Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

As células T reguladoras (Treg), que expressam Foxp3 como um factor de transcrição, são subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempenham um papel crucial na tolerância imunitária e a manutenção da homeostasia através da regulação da resposta imunitária. A função primária de células T REG é o de suprimir a proliferação de células T (FEP) T efectoras e a produção de citocinas tais como IFN-γ, TNF-α, e IL-2. Tem sido demonstrado que a capacidade das células T reg 'para inibir a função das células T ef é aumentada durante a infecção persistente de agentes patogénicos e o desenvolvimento do cancro. Para esclarecer a função das células T reg sob repouso ou inflamadas condições, uma variedade de ensaios in vitro utilizando células de supressão de reg do mouse ou T humana foram concebidas. O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método para comparar as diferenças de fenótipo e função supressora entre descanso e reg T ativadascélulas. Para isolar as células T ativadas reg, camundongos foram infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) clone 13 (CL13), a tensão crônica de LCMV. Células T reg isoladas a partir do baço de ratinhos infectados por LCMV-CL13 exibiu tanto o fenótipo activada e actividade supressora melhorada em comparação com as células em repouso reg T isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Aqui, descrevemos o protocolo básico para ex vivo análise de fenótipo para distinguir células T ativadas reg de descansar células T reg. Além disso, descreve-se um protocolo para a medição da actividade supressora de células T reg totalmente activadas.

Introduction

As células T reguladoras (T reg) expressam caixa de forkhead P3 (Foxp3) como um fator de transcrição para o seu desenvolvimento e função 1. Além disso, as células reg T expressam várias outras moléculas, tais como CD25 2, gene de linfócitos-activação 3 (LAG-3) 3, tumor do receptor do factor de necrose induzida por glucocorticóides 4, e citotóxica-T-linfócito proteína associada 4 (CTLA-4) 5 na sua superfície ou a região intracelular. Durante a infecção crónica com vários tipos de agentes patogénicos, tais como vírus, bactérias 6,7 8,9 e parasitas 10-12, ou no curso de desenvolvimento de câncer 13,14, as células T reg tornar-se diferenciado em células ativadas, exibindo função supressora reforçada As células alvo efetoras CD4 + e CD8 +. Um número de estudos sugerem que as células T reg expandido e de contribuir para os respons de células T CD8 + com deficiênciae durante amigo retrovírus (FV) infecção por 15-17. As células T-reg induzidas FV inibir IFN-γ ou expressão granzima B e reactividade citotóxica de células T CD8 + 15-17. Além disso, num modelo de infecção pelo vírus herpes simplex, foi relatado que a depleção de células T CD4 + reg CD25 + resultou na expansão das células T CD8 + específicas do vírus e lesões graves no tecido por infiltração de células T CD4 + imunopatogênicos 18-20.

Os ratinhos infectados cronicamente com o clone 13 de estirpe do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV CL13) 21-24 têm sido amplamente utilizados para caracterizar o fenótipo e função de células T efectoras (T) e células eff reg T durante a infecção crónica de vírus. Durante a infecção LCMV persistente, células eff específico do vírus T progressivamente perdem a sua função efetora e tornar-se células esgotadas T (T exh). Por outro lado, tcélulas reg reforçar a sua capacidade de suprimir a resposta de células específicas do vírus T 25. A diminuição da capacidade de funcionamento das células eff T pode ser explicada por vários factores, tais como sobre-regulação de receptores inibitórios sobre células eff T, função alterada das células apresentadoras de antigénio, da produção de citocinas imunorreguladoras, e frequência aumentada ou função aumentada de reg t As células 26. Entre os factores envolvidos na supressão de células T, a morte celular programada proteína-1 (DP-1) -expressing EXH células T e células T reg têm sido amplamente consideradas como características de persistência do antigénio e ambiente supressiva. Recentemente, relatou-se que o bloqueio da via de DP-1 e de ablação de células T reg levar a função de células T aumentada e diminuição da carga virai durante a infecção crónica por LCMV 27. Além disso, as células T reg são activadas durante a infecção crónica de ratos com LCMV 23,25 25. DP-1 é altamente expressa em células T reg, bem como células T de escape, e o nível de DP-1 expressa por células T reg correlaciona-se com a força da sua função supressora de inibir a proliferação de células T 25.

Aqui, nós descrevemos um método para comparar as características de células T activadas reg isolados a partir de camundongos infectados com LCMV CL13 e as células T em repouso reg isoladas a partir de ratinhos ingénuos. Além disso, vamos explicar uma série de processos para separar as células T activadas e reg examinar o seu fenótipo ex vivo, bem como medir a sua actividade supressora in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Neste estudo, os ratos foram mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes Korean Food and Drug Administration usando protocolos aprovados pelo Comitê Internacional Animal Care e Uso do Centro de Pesquisa Animal Yonsei Laboratory da Universidade de Yonsei.

1. Preparação de Soluções

  1. Preparar 2% de meio RPMI por diluição de soro fetal de bovino (FBS) a 2% e penicilina-estreptomicina a 1% em meio RPMI
  2. Prepare meios RPMI completo. Para RPMI meios adicionar 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol.
  3. Prepare activadas por fluorescência separação de células de tampão (FACS). Para o fazer de modo salina, suplemento de fosfato tamponada (PBS) com 2% de FBS.
  4. Preparar tampão de isolamento de células T. Para fazê-lo, complementar PBS com 2% de FBS e 2 mM de ethylenediaminetetraaácido cetic.

2. Isolamento de Linfócitos esplénico

  1. Remover os baços de ratinhos ingénuos ou CL13 LCMV-infectadas, tal como descrito anteriormente 19 e colocá-los em 60 mm x 15 mm de placas de Petri contendo 10 ml de 2% de meio RPMI.
    Nota: Neste estudo experiências, de 5 a 6 semanas de idade C57B1L / 6J ratinhos fêmea receberam 2 x 10 6 unidades formadoras de placas (pfu) do LCMV CL13 através de injecção intravenosa através da veia da cauda. Sacrificar os ratinhos no dia 16 pós-infecção (16 d pi) 25. camundongos normais analisar ge-combinados foram no mesmo dia.
  2. Coloque um filtro de células para um tubo de 50 ml e lavado com 2 ml de 2% de meio RPMI. Colocar o baço no filtro celular de 70 ^ m e moer usando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro de células com 2 ml de 2% meio RPMI e removê-lo do tubo de 50 ml.
  3. Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender osedimento celular em 1 ml de tampão de lise ACK. Incubam-se as amostras à temperatura ambiente (TA) durante 5 min.
    NOTA: O volume de tampão de lise ACK indicado acima é para um baço. Ampliar o volume de conformidade para as amostras de baço agrupadas.
  4. Encher o tubo com 2% de meio RPMI e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml em meio RPMI completo.
    NOTA: Para a contagem de células vivas, células mancha com azul de tripano e contar apenas as células que não estão manchadas usando hemocitômetro viver.

3. A fenotipagem de Esplênica T convencional (T conv) e células T reg

NOTA: antes do isolamento das células T reg, analisar o fenótipo dos linfócitos do baço isoladas a partir de murganhos naive ou infectadas por coloração das células com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo.

  1. Transferir 50 uL das células(5 x 10 5 células) no total de linfócitos do baço em cada poço de uma nova placa de 96 poços de fundo em U e adicionar 150 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
  2. Descartar o sobrenadante. Agita-se a pelete de células e adicionar 200 ul de tampão de FACS por poço. Centrifuga-se a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (2 vezes).
  3. Prepara-se o cocktail de anticorpos para marcadores de superfície celular de coloração em 50 ul de tampão de FACS por poço com os seguintes anticorpos e reagentes. corante violeta anti-CD4, anti-CD25 corante verde, anti-DP-1 de corante violeta, anti-CD8-PerCP Cy5.5 corante reagente de detecção e viabilidade celular perto do infravermelho (IR) corante reactivo fluorescente.
    NOTA: Para analisar melhor o fenótipo de células T ativadas reg, anti-CD103 23,25 podem ser adicionados para a coloração de superfície celular marcador.
  4. Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de coquetel de anticorpo por poço. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavar as células duas vezes comtampão FACS por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
  5. Após o passo de lavagem final, decanta-se o sobrenadante e as células fixar durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação preparados de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Lavar as células duas vezes com o tampão de lavagem permeabilização (preparado de acordo com o protocolo do fabricante) por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C.
  7. Preparar a solução de anticorpos para a coloração intracelular Foxp3, e ressuspender o sedimento de células com 50 uL de solução de anticorpo anti-Foxp3.
    NOTA: Para analisar melhor os fenótipos dos conv T e células T reg, anti-CTLA podem ser adicionados nesta etapa.
  8. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C e repetir o passo 3.6. Após o passo de lavagem final, ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF e analisar o fenótipo das células por citometria de fluxo 25.
  9. Portão da popula de células vivasção. Para a análise dos fenótipos de células T conv durante a infecção LCMV CL13, examinar a frequência de Foxp3 - PD-1 + células entre as células CD4 + ou T CD8 +.
    NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 - PD-1 + é mais do que 50% em populações de células CD4 + e CD8 + aos 16 d pi com LCMV CL13.
    1. Para analisar a freqüência e fenótipos de células T reg, analisar as frequências de Foxp3 + ou Foxp3 + PD-1 + células entre as células T CD4 +.
      NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de Foxp3 + ou + PD-1 + células Foxp3 é mais do que 20% da população de células T CD4 +, respectivamente.

4. Isolamento de células reg CD4 + CD25 +

NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para umao número inicial de células de 1 x 10 7 esplenócitos totais.

  1. Prepare as células como descrito na seção 2, utilizando camundongos cronicamente infectados ingênuas e LCMV. Lavam-se as células por adição de 10 ml de tampão de isolamento de células T. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 40 ul de tampão.
  2. Para o enriquecimento de células T CD4 + utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo e misturar bem. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 30 ul de tampão, 20 ul de anti-biotina micro-esferas para marcação das células não-T CD4 + e 10 ul de anticorpo CD25-PE para marcação fluorescente de células CD25 +. Misturar bem e incubar durante 15 min no escuro.
  4. Adicionar 2 ml de tampão e passar as células através de um filtro de 40 | iM de células para um novo tubo de 50 mL para remover os detritos celulares. Lavam-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1,25 x 10 8 células.
  5. Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente as isoladas células T CD4 + em 90 ul de tampão.
  6. Para a marcação magnética de células CD25 +, adicionar 10 ul de microesferas anti-PE, misturar bem e incubar durante 15 min no escuro a 4 ° C.
  7. Adicionar 2 ml de tampão e lava-se as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento celular em 500 ul de tampão, a uma densidade de até 1 x 10 8 células.
  8. Para enriquecer as células reg CD4 + CD25 + T, se aplicam as células para a coluna para a selecção positiva, e lava-se a ColumN pela adição de 2 ml de tampão. Repetir a lavagem três vezes.
  9. Quando a coluna está vazio após o passo de lavagem final, adicionar 1 ml de tampão para a coluna, e expulsar o magneticamente marcada CD4 + CD25 + usando o êmbolo.
  10. Repita os passos de 4,8-4,9 para melhorar a pureza das células CD4 + reg CD25 + isoladas. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células isoladas reg CD4 + CD25 + a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml em meio RPMI completo.
  11. Para verificar a pureza das células isolado reg-CD4 + CD25 +, utilizar 2 x 10 5 células a partir de células totais os reg isolado-CD4 + CD25 +. Corar as células com 50 uL de tampão de SCAF contendo anti-CD4-FITC e a viabilidade celular reagente de detecção IV próximo corante reactivo fluorescente.
    NOTA: CD25 já foi marcado com PE durante o isolamento.
  12. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de SCAF e verificar a pureza por citometria de fluxo.
  13. Portão da população de células vivas. Para analisar a pureza das células T reg, confirmar a percentagem de células CD4 + CD25 +.
    NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD4 + CD25 + purificadas entre as células é superior a cerca de 80%.

5. Isolamento de células T CD8 + e marcação de células T CD8 +

NOTA: Os volumes de todos os reagentes indicados a seguir são para um número de células de partida de 1 X 10 7 esplenócitos totais.

  1. Prepare células como descrito na seção 2, utilizando camundongos normais. Lavam-se as células por adição de 10 ml de lustre isolamento de células Ter. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante completamente, e ressuspender o sedimento celular em 40 ul de tampão.
  2. Para o isolamento de células T CD8 + utilizando o sistema de separação magnética de células, adicionar 10 ul de coquetel de biotina-anticorpo para a marcação de células não-T CD8 + e misturar bem. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 30 ul de tampão e 20 ul de microesferas anti-biotina. Misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° C.
  4. Aplicar as células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. Lava-se a coluna por adição de 2 ml de tampão três vezes.
  5. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender completamente os isolados de células T CD8 + em 2 ml de tampão.
  6. Para verificar a pureza das células isoladas, preparar 50 ul de solução de anticorpo em tampão de FACS. Ressuspender as 2 x 10 5 células entre isolado CD8 + T celLS em 50 ul de solução de anticorpo.
    NOTA: Para preparar solução de anticorpo, adicione anti-CD8 FITC, e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS.
  7. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C. Lavam-se as células com tampão de SCAF por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após a lavagem, ressuspender o sedimento celular em 100 ul de tampão de FACS, e verificar a pureza das células por citometria de fluxo.
  8. Portão da população de células vivas. Para controlar a pureza das células T CD8 +, confirmar a percentagem de células T CD8 +.
    NOTA: Com base nos resultados experimentais, a percentagem de células CD8 + purificadas é entre células ao longo de cerca de 90%.
  9. Adicionar PBS para as células T CD8 + isoladas. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células T CD8 + isoladas a uma concentração de 1 x 10 7 células / ml em PBS.
  10. Para identificar o ce CD8 + Tlls para o ensaio de supressão in vitro, dilui-se a proliferação celular corante de rastreio violeta em PBS para obter uma concentração de 5 | iM à temperatura ambiente.
    NOTA: Os picos de excitação e de emissão aproximadas do corante de rastreio violeta proliferação de células utilizado no estudo são 405 e 450 nm, respectivamente.
  11. Misture bem volumes iguais de proliferação celular corante de rastreio violeta (5 uM) e suspensão de células (1 x 10 7 células / ml de células T CD8 +) em um tubo de 15 ml, e incuba-se a 20 min a 37 ° C. Vortex do tubo a cada 10 min.
  12. Encher o tubo com frio meio RPMI completo, e deixar o tubo durante 10 minutos à TA. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante completamente, e voltar a suspender as células a uma concentração de 2 X 10 6 células / ml com meio RPMI pré-aquecido completas. Incubam-se as células durante 15 minutos à TA.

6. Configurar o Ensaio In Vitro Supressão Usando CD4 + CD25 + T <sub> reg e células T CD8 +

  1. Para preparar anti-CD3 / esferas revestidas com CD28, transferir o volume apropriado de contas magnéticas para um tubo de 15 ml (2,5 ul / 1 x 10 5 células). Adicionar um volume igual de PBS e misturar. Lavar por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Dilui-se a contas magnéticas em meio completo (50 uL / ​​poço).
  2. Alíquota de 50 ul de células reg CD4 + CD25 + por poço da placa de 96 poços de fundo em U (1 x 10 5 células / poço). Adicionar 50 ul de células T CD8 + como resposta T (respectivamente t) células por poço (1 x 10 5 células / poço). Adicionar 50 ul de anti-CD3 / esferas revestidas com CD28 diluído em por poço.
    NOTA: Nesta etapa, etiqueta e configurar poços de controlo da seguinte forma: "Somente não estimulada de células CD8 + T" sem anti-CD3 / esferas revestidas com CD28; "Única célula T CD8 +" com anti-CD3 / CD28-esferas revestidas; Apenas "células T CD8 +"Com anti-CD3 / esferas revestidas com CD28;". Cell Reg t apenas "com anti-CD3-/ esferas revestidas com CD28 células reg T pode ser diluída por meio completo e co-cultivadas com células T resp numa proporção diferente de T células resp: células T reg (1: 0,25-1: 1).
  3. Adicionar 50 ul ou volume adequado de suportes em todas as cavidades para o volume total de 200 ul. Cobrir a placa com uma folha e incubar numa incubadora de CO 2 a 37 ° C durante 72 h.

7. Análise de T CD8 + de Proliferação Celular e Produção de citocinas a partir de células T CD8 +

  1. Para a análise de produção de citocinas, após 3 dias de cultura, separar o sobrenadante de cada poço para outra placa e executar ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).
    NOTA: O sobrenadante pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C. Nesta experiência, placa revestida com anticorpo anti-ratinho de IFN-γ foi utilizado para detectar o IFN-γ acordo produçãoing com o protocolo do fabricante s. Para determinar a produção de IFN-γ de proliferação de células T CD8 + em um nível de uma única célula, coloração de citocinas intracelulares pode ser realizada.
  2. Depois de separar o sobrenadante de cada poço, lavar a placa que contém as células com tampão de SCAF e centrifugar a 300 xg durante 2 min a 4 ° C (3 vezes).
  3. Após a lavagem, desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular com 50 ul de mistura de anticorpos para a coloração de células T CD8 + proliferaram. Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
    NOTA: Para preparar cocktail de anticorpos, adicione anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 e reagente de detecção de viabilidade celular (fluorescente near-IR corante reativo) em tampão FACS.
    NOTA: Os anticorpos contra vários marcadores tais como CD44 ou CD69 podem ser combinados com outros anticorpos para confirmar a activação de células T CD8 +. Lembrar que as células T CD8 + que já foram rotulados com a proliferação de células de rastreamento violet corante no Passo 5,10.
  4. Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Após o passo de lavagem final, desprezar o sobrenadante, e fixar as células durante 20 minutos no escuro a 4 ° C com 100 ul de tampão de fixação.
  5. Lavar duas vezes por centrifugação a 300 xg durante 2 min a 4 ° C. Ressuspender as células com 200 uL de tampão de SCAF e medir a proliferação de células T CD8 + marcadas com corante de violeta de seguimento de proliferação celular por citometria de fluxo.
    1. Portão de a população de células T CD8 + entre as células vivas. Medem-se as percentagens de células divididas e não divididas de acordo com a diluição do corante de rastreio violeta a proliferação celular e a diluição de células T CD8 + de acordo com a seguinte equação. % De Inibição = [(% de células T CD8 + proliferaram na ausência de células T reg -% de células T CD8 + proliferaram na presença de células T REG) / (% de células T CD8 + em proliferarama ausência de células T REG)] x 100. Além disso analisar os dados usando o software de citometria de fluxo 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geramos camundongos com infecção pelo vírus persistente injetando-os com 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 por via intravenosa. Para investigar as alterações fenotípicas em células reg T e células T conv durante a infecção crónica de vírus, linfócitos do baço obtidas a partir de ratinhos não afectados e infectados foram coradas com anticorpos diferentes e analisadas por citometria de fluxo. Aos 16 d pi, PD-1 foi regulada positivamente em ambos Foxp3 - T CD4 + conv (Figura 1A, o painel superior) e Foxp3 - células T CD8 + conv (Figura 1B, painel superior). A frequência de células reg Foxp3 + T CD4 + foi duas vezes maior nos murganhos infectados por LCMV-CL13 do que nos ratinhos ingénuos (Figura 1A). Em particular, a maioria das células reg Foxp3 + T CD4 + apresentada o fenótipo activadas, expressando níveis elevados dePD-1 neste ponto de tempo (Figura 1A).

Para o ensaio de supressão in vitro, era necessário um número considerável de células Conv ​​T CD8 + e células T CD4 + reg CD25 +. Para se obter células T CD8 + marcadas com corante de violeta de seguimento proliferação 1 x 10 7 células, células de baço de dois baços de ratinhos naive foram reunidas. Para se obter 2 X 10 6 ou 3 x 10 6 de células reg CD4 + CD25 +, de pelo menos três baços de ratinhos ingénuos e CL13 LCMV-infectadas, respectivamente, foram reunidas. As células T CD8 + como as células T foram separadas resp com êxito, sem contaminação significativa com outras células do sistema imunológico (Figura 2A). Reg células T também pode ser isolado, com uma população de células dominante CD25 + CD4 + com mais do que 80% de pureza (Figura 2B).

Para comparar a função supressora de células T ingénuas reg e crónicas, a T Reg isolado e células resp T foram incubados em conjunto sob estimulação com esferas anti-CD3 / CD28-revestidos a 37 ° C durante 3 dias. % De inibição da proliferação de células T CD8 + resp foi aumentado em um reg células T dependente Dese-forma (Figura 3A). Quando as células resp T CD8 + foram co-cultivadas com células T reg crónicas em uma proporção de 1: 1, a proliferação de células T CD8 + resp foram significativamente inibida (Figura 3B). A produção de IFN-γ por células T CD8 + resp também foram significativamente inibida quando as células T CD8 + resp foram co-cultivados com células T activadas reg de ratinhos infectados cronicamente e não com células em repouso reg T a partir de ratos ingénuos num Reg t (Figura 3C).

figura 1
Figura 1: fenótipos de células T CD4 + e CD8 + no baço de murganhos naive ou ratinhos LCMV CL13-infectadas com a expressão de DP-1 ou CD25 em Foxp3 16 d pi (A) - T CD4 + conv e Foxp3 + CD4 + células T reg. (B) Expressão de DP-1 ou CD25 em Foxp3 - Conv ​​células T CD8 +. linfócitos do baço foram coradas com anticorpos contra CD4, CD8, CD25, PD-1, e Foxp3. Os dados são representativos de três experiências independentes. O painel A foi modificada a partir de 25 como uma referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: purezas de células resp T isoladas a partir de ratinhos ingénuos e células reg T isoladas a partir de murganhos naive ou CL13 LCMV-infectadas (A) percentagem de células T CD8 + após o isolamento.. (B) Percentagem de células reg T CD4 + que expressam o CD25 após o isolamento. Cada quadrante em (B) foi determinado pelos níveis de CD4 e CD25 expressão. Os dados são representativos de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Figura 3: Efeito das células T activadas em resposta reg células T CD8 + (A)% de inibição de células T CD8 + co-cultivadas com células T reg de uma forma dependente da dose de células T Reg.. (B) Proliferação de células T CD8 + co-cultivadas com células T reg na proporção 1: 1. (C) a produção de IFN-γ de células T CD8 + co-cultivadas com células T reg de uma forma dependente da dose de células T reg. A proliferação de células T CD8 + foi medida por diluição da proliferação de células corante de rastreio violeta em células T CD8 + proliferaram e secreção de IFN-γ foi avaliada por ELISA. As células T CD8 + marcadas com corante de violeta de seguimento proliferação de células foram estimuladas com anti-CD3 / CD28-esferas revestidas durante 3 dias na ausência ou na presença de t + co-cultivadas com e sem células T reg, respectivamente. Enchido picos cinzento do histograma indicar a proliferação de células T CD8 + co-cultivadas sem células T reg. Cada grupo foi concebido em triplicado. As barras representam a média + SEM. Esta figura foi modificada a partir de 25 como uma referência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Embora apenas um pequeno número de células T reg existir em ratos e seres humanos, é importante compreender a sua função que desempenham um papel crucial na regulação da resposta imunitária e manutenção da tolerância imunológica. Os números e supressivas funções de T reg células aumenta durante uma infecção pelo vírus crônica 15-20, bem como a progressão do câncer 13,14. Isto é provavelmente devido à estimulação com antigénio continuou. Para avaliar a células T reg funcionar sob a persistência do antigénio e o desenvolvimento da doença, a sua actividade supressora precisa ser medido.

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo ex vivo de células T reg e medir a sua actividade supressiva utilizando um sistema de co-cultura in vitro de células T CD8 + e células T reg. Etapas críticas do protocolo atual são a análise e isolamento de células T reg. Ao vivo e fresco isolado T in vitro. Também examinamos os fenótipos de T conv e as células T reg durante uma infecção pelo vírus crônica. Conv células T, isto é, Foxp3 - células T CD4 + e CD8 + apresentaram uma diminuição na actividade celular após a infecção crónica de vírus (Figura 1). A expressão de DP-1 foi regulada positivamente em ambas as populações de células T Conv. Aumento do número de células T reg e aumento da regulação do PD-1 expressão são as marcas da resposta imune durante a infecção pelo vírus crônica. Além disso, os anti-corpos para outros receptores inibidores tais como TIM-3 e CTLA-4 pode ser utilizado em combinação com DP-1 para analisar o fenótipo das células T por FACS após infecção pelo vírus choric.

A fim de investigar a actividade supressora, de células T e células resp reg T foram co-cultivadas numa proporção de 1 para 1. A co-cultura com t Regcélulas de ratinhos infectados cronicamente reduziu significativamente a proliferação de células T CD8 + e a secreção de IFN-γ quando em comparação com células T de ratinhos reg naive. Isto implica que a proliferação e produção de citocinas de células T CD8 + co-cultivadas com células T reg estão inversamente relacionados com a função supressora de células T reg. Embora este protocolo recomenda a utilização de um sistema de separação magnética de células para o isolamento de células T reg, a contaminação com células não-reg T não pode ser excluída. As células obtidas a partir de Treg Foxp3-GFP ratinhos repórter 28-30 são melhores candidatos para investigar com precisão a função de células T que reg sistema de separação magnética de células, como a CD25 é frequentemente sobre-expressa em células T CD4 + reg T conv bem como activados.

A função supressora de células T reg foi avaliada por vários in vitroensaios de supressão 16,28,31-34. A vantagem do ensaio de supressão in vitro é que ele avalia o efeito directo das células T reg sobre a inibição da resposta de células T CD8 +, porque apenas as células T resp são co-cultivadas com células T reg. Além das células T CD8 +, a CD25 - células T CD4 + podem ser utilizados, em vez de células T 25 resp. Os efeitos de reg T ou células T Conv ​​em células imunes, tais como células dendríticas ou células assassinas naturais pode ser avaliada através da variação das condições experimentais.

Moléculas tais como a CD103 35, a LAG-3 36, glicoproteicas A repetições predominante 37, CD43 38, CD11a 38, ou células assassinas da subfamília receptor de lectina do tipo membro do L 1 38 foram utilizados como marcadores de células reg T activadas em doenças específicas. Neste protocolo, usamos PD-1 como umindicador para identificar células activado reg T durante a infecção crónica de vírus. Este protocolo pode ser utilizado para análises multifacetados (fenotípicas e funcionais) de células T reg sob condições específicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299, (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155, (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21, (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192, (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107, (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174, (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123, (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207, (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420, (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207, (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33, (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182, (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10, (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20, (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176, (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198, (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172, (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189, (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10, (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194, (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138, (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211, (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12, (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18, (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209, (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119, (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79, (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2, (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118, (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184, (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190, (11), 5485-5495 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics