH-hopp er vist i figur 3 ved -100 mV holdepotensial, bytte til pH 3,0 buffer produserer hurtig aktiverende innover strømmer. (10-100 millisekunder) som forråtnelse til ca. 10% av toppamplituden i løpet av sekunder 43 (1 - 3 sek, figur 3). Currents gjenopprette fra denne makroskopisk forråtnelse eller desensibilisering ved å bytte tilbake til nøytral pH. Mens kanaler i innsiden ut lapp var følsomme for endringer i badekaret pH, var det ingen effekt av pH-endring i pipetten løsningen (data ikke vist) som tyder på at GLIC ble hovedsakelig orientert i en direDette skjer slik at det i plasteret det ekstracellulære domene overfor bad / løsning veksleren.

Strukturelle rearrangements Under Channel Activation

Ved romtemperatur, kan den spin-proben ta i bruk flere rotameric konformasjoner, og den spektrale linjeformen er følsom ikke bare til bevegelse av spin-label sidekjeder i forhold til peptidryggraden, men også til ryggraden svingninger og til globale protein bevegelser. Derfor vil endringer i EPR lineshapes vise seg å være en utmerket diagnostisk verktøy for å overvåke protein konformasjonsendringer. Figur 4 viser spektra ved posisjon L241 (17) R1 i det ekstracellulære hydrofob region av pore-foring M2 område (stilling markert som svarte sirkler i Figur 4, Innfelt) ved pH 7,0 og pH 3,0. Spektrene viser differanse i de to tilstander, både i amplitude og omfanget avbevegelses utvidelse. Som med funksjonelle målinger 42, de konformasjonsendringer rapportert av EPJ-signaler er også fullt reversible. Spektralutvidelse påvirkes både av bevegelses begrensninger av sonden og ved dipolart kopling. For å bestemme bidraget fra de to, L241 (17) er co-merket med en diamagnetic spin-label. De under-merket og fullt merket spektra sammenlignes på pH 7,0 og pH 3,0 (figur 4B). Omfanget av bipolart utvidelse i denne posisjonen avtar når kanalene er i henhold til merket, noe som indikerer en interaksjon mellom ringmerker mellom ulike subenheter.

Figur 5 viser spektrene til to posisjoner på M4 spiralen som ligger ved periferien av kanalen. AH o -1 måles som den inverse av den sentrale linjebredde (vist i innfelt). Som nitroksid roterende bevegelse reduseres, slik vi har sett under dannelsentertiære eller kvartære kontakter, linjebredden øker (og dermed AH o -1 minker) for en bestemt bevegelses geometri. Tvert imot, er strukturelle bevegelser som fører til en økning i sondens bevegelsesfrihet reflektert som en økning i AH = o -1. F312R1 er mer mobil mens R296R1 er immobile, i samsvar med sine synlige og svært begrensede miljøer, henholdsvis.

Basert på tilgjengelighets parametre, kan en spin-etikett på en bestemt posisjon på proteinet bli klassifisert som en av følgende: begravd i proteinets kjerne utilgjengelig for enten vann eller lipider, på overflaten eksponeres for en vandig løsning, eller i overflate eksponert for lipider (figurene 5 og 6). Tilgjengelighets parametere oppnådd for en serie av på hverandre følgende områder kan så benyttes til å bestemme den sekundære strukturen av en region, sondere områder av protein-proteinkontakt, måle vinkelen på et proteiner inne i membranen, estimere neddykningsdybden av grenseflate løkker, og identifisere vann gangen og lipid-bundet lommer innenfor transmembran-helikser. 26 Som et eksempel, strøm-metningskurvene i figur 6 viser at F312R1 har en forholdsvis høyere P 1/2 for O 2, i forhold til R296R1, noe som tyder på sidekjeder i posisjon F312 er lipid-eksponerte. I tillegg er F312R1 også mer tilgjengelig for Niedda i forhold til R296R1 i samsvar med sin plassering på lipid-vann-grenseflaten. På den annen side, L180R1 i løkken C-regionen til det ekstracellulære domenet er mobil og tilgjengelig for Niedda, i samsvar med dens plassering i en vanneksponert sløyfe.

Probe dynamikk og tilgjengelighetsdata ved en gitt posisjon tilveiebringe lokal strukturell informasjon om den bestemte posisjon innenfor det generelle protein-fold. Disse parametrene bestemmes for alinear sekvens av rester langs proteinet kan bli ytterligere analysert ved hjelp av analytiske metoder basert på Fourier-transformasjonen metoder. Disse analysene er nyttige for å vurdere periodiske variasjoner i EPJ miljøparametre og å veilede i å forutsi og orientere sekundære strukturer. For en spesiell proteinsegment, en diskret Fourier-transformasjon effektspekteret P (ω) beregnes som en funksjon av vinkelen mellom nabostillinger (w) i det aktuelle segmentet. Dette plottet blir så brukt til å bestemme den største vinkelfrekvenskomponent av spekteret og sammenlignet med de forventede (w) verdier for et α-heliks (80-120 °) eller p-tråder (150 - 180 °).
ligning 3
P hvor P ( 'ω') er den Fourier-transformeffektspektrum som funksjon av vinkelfrekvensen ω, n er antallet av rester i segmentet, er miljøparameter ved posisjonen. ('ω') blir evaluert for verdien ω = ligning 6 som maksimerer P ( 'ω').

Videre, en periodisitet indeks parameter (gir betydningen av den forutsagte sekundære struktur) beregnes som et forhold mellom arealet under energispekteret for den vinkel som representerer en gitt konstruksjonselement som i det totale området av spekteret. Et glidende vindu metode blir så brukt for å identifisere begynnelsen og slutten av et gitt sekundærstrukturelement. Den relative orientering av dette segmentet i forhold til resten av proteinet kan estimeres fra retningen av P ( 'ω') øyeblikk.

For α-helix:

ligning 4

ligning 5

Disse metodene har blitt brukt for flere systemer for å bestemme tredimensjonale topologier og forutsi konformasjonsendringer underliggende protein funksjon 14,23,24,41,44-53.

Bestemme Avstand Distribusjon fra EPJ

Inter-subenheten nitroksydet avstander kan bestemmes fra elektron-elektron dipolare interaksjoner. I CW-EPR, som vist i figur 4, gjennom-space dipolare interaksjoner føre til spektralutvidelse og er en funksjon av nærheten mellom etikettene. For avstander opp til ~ 15-20 Å, graden av utvidelse (i forhold mellom helt merket spektra og undermerkede spektre) kan brukes til semi-kvantitativt bedømme avstander ved hjelpFourier dekonvolvering metoder. 28,29

Inter-subenhet avstander (<50 Å) kan måles ved hjelp av dobbel Electron-Electron resonans (DEER) metoder. 30-34 DEER data er samlet i vaskemiddel prøver eller rekonstituert i nanodiscs på grunn av de begrensninger som er knyttet til disse målinger i liposomer 54. For spin-merkede prøver i vaskemiddel (~ 100 mikrometer) i buffer A med 0,5 mM DDM, er 30% (vekt / volum) glycerol anvendes for kryobeskyttelse. De bipolart tidsutviklingen data er innhentet ved 83 K ved hjelp av en standard DEER fire pulsprotokollen (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2-ekko 55 på en pulset EPR-spektrometer drevet ved Q-båndfrekvensen (33,9 GHz). Puls lengder for (π / 2) og MW1 (π) MW1 er 10 og 20 nsek, henholdsvis, og 40 nsek til (π) MW2. DEER signalene blir da bakgrunn korrigert forutsatt en 3D homogen background og analysert av Tikhonov regularisering 31,56 for å bestemme gjennomsnittlig avstander og utdelinger i avstand.

Intramolekylære avstander for en representativ posisjon i M4 (F314R1) bestemt ved DEER forsøk ved pH 7,0 er vist i figur 7. Ettersom det er fem ring etiketter i GLIC pentameren, av minst to avstander er forventet.; en tilsvarende de tilstøtende subenheter og den andre fra ikke-sammenhengende subenheter, selv flere topper kan oppstå fra alternative rotameric spinn orienteringer. Hjort signal brytes ned og de tilsvarende sannsynlighetsfordelinger vises. Den første kortdistanse peak (~ 42A) som representerer avstandene mellom tilstøtende subenheter, og den andre topp (~ 53a) svarer til de ikke-tilstøtende avstand. Toppen for diagonal avstand ser ut til å være på kortere avstand, og dette er trolig undervurderes fordi pålitelige målinger utover 60 Åer ikke gjennomførbart under eksperimentelle forhold på grunn av tekniske problemer med bakgrunn korreksjon.

Figur 1
Figur 1. Biokjemisk karakterisering Spin-merket GLIC Mutants. (A) Representant gelfiltrering kromatogram av spin-merket-GLIC etter proteolytisk spalting av MBP tag. Toppene tilsvarer GLIC pentamer og gratis MBP. (B) SDS-PAGE viser uncut monomere GLIC-MBP fusjonsprotein (før gelfiltrering) og MBP og GLIC fraksjoner samlet fra gelfiltrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. FR ET baserte analysen for overvåking av samlings staten GLIC Rekonstituert i ulike membranlipider. Slite målinger er vist for prøver etter O / N tilberedning (til venstre) og etter frysing / tining av prøvene (til høyre). (Modifisert fra den opprinnelige figuren). 43 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Makroskopisk Behavior av GLIC i Proteoliposomes. I en inside-out patch fjernet fra rekonstituert asolectin vesikler, er GLIC aktiveres ved pH hopp bruke en rask løsning leren. Kanalene er sett til å aktivere i ~ 10 ms og desensitize med en tidskonstant på 1-3 sek. (Modifisert fra den opprinnelige figuren). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Strukturelle rearrangementer Under kanalaktivering. (A) Representative CW-EPR-spektra for en stilling i pore foring M2 helix, som viser endringer i amplitude og linjeformer som reaksjon på pH-endringer. I hvert tilfelle er spektrene er normalisert til det totale antall spinn. Spin-merket posisjon er vist som en svart sirkel. Bare to underenheter er vist for oversiktens skyld. (B) EPRspectra vise bipolart utvidelse av spin-spin interaksjoner. Spektrene i stiplet linje var fra under-merkede kanaler (i nærvær av diamagnetiske etiketter) og på fast-linje var fra fullt merkede kanaler. Det innfelte viser en overlapping av amplitude-normalisert spektra. Utvide henhold fullt merket forhold er høytent med piler. Scan bredde er 150 G. (modifisert fra den opprinnelige figuren). 36 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Residue Spesifikk Miljøparametere Målte av Power metning. Målinger av spektral bredde (AH 0) og væske tilgjengelighet (P 1/2) for to kontrasterende stillinger i M4 helix av trans domenet. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Figur 6
Figur 6. miljø en representant Loop C Residue i det ekstracellulære domenet av GLIC. Spin-normalisert CW-spektra og de ​​tilsvarende målinger tilgjengelighets for L180R1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. avstandsmålinger av Pulsed-EPJ tilnærminger (hjort). GLIC struktur som viser plasseringen av Phe314 og tilsvarende cβ-cβ avstander for tilstøtende og ikke-tilstøtende subenheter. CW-spektra for denne stillingen er vist til høyre. Bakgrunn trekkes DEER- ekko intensitet er plottet mot evolusjonen tid og plass ved hjelp av modell-fri Tikhonov regularisering for prøvene i vaskemiddel. Den tilsvarende inter-spin avstand distribusjon (til høyre).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EPR-spektroskopi har vist seg å være en enestående strukturell tilnærming i kvantifisering konformasjonsforandringer endringer i membranproteiner i en tilnærmet opprinnelig miljø. Denne tilnærmingen gir oss en titt inn i de molekylære detaljene for protein dynamikk som er skjult i høy oppløsning strukturer fra røntgenkrystallografi og Cryo-elektronmikroskopi. Det er imidlertid viktig å vurdere de tekniske begrensningene i denne tilnærmingen som kan påvirke den generelle anvendbarhet til andre systemer, og også huske på de potensielle eksperimentelle veisperringer på veien. Vi diskuterer noen av disse aspektene nedenfor sammen med anbefalte strategier for feilsøking.

Blant de mer vanlige problemene som man møter med en teknikk som involverer omfattende mutasjons perturbasjoner er lavt utbytte og dårlig oligomere stabilitet av proteinet. Dette aspektet blir ytterligere forverret når du arbeider med komplekse multimere membran proteiner som ionekanaler. Det er therefore avgjørende å optimalisere disse to biokjemiske aspekter før du tar fatt på en utbredt mutagenese. Vi fant at uttrykket av giftige GLIC mutanter er bedre tolerert i C41 og C43 stammer av BL21 celler 3,36 Videre senke post-induksjon temperaturen til 15 den -. 18 ºC, redusere IPTG konsentrasjonen til 100 mikrometer, og med 5% glyserol under induksjon synes å hjelpe til med å senke proteinaggregering sannsynligvis ved å redusere frekvensen av proteinekspresjon og redusere omfanget av misfolding. Cystein-mutasjoner ved visse posisjoner (særlig i gjennomtrengelighet pathway) har vist seg å øke den konstitutive aktiviteten av kanalen og disse mutanter komme til å utgjøre større hindringer i uttrykket. Bruk av toverdig pore blokkere (10-25 mM Ba 2+) i løpet av induksjon lindrer giftighet og forbedrer cellevekst 57 Disse strategiene har vist seg effektive i mange tilfeller på å øke utbyttet, senke protein aggregering og styrke oligo.meric stabilitet. 36,58

En annen kritisk trinn i SDSL er effektiviteten av merkingsprosessen. Mens overflate eksponert cysteiner bør utgjøre noe problem i MTSL reaktivitet (> 90% merking utbytter), kan posisjonene hvor cystein-sidekjeder er nedgravd og utilgjengelige krever høyere spin-label konsentrasjoner og lengre inkubasjonstider. Økning av spin-markør-konsentrasjonen til 30-ganger molart overskudd og inkubering O / N ved 4 ° C hjelper til med å forbedre effektiviteten merking. I tillegg er det også viktig å måle spektrene til den merkede Cys-mindre mal for å bestemme bakgrunnsbidrag. For områder som er dårlig merket (<10%), bakgrunnssignalet overvelder den generelle spektra. Selv om bestemmelse av spin-merking effektivitet, merk at nøyaktigheten påvirkes av en rekke faktorer som inkluderer prøvevolum, prøve-kapillær diameter, anbringelse av kapillaren i resonatoren, hulrom temperatur, og resonator Qverdi (som er forholdet mellom den energi som er lagret i den over den energi avgis ut). Forsiktighet må utvises for å opprettholde disse betingelser som er identiske mellom prøvene og standard. Videre skal det bemerkes at for immobile områder, der spektrene er egentlig bred, nøyaktigheten av målingen merking synker ytterligere. Alternativt kan Liquid Chromatography Time of Flight-elektrospray ionisering massespektrometri (LCT-ESI-MS) anvendes for å direkte bestemme molekylmasse og dermed merking effektivitet. Imidlertid er det MS følsomhet utsatt for prøver i vaskemidler og for tett foldet membranproteiner.

Når mutantene blir renset som en homogen populasjon, er det viktig å fastslå den funksjonaliteten av preparatet. Patch-klemme målinger av ringmerkede mutanter i viktige deler av kanalen vil avdekke effekten av forstyrrelse på ligandaffinitet og kanal gating. Alternativt kan kanal egenskaper studeres i Sort Lipid Membraner (BLM) 59 eller ved å injisere proteoliposomes inn i oocytter og måling av strømmer ved to-elektrode spennings-klemme. 59-61 Dersom det blir funnet at cystein substitusjon og spin-label ved visse posisjoner forandre ligand-følsomhet eller ledekinetikk kanaler, eksperimentelle betingelser (ligand-konsentrasjon, modulatorer, lipider sammensetning) kan varieres passende for å stabilisere den konformasjonelle tilstand som undersøkes. Videre skal det bemerkes at EPR-målinger utføres under konstante forhold, og derfor endringer i raske kinetikk av kanalen er mindre sannsynlig for å påvirke den strukturelle tolkning.

Åpenbart en hovedfordel med denne teknikken er evnen til å studere kanal dynamikk i membraner av definert sammensetning og for direkte å undersøke hvordan lipid-medierte effekter på dynamikk endrer kanalfunksjon. Imidlertid er en begrensning at noen lipid- blandinger kan føre til sideveis aggregering av kanaler on membranen og dermed egnetheten av lipider må fastslås. 45 For betingelser som forårsaker aggregering, senking protein til lipid-forhold, å utføre rekonstitusjon ved lavere temperatur, og forkorte varigheten av rekonstitusjonstiden kan bidra til å opprettholde kanalene monodisperse 62 Alternativt kan kanalene bli rekonstituert i nanodiscs, som er nanoskala lipid-sammenstillingene som er omgitt av en ring av amfipatisk membran scaffoldprotein (apolipoprotein A1). 63 ved å optimalisere det molare forhold av kanalen protein, lipidbestanddeler, og membran stillas protein, det er mulig å oppnå en homogen og mono-disperse populasjon av enkeltkanalenheter inkorporert i individuelle nanodiscs. Dette system har flere andre fordeler ved at de nanodiscs er optisk klare og gir lett tilgang til både intracellulære og ekstracellulære sider av membranen.

Til slutt, ved nivåetav EPJ-målinger, kan man bli møtt med CW-EPR-spektrene som ikke er lett å tolke, spesielt for stillinger viser multikomponent spektra. En slik konformasjonelle heterogenitet kan oppstå fra sakte utveksling av konformasjonen av proteinet eller / og flere orienteringer av spin-etiketten i et gitt protein conformation. Bestemme andelen de to scenariene er ikke trivielt, og kan kreve bruk av alternative spin-label derivater, eller endre eksperimentell temperatur, 64 trykk, 65 feltstyrker / mikrobølgeovn frekvens, 66 eller ved osmolyte forstyrrelse. 67

Videre kan DEER målinger i liposomer være begrenset av en rekke faktorer, deriblant lavere følsomhet, høyere bakgrunnsbidrag som skyldes forbedrede intermolekylære interaksjoner, og en reduksjon i målbar avstandsområde (<50Å). Generelt for lengre avstander (<50 A), er det storer usikkerhet i bredder på avstanden fordeling på grunn av utilstrekkelige dipolare evolusjon ganger. Imidlertid har bruken av Q-bånd (34 GHz) mikrobølgefrekvens og merking med et bifunksjonelt spinn etikett (med redusert indre dynamikk) er blitt vist å lindre noen av disse begrensningene. 54 rekonstituering i nanodiscs har også vist seg å enormt forbedre DEER følsomhet av redusere bakgrunns bidrag som oppstår fra inter dipolare interaksjoner. 15

Til tross for disse begrensninger, SDSL / EPJ-studier, særlig i systemer med noen innfødte cysteiner, har vist seg å være utrolig lærerikt. Fremtidige teknologiske fremskritt er rettet mot å tilpasse dette kraftfull tilnærming til å studere mer komplekse menneskelige kanaler, hvor muterende innfødte cysteiner ikke kan være gjennomførbart. I denne forbindelse, utvikling av alternative strategier for merking, slik som de basert på sete-spesifikk innlemmelse av unaturlige aminosyrer, 68 eller synthesis av etiketter som er rettet mot andre aminosyrer, 69 ser ut til å holde store løftet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlig til de nåværende og tidligere medlemmer av Chakrapani lab for kritisk lesing og kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend (1R01GM108921) og American Heart Association (NCRP Forsker Development Grant 12SDG12070069) og til SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics