Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
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Immunology and Infection

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Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

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Abstract

Macrophages et les cellules dendritiques (CD) sont des cellules immunitaires innées présentes dans les tissus et les organes lymphoïdes qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes. Cependant, ils sont difficiles à isoler en nombre suffisant pour les étudier en détail, par conséquent, des modèles in vitro ont été développés. Dans les cultures in vitro de macrophages dérivés de la moelle osseuse et les cellules dendritiques sont des méthodes précieuses et bien établies pour les études immunologiques. Ici, un procédé de mise en culture et identifier à la fois les DC et les macrophages à partir d'une seule culture de cellules de moelle osseuse de souris en utilisant la première facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages de cytokines (GM-CSF) est décrit. Ce protocole est basé sur la procédure établie d' abord développé par Lutz et al. en 1999 pour les PED dérivées de la moelle osseuse. La culture est hétérogène, et MHCII et hyaluronane fluorescéine (FL-HA) sont utilisés pour distinguer les macrophages de CD immatures et matures. Ces GM-CSF dérivé macrophages proVidé une source pratique d'in vitro des macrophages dérivés qui ressemblent étroitement à des macrophages alvéolaires dans les deux phénotype et la fonction.

Introduction

Plusieurs méthodes de culture in vitro ont été décrits pour générer des macrophages d'os dérivées de la moelle (BMDMs) et les CD dérivées de la moelle osseuse (BMDC) en utilisant un ou une combinaison de facteurs de croissance. BMDMs peut être produite en cultivant des cellules de moelle osseuse en utilisant soit le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ou le GM-CSF 1,2. Pour BMDCs, l'addition d' un ligand de FLT3 dans la culture de moelle osseuse donne lieu à des DC plasmacytoïdes classiques et non-adhérentes (CD11c haut / MHCII haut et CD11c lo, B220 + , respectivement) après 9 jours de culture , 3,4. En revanche, les cellules non adhérentes générées après 7 à 10 jours de culture avec GM-CSF seul 5,6, GM-CSF et l' IL-4 7, ou le GM-CSF et FLT3 ligand 8,9 génèrent BMDCs ressemblant davantage les PED inflammatoires (CD11c haute, MHCII haute CD11b +) 10. Bien que ces cultures in vitro sont utilisées pour générer des macrophages ouDC, il est difficile de savoir si chaque culture donne lieu à des populations pures. Par exemple, bien que les cellules adhérentes dans les cultures GM-CSF sont décrits comme les macrophages 5, les cellules non-adhérentes de la même culture sont utilisés comme DC 6,11-13, avec la présomption qu'ils sont homogènes et toute variabilité observée est en raison de différents stades de développement 14,15. En outre, des études ont montré GM-CSF d'être un facteur de croissance essentiel pour le développement des macrophages alvéolaires in vivo 16,17, et peuvent être utilisés in vitro pour générer alvéolaires comme les macrophages 16,17,18.

Autre que l'adhésion, les procédures de génération des macrophages et des pays en développement à partir de cultures de moelle osseuse GM-CSF traités sont très similaires suggérant l'hétérogénéité peuvent exister au sein des cultures de moelle osseuse GM-CSF. Cela semble bien être le cas que deux documents font état de la présence de BMDMs dans la fraction non adhérente des cultures BMDC. Dans un papier, ils identified une population de cellules que CD11c +, CD11b +, MHCII mi, MerTK + et CD115 +, qui exprimait une signature d'expression génique qui ressemblait plus étroitement les macrophages alvéolaires et avait une capacité réduite à activer les cellules T 19. Le second papier utilisé MHCII et FL-HA pour identifier une population de type macrophage alvéolaire (CD11c +, MHCII mid / low, FL-HA élevé) qui était distincte de immature (CD11c +, MHCII mi, FL-HA bas) et mature DC (CD11c +, MHCII haute), à la fois phénotypiquement et fonctionnellement 18. Ces documents illustrent les deux que les cultures GM-CSF BMDC sont hétérogènes, contenant à la fois des macrophages et des populations DC indiquant que les soins doivent être prises lors de l'interprétation des données à partir de cultures BMDC.

Ce protocole décrit comment isoler la moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse dans la culture de GM-CSF, et d'identifier les alvéoles macrophagepopulation à partir des CD immatures et matures dans la culture de la moelle osseuse par cytométrie en flux en utilisant la liaison et l'expression MHCII FL-HA. Cette procédure est basée sur la procédure établie de Lutz et al 6 et est capable de générer. 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes au jour 7 de la culture de 10 ml. La culture est utilisable de jours 7 à 10 et on obtient une population hétérogène de macrophages, DCs immatures et matures, ainsi que des progéniteurs au jour 7. Ceci permet d' obtenir une méthode simple pour isoler et cultiver in vitro des macrophages alvéolaires analogues dans de grandes quantités.

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Protocol

Les souris ont été euthanasiés en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux pour la recherche animale éthique par des procédures approuvées par l'Université de Columbia Animal Care Committee britannique.

1. L'acquisition d'une seule cellule de moelle osseuse Suspension de la souris et de Tibia Fémur

  1. Allumer une enceinte de sécurité biologique (BSC) 15 min avant le début de la procédure pour purger l'air de l'armoire et de permettre la stabilisation des flux d'air, puis nettoyer / pulvérisation surface BSC avec 70% d'éthanol. Gardez tout aussi stérile que possible pour l'ensemble du protocole. Ne pas couper les os dans des conditions non stériles.
  2. Préparer des outils de dissection par trempage dans 70% d'éthanol (1 paire de ciseaux de dissection, 2 paires de pinces), solution saline équilibrée de Hank avec 5% de sérum de veau foetal (HBSS-FCS), boîtes de Petri stériles (100 mm x 15 mm), 1 seringues ml, 26½ aiguilles de calibre, les tubes de prélèvement coniques (15 ml ou 50 ml), et des serviettes en papier dans le BSC.
  3. Euthanasier la souris à l'aideprotocoles approuvés par le comité d'éthique de la recherche sur les animaux de l'institution. Apportez dans le BSC, placer sur le dessus d'une ou deux serviettes en papier et vaporiser la souris avec 70% d'éthanol.
  4. Dans le BSC, ouvrir une boîte de Pétri stérile aseptique, aliquote de 10 ml de HBSS-FCS à la base et 1 - 2 ml au couvercle.
  5. Placez la souris sur le ventre avec le dos tourné vers le haut et soulever la peau autour des sections thoraciques avec les doigts de la main non dominante. Utilisez les ciseaux pour faire une incision où la peau est soulevée.
  6. Tenez aux deux extrémités de la coupe, une extrémité de chaque main et soigneusement séparer la peau autour de la souris de l'arrière vers l'estomac, continuez à tirer jusqu'à ce que deux extrémités de l'incision se rencontrent à l'estomac.
  7. Retournez la souris pour l'estomac vers le haut, et d'une main tirer la moitié inférieure de la peau vers le bas vers la jambe, gardez tirant la peau jusqu'à ce que les jambes sont exposés.
  8. Tenez le pied de la souris vers le haut et couper les tendons d'Achille au-dessus de l'articulation de la cheville etles ligaments qui relient les muscles à pied à l'extrémité inférieure du tibia avec des ciseaux. Cette desserre le pied des os de la jambe.
  9. Tout en maintenant la jambe vers le haut par le pied, couper les muscles et les ligaments avec des ciseaux autour de l'articulation du genou à l'extrémité inférieure du fémur pour séparer les muscles de la cuisse de la jambe inférieure. Utilisez une pince pour tirer doucement les muscles desserrées loin de la fibula et les surfaces fémorales. Prenez soin de ne pas couper l'artère fémorale pour éviter des saignements abondants.
  10. Avec une main tenant sur pied, presse ciseaux bas ouverts à l'extrémité supérieure du fémur à l'articulation de la hanche, tourner la jambe et tirez doucement pour séparer le fémur de l'articulation de la hanche tout en utilisant les ciseaux pour faire la coupe finale à la libre la jambe du corps.
  11. A partir de ce moment-là, seulement maintenir le tissu avec des pinces stériles. Accrochez-vous à la jambe à une extrémité et retirer le pied sur l'autre.
    NOTE: Ce ne devrait pas exiger beaucoup de force, que les ligaments de connexion sont coupés à l' étape1.9. Alternativement, couper le tibia juste au-dessus de la cheville où l'os est fusionné.
  12. Maintenir la jambe de l'extrémité distale du fémur, avec un ensemble de pince et l'extrémité proximale du tibia et du péroné avec l'autre, plier soigneusement le tibia et le péroné dans le sens opposé de l'articulation du genou pour les séparer du fémur et de la rotule.
  13. Utilisez une pince pour tirer vers le bas les ligaments et les muscles restants encore attachés aux os de la jambe. Ici, retirer le péroné avec les tissus conjonctifs avec une pince comme il est trop petit pour être rincée pour les cellules de la moelle osseuse. Placez le tibia nettoyé sur la boîte de Pétri inversé couvercle.
  14. Maintenir l'extrémité inférieure du fémur avec un ensemble de pinces et de la rotule à une autre, plier la rotule et les tissus environnants dans le sens opposé de l'articulation pour le retrait. Ensuite, nettoyer les tissus conjonctifs restants du fémur; les retirer avec une pince, et placez-le sur le plat inversé Petri couvercle. Jeter la rotule.
  15. Répétez 1.7- 1.13 avec l'autre jambe si nécessaire. Transférer les os à 1,6 ml microtubes contenant 1 ml stérile HBSS-FCS pour le transport si nécessaire.
  16. Placez les os sur la boîte de Pétri couvercle inversé, avec 1 - 2 ml de HBSS-FCS, utiliser des pinces pour nettoyer les tissus résiduels encore attaché au tibia et du fémur, puis transférer les os à la base de boîte de Pétri contenant 10 ml de HBSS FCS. Vous pouvez également nettoyer les os et retirer le tissu musculaire joint à l'aide d'un tissu imbibé d'éthanol à 70%.
  17. Couper chacun des os dans la moitié avec des ciseaux. protéger partiellement la boîte de Pétri avec un couvercle stérile pendant la coupe pour assurer les os restent dans le plat. Alternativement, couper l'extrémité de chaque os pour permettre le rinçage à l'étape suivante.
  18. Fixer le 26½ aiguille G à la seringue de 1 ml, et établit 1 ml de HBSS-FCS de la boîte de Pétri. Insérer la pointe de l'aiguille dans l'extrémité d'un morceau d'os et de débusquer les cellules de moelle osseuse (tissu rouge doux à l'intérieur des os). Insérez l'aiguille dans la têtede l'os et l'extrémité ouverte, jusqu'à ce que toute la moelle de couleur rouge est éliminée. Observer les os comme de couleur blanche.
  19. Passez les grumeaux visibles de la moelle osseuse à travers la seringue plusieurs fois pour former une suspension cellulaire unique.
  20. Jeter les os rougies. Utilisez 10 ml pipette pour mélanger la suspension cellulaire bien et transférer dans le tube de collecte. Rincer la boîte de Petri, une fois avec 5 ml de HBSS-FCS pour recueillir les cellules résiduelles dans la boîte. Placez les cellules sur la glace.
    NOTE: La suspension de cellules de moelle osseuse est encore viable si elle est conservée pour les 2 - 3 heures à 4 ° C.

2. Dépôt et culture des cellules de moelle osseuse (BMC)

  1. Préparer les réactifs et les fournitures suivantes.
    1. Préparer un tampon de lyse rouge globule (RBC) en faisant 0,84% de chlorure d'ammonium dans une solution finale de 2 mM de Tris, pH 7,2, puis stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 micron.
    2. Préparer des milieux BMC en ajoutant 10% de FCS, 20 mM d'HEPES, 1 x acides aminés non essentiels, 55 & #181; M 2-mercaptoéthanol, 50 U / ml de pénicilline et de la streptomycine, du pyruvate de sodium 1 mM et 2 mM de L-glutamine en milieu RPMI 1640.
    3. Obtenir disponibles dans le commerce GM-CSF recombinant ou en utilisant le GM-CSF contenant du surnageant de cellules de myélome Ag8.653 transfectées avec le gène du GM-CSF 20. Déterminer la concentration de GM-CSF dans le surnageant par ELISA et ajouter l'équivalent de 20 ng / ml pour les médias BMC.
  2. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 314 g pendant 5 min. Le culot est rouge, en raison de globules rouges. Dans le BSC, aspirer le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile attaché à vide d'aspiration, desserrer le culot en tapotant, puis ajouter 10 ml de tampon de lyse RBC. Vortex pour remettre en suspension les cellules et incuber dans un tampon de lyse des globules rouges à la température ambiante pendant 5 min.
  3. Ajouter 10 ml de HBSS-FCS puis tourner les cellules à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Observer le culot cellulaire que la couleur blanche. Resuspendre les cellules dans le volume désiré des médias BMC.
  4. Comptez le resucellules spended utilisant un hémocytomètre après coloration des cellules mortes avec 0,4% de bleu trypan.
    NOTE: Si la moelle osseuse d'une jambe (tibia simple et fémur) est utilisé, remettre en suspension dans 5 ml de milieu BMC, prendre 10 pi de suspension cellulaire et le diluer avec 70 ul de 0,4% trypan bleu, bien mélanger et transférer 10 pi de la dilution 8/1 de la cellule à la chambre d'hémocytomètre. Compter les cellules viables dans quatre quadrants: la moyenne des quatre chefs d' accusation de quadrant x facteur de dilution x 10 4 = nombre de cellules par ml. Un fémur et un tibia d'une jambe généralement donné environ 2-4 x 10 7 cellules après lyse RBC.
  5. Estimer le nombre de 10 ml plats de cultures de moelle osseuse nécessaires pour des expériences en aval sur la base du nombre de cellules totales nécessaires pour les expériences à la fin de la culture.
    NOTE: Chaque plat nécessite 2 x 10 6 cellules de moelle osseuse à l' ensemencement initial et les rendements 5 - 10 x 10 6 cellules au jour 7.
    1. Aliquot le nombre total de cellules pour le placage dans un nouveau tube, centrifuger à 314 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à 4 x 10 6 cellules / ml dans les médias BMC.
  6. Préparer une nouvelle stérile 100 mm x 15 mm boîte de Pétri avec 9,5 ml de milieu BMC contenant 200 ng de GM-CSF (recombinant ou de GM-CSF contenant surnageant). Ajouter 500 ul de 4 x 10 6 cellules cellules de moelle osseuse / ml au centre de la boîte de Petri pour la concentration finale de 2 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml.
    NOTE: Il est important d'utiliser une boîte de Pétri stérile et non une boîte de culture de tissu. En outre, lors de l'ajout des cellules, assurer les cellules restent concentrées au centre et de minimiser les perturbations pour les plats après le semis et lors des changements de médias. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. Ceci est le jour 0 dans la culture.
  7. Le jour 3, ajouter 10 ml de milieu frais BMC contenant 200 ng de GM-CSF à chaque plat de cellules. Prenez soin de minimiser la perturbation of les cellules concentrées en suspension. Le volume total de la culture cellulaire est maintenant 20 ml.
  8. Observer les cellules au microscope optique à grossissement 100X. Observer de nombreuses cellules non-adhérentes (ronds) et quelques cellules adhérentes (plat). Les cellules en groupes de trois ou quatre pétales ressemblant d'une fleur peut être vu, ce qui indique la prolifération.
  9. Le jour 6 effectuer un changement de la moitié des médias. Retirez délicatement 10 ml de milieu dans un tube conique de 50 ml stérile, centrifuger à 314 xg pendant 5 min, aspirer et jeter le surnageant.
  10. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu frais BMC contenant 20 ng / ml de GM-CSF, doucement vortex et ajouter à la boîte de culture cellulaire d'origine pour un volume total de 20 ml. Observer les cellules au microscope.
    NOTE: Jour 7 culture doit être à 70% ou plus en confluence avec des cellules plates adhérentes et des nuages ​​denses de cellules non adhérentes rondes.

3. Collecte et préparation BMDC et BMDMs pour cytométrie de flux

    <li> Gardez tous les tampons à 4 ° C.
  1. Récolter les cellules du jour 7 au jour 10. Pour récolter les cellules, premier transfert 10 ml du surnageant de culture à un tube conique de collecte de 50 ml, puis inclinez le plat verticalement d'environ 30 degrés et laver le plat par pipetage les 10 ml restants la culture de la partie supérieure de la coupelle. Répéter ce lavage 5 fois, chaque fois tourner le plat d'un tiers.
  2. Transférer les 10 ml restants de cellules dans le même tube collecteur et jeter la plaque et les cellules adhérentes.
    REMARQUE: Les lavages seront éliminer les cellules non-adhérentes et faiblement adhérentes; les cellules adhérentes plates sont résistantes aux lavages. En règle générale, entre 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes sont attendus d'une plaque à 7 jours et 2 - 5 x 10 6 cellules au jour 10, bien que Lutz et al. rapporté 10 x 10 6 cellules au jour 10. Les cellules adhérentes ne sont normalement pas prises. Cependant, si ces cellules doivent être comparées aux cellules non-adhérentes, Ils peuvent être éliminés de la manière suivante. Ajouter 5 ml d'EDTA 0,7 dans 1 x PBS, pH 7,4 à la boîte après que les cellules non adhérentes sont enlevées, incuber à 37 ° C pendant 5 min, la pipette vers le haut et vers le bas pour éliminer les cellules adhérentes et recueillir dans un tube séparé.
  3. Isoler les cellules recueillies à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 5 ml de milieu BMC stérile à 4 ° C, vortex doucement pour mélanger, et compter en utilisant du bleu trypan et hémocytomètre.
    NOTE: Chaque plat donnera 5 - 10 x 10 6 cellules non adhérentes d'une culture 7 jours. A partir de maintenant, effectuer toutes les étapes à 4 ° C.
  4. Pour l' analyse cytométrique d'écoulement, le transfert de 2 x 10 5 cellules pour chaque échantillon dans 5 ml polystyrène tubes à fond rond, ajouter 300 ul de tampon FACS à 4 ° C (1x solution saline tamponnée phosphate, 2 mM d' EDTA et 2% de sérum albumine bovine) à chaque échantillon.
  5. Spin cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant. Observer un blanc, pastille opaque visible aufond du tube.
  6. Resuspendre les cellules dans 100 ul de récepteur Fc non marqué Ab pour bloquer la liaison au récepteur Fc (1/10 Utiliser le surnageant de 2.4G2 produisant lignée cellulaire de myélome) et incuber pendant 20 min à 4 ° C. Puis ajouter 300 pi de tampon FACS à chaque échantillon, doucement vortex puis tourner les cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  7. Resuspendre les cellules dans 100 pi de CD11c-PeCy7 à 0,2 pg / ml, Bleu Gr1-Pacifique à 0,25 pg / ml, MHCII-APC à 0,05 pg / ml, et FL-HA à environ 2 pg / ml pour identifier les macrophages et les PED.
    NOTE: FL-HA a été préparé dans la maison à l' aide de fluorescéine et de sel de sodium de l' acide hyaluronique de crête de coq comme décrit précédemment 21.
  8. Incuber pendant 20 min à 4 ° C pour permettre la liaison à la surface cellulaire. Ajouter 300 pi de tampon FACS à chaque échantillon, doucement vortex, puis tourner les cellules vers le bas à 314 xg pendant 5 minutes à 4 ° C et aspirer le surnageant . REMARQUE: Si bioanticorps tinylated sont utilisés dans 3,8, répéter 3,8 à 9 avec fluorescent-streptavidine.
  9. Laver les cellules avec un autre 300 pi de tampon FACS, doucement vortex pour mélanger et centrifuger les cellules à 314 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon FACS contenant 0,1 à 0,2 pg par ml d'iodure de propidium ou du DAPI pour marquer les cellules non viables. Les cellules sont maintenant prêtes pour l' analyse cytométrique d'écoulement 22.
    REMARQUE: Voir les résultats et la figure 3 pour plus de détails sur les populations et comment les cellules ont été bloqués.

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Representative Results

Un organigramme résumant les principales étapes de ce procédé est représenté sur la figure 1. La densité et la morphologie de la culture de moelle osseuse à différents moments de la culture sont représentés sur la figure 2. Au jour 1, les cellules sont petites et rares , mais par jour 3, il y a plus de cellules, certains sont plus grandes et que quelques-uns ont commencé à adhérer. Par jour 6 il y a une adhérence définitive et la fraction non adhérente (figure 2A). La culture peut être récoltée à partir du jour 7-10 avec un pourcentage plus élevé de cellules CD11c + présents au jour 10. La figure 2B représente le jour 7 de la culture avant la récolte, ainsi que les fractions de cellules adhérentes et non adhérentes séparées. La fraction adhérente est constituée de cellules à la fin des lavages légers qui éliminent la fraction non adhérente. La fraction non adhérente est fortement enrichie en cellules avec une morphologie dendritique, qui peut être vu plus clairement dans la im agrandie numériquementâges dans les empiècements de la figure 2B. Une fois que la fraction non adhérente est éliminée (jour 7 ou 10 jours), les cellules sont analysées par cytométrie de flux après marquage avec des anticorps fluorescents contre des marqueurs essentiels de la surface cellulaire, comme décrit ci - dessus. La figure 3 montre le flux représentatif cytométrie parcelles de non-adhérente fraction de la culture au jour 7 et le jour 10.

Pour l'identification des deux macrophages et les PED, porte sur CD11c + et Gr1 - cellules après la première ouverture de porte sur la taille et les cellules vivantes (Figure 3A et B). Dans jour 7 cultures, le CD11c + Gr1 - population dans la fraction de cellules non-adhérentes est typiquement de 60 à 70% de cellules vivantes au total, ce qui est porté à 90% ou plus le jour 10 (figure 3B). Le CD11c + Gr1 - population au jour 7 et le jour 10 peuvent être divisés en trois sous - ensembles principaux utilisant MHCII et FL-HA binding: MHCII mid / low FL-HA liaison haute macrophages (P1), MHCII mi FL-HA (P2) cellules faibles de liaison contenant les CD immatures et MHCII haute FL-HA liaison DC faibles matures (P3) (figure 3C et la référence 18 ). La faible, une faible population FL-HA MHCII (P0) observée au jour 7 a été montré pour contenir progéniteurs pour les cellules P3-P1 18. Cette population est pas évidente au jour 10 ce qui signifie que plus la maturation de la culture a eu lieu. Ceci est également supporté par le pourcentage plus élevé de cellules CD11c dans la culture, ainsi que des pourcentages légèrement plus élevés des populations P2 et P3 DC au jour 10. La figure 3D montre MerTK, considéré comme un marqueur de macrophage, est fortement exprimé à la fois des macrophages et populations immatures DC (P1 et P2), mais est exprimé dans une moindre mesure sur la maturité des DC (cellules P3). En particulier, l'analyse de la fraction adhérente révèle la présence de P0, P1 etpopulations P2, mais pas la population P3 matures DC (données non présentées). Ainsi, les macrophages sont présents dans les fractions adhérentes et non adhérentes mais seulement DC matures sont présents dans la fraction non adhérente.

Figure 1
. Figure 1: Un organigramme indiquant les étapes clés de la méthode primaire cellules sont récoltées à partir de la moelle osseuse, étalées et maintenues en culture pendant 7 - 10 jours quand ils sont récoltés pour une utilisation dans d' autres expériences, purifiés ou utilisés dans l' analyse FACS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: L' examen microscopique de GM-CSF des cellules dérivées de la moelle osseuse. UNE) la culture de moelle osseuse au jour 1, 3 et 6 montrant l'augmentation du nombre de cellules, les changements dans la morphologie et l'apparition de fractions adhérentes et non-adhérentes distinctes. B) Le panneau de gauche montre la culture le jour 7 de la moelle osseuse et la densité cellulaire typique. Le panneau du milieu montre le jour 7 cellules adhérentes après la récolte de la fraction non-adhérent et le panneau de droite montre la fraction non adhérente récoltées au jour 7. Insets sont numériquement agrandies des images de cellules dans cette fraction avec la morphologie dendritique. La barre d'échelle blanche représente 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Phénotype Représentant de la Culture GM-CSF au jour 7 et le jour 10. Non-adhérentles cellules de la culture sont étiquetés avec CD11c, Gr1, MHCII, FL-HA et MerTK au jour 7 ou 10 jours et analysées pour leur phénotype par cytométrie en flux. A) Les cellules ont d' abord été déclenchés sur la taille puis vivre cellules. B) Affiche une tracé des cellules gated avec CD11c et Gr1 (le / marqueur de monocytes neutrophiles) et identifie le CD11c + Gr1 - population contenant le macrophage et les cellules dendritiques. Gating sur cette population, C) représente le tracé de cytométrie de flux de MHCII et FL-HA de liaison, ce qui montre la séparation des macrophages alvéolaires de type (P1) de DC immatures (P2) et matures DC (P3), comme décrit dans Poon et al. 18. D) histogrammes comparant expression MerTK entre le P1 (macrophages), P2 (les CD immatures), et les populations P3 (matures PED) au jour 7 et le jour 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous fournissons un procédé pour générer les macrophages et les DC GM-CSF provenant d'une culture de moelle osseuse de souris unique qui est adapté de Lutz et coll. 6. Expression MHCII et FL-HA distingue les CD immatures et les macrophages de liaison dans cette culture (voir la figure 3C), qui a été difficile. Ceci, combiné avec un autre rapport de Helft et al. 19, montre l' hétérogénéité au sein de GM-CSF cultures BMDC induits qui étaient auparavant considérées comme seuls les PED. Helft et al. , 19 utilisé très différentes conditions de culture pour générer BMDCs encore également trouvé une population macrophage significative. GM-CSF des macrophages induits ressemblent les macrophages alvéolaires et GM-CSF DC induites ressemblent DC inflammatoires, alors que FLT3 ligand supplémenté cultures BMDC produisent les CD classiques et plasmacytoïdes 3,4. Populations DC et macrophage différents sont également observées dans non in vivoder conditions homéostatiques et inflammatoires, et il y a beaucoup de discussions dans le domaine de ce qui définit un DC et un macrophage 10. Cela est particulièrement vrai quand il vient à monocytes dérivé DC inflammatoires, ce qui est également pertinente dans ce BMC. Il est donc important d'utiliser plusieurs marqueurs phénotypiques, données fonctionnelles, et éventuellement des données d'expression génétique pour caractériser une population particulière. Il est également possible que ces tests in vitro des populations de DC et de macrophages peuvent être subdivisés en tant que marqueurs fonctionnels et phénotypiques sont découverts.

Dans cette méthode, le CD11c marqueurs, Gr1, MHCII et FL-HA sont utilisés pour distinguer les macrophages de cellules dendritiques immatures et matures dans la fraction non adhérente de la culture BMC. Ceci est différent de Helft et al. 19, qui a utilisé les marqueurs CD11c, CD11b, CD115, CD135, MerTK et MHCII de distinguer une population de macrophage de DC matures. les niveaux d'expression MerTK pourraient distinguish entre les macrophages (P1) et matures DC (P3), mais pas immatures PED (P2) (Figure 3D). Ainsi FL-HA et MHCII sont des marqueurs utiles pour discriminer les macrophages des deux populations de DC immatures et matures. Ces macrophages sont aussi fonctionnellement distincte de PED dans cette culture BMC et cela est démontré plus en détail ailleurs 18. En bref, après stimulation par le LPS des macrophages BMC produisent différentes cytokines que les CD matures et n'activent les cellules T naïves 18. Ces macrophages aussi ressemblent les macrophages alvéolaires, tant phénotypiquement et fonctionnellement à la fois comme bind FL-HA et expriment CD11c, MerTK, CD200R, CD206 et F4 / 80 et après stimulation par le LPS produit TNF-α encore sont incapables d'activer les cellules T naïves 18. Cependant, il y a aussi des différences: les macrophages BMC sont CD11b + et ont des niveaux inférieurs de Siglec F par rapport à l' ex-vivo macrophages alvéolaires, suggérant que ces cellules sont similaires mais pas identical à des macrophages alvéolaires.

Il y a plusieurs étapes importantes pour assurer le succès de ce protocole. Il est important de maintenir la stérilité de l'exposition de la moelle osseuse en avant. Lors du déplacement dans et hors de la BSC, vaporisez les mains et les objets avec 70% d'éthanol gantées. Bien qu'il soit utile de rincer les outils dans 70% d'éthanol pour stériliser, l'éthanol est toxique pour les cellules de moelle osseuse, de sorte que l'air sec des outils et d'assurer l'éthanol est évaporé avant d'introduire des os ou des cellules en contact avec eux. En outre, éviter tout contact avec les tissus de souris ou des cellules avec des équipements ou des mains non stériles lors de la récolte de la moelle osseuse. Bien que la pénicilline et de la streptomycine supplémentation est fournie dans les médias, la manipulation imprudente des cellules peut conduire à la levure ou de contamination fongique. En outre, étant donné que les cellules immunitaires avec l'activité phagocytaire sont générés dans cette culture, la contamination mineure ne peut être détectée en observant simplement la culture cellulaire au microscope, est donc important d'identifier les til signe de contamination. Par exemple, le nombre de cellules peut être réduite et l'expression des marqueurs d'activation des cellules tels que CD40 et CD86 peuvent être augmentées lorsqu'il est analysé par cytométrie de flux. la couleur des médias peut aussi devenir jaune reflétant un changement de pH en raison de la contamination. Lorsque la contamination se produit, la culture BMC est inutilisable. Pour maintenir la cohérence expérimentale, il est important de générer une suspension de cellules isolées de la moelle osseuse par tourbillonnement et obtenir un nombre de cellules précises à mettre en place les cultures BMC. En outre, le cas échéant le tissu conjonctif de l'os se retrouve dans la suspension à cellule unique, filtrer à travers un filtre de 70 microns stérile pour la retirer. Les rendements cellulaires typiques pour une plaque de la fraction non adhérente au jour 7 sont compris entre 5 - 10 x 10 6 cellules. Les nombres de cellules sont généralement une bonne indication que le protocole fonctionne bien. Avec cette procédure , nous obtenons habituellement entre 2-5 x 10 6 cellules le jour 10, alors que Lutz rapporte 10 x 10 6 cellules. Nous effectuons RBC lyse sur ee cellules initial de la moelle osseuse , tandis que le protocole par Lutz et al. ne et donc cette étape peut être facultative. Les variations de la pour cent des cellules CD11c ainsi que les numéros et les proportions des macrophages et des pays en développement peuvent provenir de différentes sources ou des lots de FCS et il est donc essentiel de tester de nouveaux lots de FCS sur les cultures BMC pour les résultats expérimentaux cohérents. la concentration de GM-CSF a varié de 5 ng / ml à 40 ng / ml et cela n'a pas affecté de manière significative le rendement de la cellule. La densité cellulaire peut également influencer la maturation de la culture. Par exemple, Helft et al. ensemencé 1 x 10 7 cellules dans 4 ml de milieu qui ont produit un plus grand pour cent des cellules avec une grande MHCII expression 19. Le moment où les cellules sont récoltées de temps peut également affecter le pourcentage des populations présentes dans la fraction non adhérente. Les cellules sont généralement recueillies entre 7 jours - 25 au 27 octobre, mais certaines études recueillent BMCs au jour 6 19,23,24. Si plusieurs cellules sont nécessaires, la culture BMCsen plus grand de 150 mm x 15 mm dans des boîtes de Petri de 40 ml à la même densité. Dans ce cas , un changement de support demi-volume est effectué à la fois sur le jour 3 et le jour 6 (soit 20 ml de milieu enlevé, les cellules centrifugé et remplacées par de nouvelles 20 ml de milieu additionné de 20 ng / ml RGM-CSF). Ces plaques génèrent habituellement 3 - 6 x 10 7 cellules par boîte au jour 7. FL-HA est un réactif important avec MHCII, de distinguer les macrophages de CD immatures et matures dans la culture BMC. Ainsi , une fois qu'il est fait, titrez le FL-HA pour une utilisation sur des cellules connues pour se lier constitutivement HA telles que les macrophages alvéolaires 18 ou des cellules BW5147 T et confirmer sa spécificité en utilisant soit un anticorps CD44 HA-bloquant (KM-81, disponible dans le commerce), HA sans étiquette ou une cellule déficiente CD44. CD11c - Gr1 + cellules dans la culture peut fonctionner comme un contrôle interne pour les cellules non HA-liaison, et une fluorescence moins un contrôle (FMO) ou CD44 cultures BMC déficients sont fortement recommandés pour settin préciseg de la porte de liaison FL-HA.

Bien que les expériences peuvent être effectuées en utilisant une culture hétérogène, il est souhaitable d'enrichir le courant continu ou d'une population de macrophages en utilisant soit activé par fluorescence tri cellulaire ou des billes magnétiques recouvertes d' anticorps 18 en fonction de l'expression de CD11c, une liaison Gr1, MHCII, et HA. expériences possibles comprennent la stimulation par des agonistes des récepteurs Toll-like tels que le LPS pour mesurer l'activation et la production de cytokines, T tests d'activation des cellules, ou la caractérisation supplémentaire par cytométrie de flux. Par exemple, après 8 ou 24 heures de stimulation, la cytométrie en flux peut être utilisé pour mesurer la coloration intracellulaire pour les cytokines et / ou de marquage de surface des molécules co-stimulatrices telles que CD40 et CD86, comme décrit dans 18. procédures de marquage des cytokines intracellulaires nécessitent un traitement préalable des cellules avec de la Brefeldine A, ce qui empêche la sécrétion des cytokines et permet de construire à l'intérieur de la cellule. Pour T essais d'activation cellulaire impliquant le loading d'un antigène tel que le peptide OVA par une cellule présentatrice d'antigène, les macrophages purifiés basés sur MHCII et HA liaison ne sera pas activer les cellules T immatures et matures tandis DCS 18. Il convient de noter que la procédure de tri seul peut activer les cellules dendritiques dans une certaine mesure, il est donc important d'inclure des témoins négatifs dans toutes les expériences.

Comme avec toute méthode in vitro, il existe des avantages et des inconvénients par rapport à l' utilisation dans des cellules in vivo ou ex vivo. L'inconvénient est que dans les cellules in vitro dérivées de cellules ne peuvent pas exactement mimer in vivo , mais ils ont l'avantage qu'ils peuvent être produits en quantité suffisante pour permettre une analyse fonctionnelle et biochimique, ce qui est souvent impossible avec des cellules ex vivo. Cette méthode de macrophage et l'identification DC permettra de futures recherches pour obtenir des populations de cellules plus homogènes à partir d'une culture avec hétéro précédemment sous-estimégénéité. Macrophages purifiés à partir de cette culture , le GM-CSF ressemblent étroitement à des macrophages alvéolaires du poumon 18, il fournit une source commode de macrophages alvéolaires analogue pour l' analyse in vitro. Par exemple, ces macrophages de liaison de HA peuvent être utilisés pour cribler des médicaments qui modifient la fonction des macrophages alvéolaires et d'étudier les mécanismes d'infection par Mycobacterium tuberculosis et la résistance. Compte tenu de la récente découverte que le GM-CSF et M-CSF dérivées de moelle osseuse macrophage transplantation peuvent atténuer Protéinose pulmonaire chez la souris 28,29, cette méthode pour identifier les macrophages à partir de cultures GM-CSF peut aider à augmenter l'efficacité de cette thérapie proposée.

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Acknowledgements

Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (Grant MOP-119503) et les sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG) du Canada. Le CRSNG appuie également bourses d'été à YD et AA YD est pris en charge par l'Université de la Colombie-Britannique (UBC) avec une bourse de recherche de 4 ans, AA est pris en charge par les IRSC à l'attribution d'une maîtrise de l'étudiant diplômé (BESC-M). Nous remercions Calvin Roskelley d'assistance avec le microscope utilisé pour générer les images de la figure 2. Nous reconnaissons également le soutien des UBC animaux et de débit Installations cytométrie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

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References

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