Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Termokjemiske studier av Ni(II) og Zn(II) ternære komplekser ved bruk av ionemobilitet-massespektrometri
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen beskriver en eksperimentell protokoll ved hjelp av elektrospray-ion mobilitet-massespektrometri, semi-empiriske kvanteberegninger og energioppløst terskelkollisjonsindusert dissosiasjon for å måle den relative termokjemien til dissosiasjonen av relaterte ternære metallkomplekser.
Transcript
Denne nye teknikken kombinerer ionmobilitet-massespektrometri med molekylær modellering og reaksjonsdynamikkteori for å bestemme den relative termokjemien til to konkurrerende dissosiasjonsreaksjoner i et ternært kompleks. Kombinasjonen av disse teknikkene karakteriserer reaktantene og produktenes reaksjonsveier, konformasjonsstrukturer og ligandens affinitet til å danne et ternært kompleks med metallionet. Denne forskningen modellerer reaktiviteten til to potensielle peptidmerker for rekombinant proteinrensing, hvor taggen reagerer med metallet chelatert av nitrilotrieddiksyre i en immobilisert metallaffinitetskolonne.
Begynn med å legge 2 milliliter prøven inn i en 2,5 milliliter stump nesesprøyte og injisere prøven i elektrosprayen til instrumentet ved hjelp av instrumentets sprøytepumpe med en strømningshastighet på 10 mikroliter per minutt. Plasser instrumentet i negativ ionemobilitet-massespektrometri, eller IM-MS-modus. Identifiser masse-til-ladning-isotopmønsteret til det negativt ladede alternative metallbindende ternære komplekset, eller amb-metal-NTA-komplekset, ved å åpne massespektrometriprogrammet og velge Spectrum.
Velg deretter Verktøy etterfulgt av Isotopmodell. I popup-vinduet, oppgi molekylformelen til komplekset, merk av i boksen for Vis ladet ion, skriv inn 1 for ladningen av den negative, og klikk på OK.In det viste isotopmønsteret til komplekset, merk den laveste massetoppen. I instrumentprogramvaren velger du Oppsett etterfulgt av Quad Profile.
Velg deretter Manuell fast og skriv inn massen til den laveste isotopiske mønstertoppen. Klikk på Oppdater og lukk vinduet. Igjen, velg Oppsett, og klikk deretter på Løse Quad.
Samle opp IM-MS-spektraene med det negative ionet som starter med den første overføringskollisjonsenergien ved hjelp av en 5-minutters kjørevarighet og 2-sekunders skannetid. Gjenta for å samle IM-MS-spektrene for hver av de andre kollisjonsenergiene. Bruk de integrerte ankomsttidsfordelingene, eller ATD-områdene, for det ternære amb-metall-NTA-komplekset og to produkter, NTA-metallkompleks og amb-metallkompleks, for å normalisere til en relativ prosentskala.
Fra replikasjonsterskelen kollisjonsindusert dissosiasjon, eller TCID-målinger, finn gjennomsnittet og standardavvikene for hvert datapunkt. Konverter deretter lab-frame-overføringskollisjonsenergien til massekollisjonsenergien. For å måle kollisjonstverrsnitt, samle de negative ion IM-MS-spektrene til 10 ppm poly-DL-alanin, eller PA-prøven, i 10 minutter ved hjelp av de instrumentelle driftsforholdene.
Deretter samler du IM-MS-spektrene til hvert ternært kompleks i 5 minutter. Pakk ut ATD for hvert av PA- og ternære kompleksene og eksporter filene deres til massespektrometriprogramvaren ved hjelp av alternativet Behold driftstid. Finn gjennomsnittlig ankomsttid fra maksima for de tilsvarende ATD-kurvene.
Bruk en tverrsnittskalibreringsmetode for å konvertere gjennomsnittlig ankomsttid til kollisjonstverrsnitt av det ternære komplekset. Fra CRUNCH-hovedmenyen åpner du GB5-tekstfilen som inneholder energien til massesenteret, eller ECM-avhengige relative intensiteter av produktene. Svar Nei for å lese parametere.
Velg deretter Modellering etterfulgt av Angi alle parametere. Fra reaksjonsmodellalternativene velger du standardalternativet Threshold CID etterfulgt av RRKM med integrasjon over energioverføringsfordelingen til det ternære komplekset. Angi 2 for uavhengige produktkanaler modellert, og velg Beregn tverrsnitt.
For typen uinnviklet modell, velg 0 Kelvin-tverrsnitt, som inkluderer den statistiske RRKM-korreksjonen av kinetiske skift på grunn av tidsvinduet på 50 mikrosekunder fra kollisjonscellen til flytidsdetektoren. For konvolusjonsalternativene, velg Tiernans dobbeltintegral, som inkluderer konvolusjonen over translasjonelle energifordelinger mellom det ternære kompleksionet og argonkollisjonsgassen. For den numeriske integreringsmetoden velger du Gaussisk kvadratur med forhåndslagrede tverrsnitt.
Fra alternativene for å legge inn molekylparametrene, skriv inn G for å lese strukturmodelleringsfilen med PM6 vibrasjons- og rotasjonsfrekvensene til det ternære komplekset. Svar Ja på spørsmålet:Er en av reaktantene atomære? Skriv plasseringen og navnet på modelleringsfilen.
Angi 1 for ladningen på ion og 1.664 for polariserbarheten til argongassen. Massen av ion og masse av målet er for henholdsvis ternær kompleks og argon, og leses automatisk fra GB5-tekstfilen. Skriv inn 0 for harmoniske vibrasjoner.
Trykk Enter for å lese 1-D og 2-D rotasjonskonstantene fra strukturmodelleringsfilen. Velg standardverdier på 0 for de hindrede rotorbehandlingene og 1 for molekylsymmetri. Velg standard 300 Kelvin for reaktanttemperatur.
Velg Integrering for metoden for reduksjon av tetthet av tilstandsmatrise. Velg Ja for å avkorte energifordelingen. Angi 40000 bølgetall for maksimal energi for distribusjon, 2 bølgetall for binstørrelse og 32 for antall punkter i energifordeling.
For parametere for TCID/RRKM-modell velger du Ja for endring, angir 0 for Fast tid og 0,000050 sekunder for den øvre grensen for registreringsvinduet. For produktkanal 1 velger du 1 for én enkelt overgangstilstand fra alternativene for dissosiasjonskanal og 0 for ingen av de sekvensielle dissosiasjonene. For overgangstilstandstypen velger du 1 for bane.
Velg G for å lese modelleringsprogramfilene som inneholder PM6-rotasjons- og vibrasjonsparametrene for amb-metallkomplekset pluss NTA-produkter. Skriv inn Nei for:Er en av faseromsgrenseovergangstilstanden, eller PSL TS, arter atomære? Skriv inn plasseringen og navnet på amb-metal kompleks fil.
Bruk 1.062 for skalafrekvenser, trykk Enter for antall atomer, og skriv inn Nei for: Er molekylet lineært? Gjenta det samme for modelleringsfilen som inneholder vibrasjons- og rotasjonsfrekvensene til NTA-produktet. Skriv inn beskrivelsen av bane TS. Skriv inn 1.0 for ladning av amb-metallion, og skriv deretter inn polariserbarheten og dipolmomentet til NTA.
Velg 0 Kelvin for rotasjonstemperatur og låst dipol for behandling av overgangstilstanden i bane. Skriv inn de gjennomsnittlige massene av amb-metallionet og NTA. Trykk Enter for å lese 1-D og 2-D rotasjonskonstantene fra modelleringsfilene.
Velg 0 for hindrede rotorer, 1 for molekylsymmetri og 1 for reaksjonsdegenerasjon. Skriv inn alternativet Ingen endringer. For produktkanal 2 velger du 1 for enkel overgangstilstand, 0 for ingen for sekvensiell dissosiasjon og 1 for bane for overgangstilstandstypen.
Velg G for å lese i modelleringsfiler som inneholder PM6-rotasjons- og vibrasjonsparametrene for NTA-metallkomplekset og amb-produktene. Skriv deretter inn beskrivelsen av TS i bane. Skriv inn 1.0 for ladning av NTA-metallkompleksion, og skriv inn polariserbarheten og dipolmomentet til amb. Velg 0 Kelvin for rotasjonstemperatur og låst dipol for behandling av baneovergangstilstanden.
Skriv inn de gjennomsnittlige massene til NTA-metallkomplekset og amb-produktene. Trykk Enter for å lese 1-D og 2-D rotasjonskonstantene fra modelleringsfilene. Velg 0 for hindrede rotorer, 1 for molekylsymmetri og 1 for reaksjonsdegenerasjon.
Skriv deretter inn Ingen endringer. Hvis du vil håndtere inaktive 2D-rotasjoner, velger du standardalternativene for statistisk vinkelmomentfordeling og integrerer P-E, G over J-fordeling. Bruk standardverdien 32 i antall poeng i integreringen.
På Modell-menyen velger du Optimaliser parametere for å tilpasse data, og angir henholdsvis minimum energi og maksimal energi for å starte og avslutte datatilpasningen. Velg 1 for vektingsmodellenes eksperimentelle standardavvik. Basert på dataene velger du et minimum akseptabelt standardavvik på typisk 0,01 til 0,001.
Bruk standardverdien for E0-konvergensgrensen, og velg Nei for å holde en parameter til nåverdi, 0,5 og 2,0 elektronvolt for nedre og øvre grense og 2 for den deriverte evalueringsmetoden. Fra Optimalisering-menyen velger du Start optimalisering. CRUNCH-programmet vil optimalisere den valgte TCID-modellen til eksperimentelle data.
Til slutt, i modellmenyen, velg delta-H og S ved T for den termokjemiske evalueringen av de to dissosiasjonskanalene. Det representative bildet viser de primære strukturene av alternative metallbindende A- og H-peptider. Fargen fremhever de potensielle metallbindingsstedene.
Energiavhengigheten for å danne amb-metall- og NTA-metallproduktionene er vist her. Massekollisjonsenergien, der det er 50% dissosiasjon av amb-metal-NTA ternære komplekset, er inkludert i grafene. De representative bildene viser dynamikkmodellen for den energioppløste TCID-metoden.
Kollisjonene mellom ambH-sink-NTA-komplekset pluss argon resulterer i dissosiasjon til ambH-sinkkomplekset og fri NTA, eller NTA-sinkkompleks og fri ambH-produkter. Terskelenergiene E1 og E2 tilsvarer 0 Kelvin-entalpiene av dissosiasjon for reaksjonene ambH-sink-NTA-kompleks til ambH-sinkkompleks og fri NTA, eller ambH-sink-NTA-kompleks til henholdsvis NTA-sinkkompleks og fri ambH. De PM6-geometrioptimaliserte ternære amb-metall-NTA-kompleksene av A og H er vist her.
Disse konformatorene ble brukt i TCID-modelleringen av eksperimentelle data og ble valgt fra andre kandidatstrukturer ved å sammenligne deres PM6 elektroniske energier og hvordan deres beregnede kollisjonstverrsnitt sammenlignet med IM-MS målte kollisjonstverrsnitt. Den energioppløste TCID-en til de fire amb-metal-NTA-kompleksene er avbildet i disse bildene. For art A og H er produktionene av amb-metall og NTA-metall med de innviklede CRUNCH-terskeltilpasningene vist her.
Energiverdiene er entalpiene av dissosiasjon ved 0 Kelvin for reaksjonene amb-metal-NTA til amb-metal og free NTA, eller amb-metaL-NTA til NTA-metal og free amb. En sammenligning av Gibbs frie assosiasjonsenergier i kilojoule per mol og formasjonskonstanter avledet fra dissosiasjonens entalpier, netto null Kelvin, med statiske mekanikkberegninger ved bruk av PM6-parametrene, er vist her. Reaksjonen av NTA-nikkel og fri ambA for å danne ambA-nikkel-NTA-komplekset utviser den høyeste formasjonskonstanten og representerer reaksjonen der det ambA-merkede proteinet immobiliseres av NTA-nikkel inne i affinitetskolonnen.
CRUNCH-tilpasning krever nøye screening av reaktanter og produkter for å oppnå nøyaktige terskelenergier. Ekspertise innen molekylær modellering for å oppnå strukturer og pålitelige molekylære parametere er nødvendig. De overordnede metodene beskrevet her kan utvikles for å screene effektiviteten av molekyler designet for å binde metallkofaktorer og aktive steder av proteiner for å blokkere de enzymatiske funksjonene.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
