La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Summary

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

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Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

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Abstract

La prova aumentante indica che ematopoiesi normale è regolata da stimoli microambientali distinti in BM, sono specializzati nicchie cellulare modulazione critica di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni1,2. Infatti, un quadro più dettagliato del microambiente ematopoietico ora sta emergendo, in cui l'endostali e le nicchie endoteliali formano unità funzionali per la regolazione del normale HSC e loro progenie3,4,5 . Nuovi studi hanno rivelato l'importanza delle cellule perivascolari, adipociti e cellule neuronali nel mantenimento e regolamentare HSC funzione6,7,8. Inoltre, c'è prova che le cellule da stirpi differenti, vale a dire le cellule mieloidi e linfoidi, casa e risiede in nicchie specifiche all'interno del microambiente di BM. Tuttavia, una mappatura completa del microambiente BM e dei suoi occupanti è ancora in corso.

Diversi ceppi di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti specifico lignaggio o topi geneticamente per mancanza di molecole selezionate in specifiche cellule della nicchia BM sono ora disponibili. Knock-out e lignaggio rilevamento modelli, in combinazione con approcci di trapianto, offrono la possibilità di perfezionare le conoscenze sul ruolo di specifici "di nicchia" cellule per popolazioni ematopoietiche definite, ad esempio HSC, B-cellule, cellule T, cellule mieloidi e cellule eritroidi. Questa strategia può essere ulteriormente rafforzata unendo l'uso di microscopia del due-fotone del calvarium. Fornendo in vivo imaging ad alta risoluzione e rendering 3D del calvarium BM, possiamo ora determinare precisamente la posizione dove specifici sottoinsiemi ematopoietiche home in BM e valutare la cinetica della loro espansione nel corso del tempo. Qui, Lys-GFP topi transgenici (marcatura cellule mieloidi)9 e RBPJ topi knock-out (carente canonico tacca di segnalazione)10 sono utilizzati in combinazione con IVFM per determinare l'attecchimento di cellule mieloidi ad un microambiente BM difettoso di tacca.

Introduction

Microscopia di fluorescenza multifotonica videomicroscopia (IVFM) è una potente tecnica di imaging che permette ad alta risoluzione, in tempo reale immagini di tessuti con profondità fino a 1mm, a seconda del tessuto. Quando applicato al calvarium del mouse, permette di osservare il comportamento delle cellule ematopoietiche all'interno il BM in maniera non invasiva fino a 60-100 μm11. Questo approccio è usato qui per determinare la cinetica di attecchimento dei progenitori mieloidi normali nei topi knock-out BM di RBPJ carente canonico tacca di segnalazione.

Recenti lavori del nostro gruppo ha dimostrato quello difettoso canonico tacca di segnalazione nel BM microambiente porta a una malattia mieloproliferativa simil-12. Perdita della tacca di segnalazione è stata ottenuta tramite l'omissione condizionale del dominio obbligatorio del DNA di RBPJ, il fattore di trascrizione critica a valle del canonico tacca di segnalazione, utilizzando Mx1-Cre indotto ricombinazione10. In questo studio, è stato utilizzato il modello di topilox/lox Mx1-Cre/RBPJ. Eliminazione condizionale del motivo DNA-legante di RBPJ provoca la perdita del segnale da tutti i recettori di tacca. Nel modello Mx1-Cre, Cre espressione è guidata dal promotore Mx1 attivato in seguito a somministrazione di polyI:C con conseguente induzione di delezione genica mirata nelle cellule di sangue così come componenti stromal degli organi multipli, compreso BM, milza e fegato.

MX1-Cre+/RBPJlox/lox e Mx1-Cre/RBPJlox/lox topi indotti con polyI:C (hereon indicato come RBPJKO e RBPJWT, rispettivamente) sono stati irradiati letalmente e trapiantati con cellule ematopoietiche normali, wild-type. A partire dalla settimana 4 dopo il trapianto, i destinatari RBPJKO sviluppato la leucocitosi significativa seguita da splenomegalia. Anche se topi RBPJKO presentato percentuale aumentata dei progenitori mieloidi in BM alla settimana 8 dopo trapianto e intervalli di tempo più tardi, analisi di BM alle settimane 4 e 6 non ha rivelato differenze evidenti nel loro contenuto delle cellule mieloidi rispetto al controllo RBPJWT destinatari. Questa osservazione, insieme al fatto che Mx1-Cre è espresso in diversi organi ematopoietici, ha sollevato la questione se il microambiente BM avuto impatto diretto sull'inizio del fenotipo mieloproliferativa.

Per stabilire se il BM è un sito critico iniziale di sviluppo della malattia, IVFM del calvarium del mouse è stato usato in combinazione con BM trapianto (BMT), il modello knock-out RBPJ e un sistema di tracciamento di lignaggio. Topi transgenici che esprimono EGFP sotto il controllo del promotore (Lys-GFP) lisozima specifico9 sono stati utilizzati per ottenere le cellule erogarici che potrebbero essere visualizzate durante BM imaging dopo BMT. Espressione di lisozima è specifico di cellule mieloidi e Lys-GFP segna celle dal comune progenitore mieloide (CMP) per i granulociti maturi13.

IVFM del BM in diversi momenti ha dimostrato che cellule di Lys-GFP homed similmente ai destinatari BM di RBPJWT e RBPJKO, ma ampliato e innestate più velocemente nei destinatari del BM di RBPJKO. Questa differenza era drammatica al punto precedente di tempo (settimana 2) ed è diminuito nel tempo (settimane 4 e 6). Tuttavia, questi intervalli di tempo più tardi, valutazione del compartimento ematopoietico in stesso destinatario ha mostrato un aumento costante del numero di cellule mieloidi circolanti nel PB e localizzato nella milza dei topi RBPJKO, che indica un'uscita aumentata delle cellule da BM nella circolazione. Analisi della localizzazione di cellule Lys-GFP in BM di topi trapiantati a 6 settimane ha rivelato che le cellule mieloidi risiedevano più lontano del sistema vascolare nel microambiente RBPJKO che nel controllo.

Collettivamente, la combinazione di IVFM con questi specifici modelli animali fornito le comprensioni nella dinamica attecchimento delle cellule mieloidi nel microambiente RBPJKO BM. Il disegno sperimentale e l'approccio quantitativo descritto qui è proposto come un paradigma che possa essere applicato per affrontare simili questioni. Ad esempio, può consentire l'uso di altri stirpe specifico cellulare rilevamento modelli, ad esempio RAG1-GFP14 o Gata1-GFP15 topi, seguendo il comportamento di linfoide o progenitori eritroidi, rispettivamente, in BM.

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Protocol

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state effettuate con l'autorizzazione della cura degli animali e utilizzare Comitato di Indiana University School of Medicine. Assicurarsi di rispettare la legislazione sulla sperimentazione animale del paese dove il lavoro viene eseguito.

1. preparazione del Mx1CreRBPJ- / - Mice destinatario

  1. Cross Mx1-Cre+ topi con RBPJlox/lox topi10 per ottenere Mx1-Crepositivo RBPJlox/lox topi12 e Mx1-Cre negative littermateslox/lox RBPJ da utilizzare come controlli. Verificare il genotipo di PCR10.
  2. Utilizzare 6-8 settimana-vecchio Mx1Cre+/RBPJlox/lox e Mx1Cre topi dilox/lox /RBPJper eseguire l'induzione di polyI:C.
  3. Iniettare polyI:C 200 µ g i.p. in Cre+ e Cre topi. Dare una iniezione di polyI:C ogni altro giorno per 3 giorni la settimana prima. Dare una iniezione di polyI:C la seconda settimana, 7 giorni dopo l'iniezione precedente (quattro iniezioni in totale).
    1. Utilizzare RBPJKO (indotta Mx1Cre+/RBPJlox/lox) e RBPJWT (indotta Mx1Cre/RBPJlox/lox) topi come destinatari 3 settimane dopo l'ultima iniezione di polyI:C.
      Nota: Si consiglia di utilizzare topi indotti dal pI: pC 3 settimane dopo l'iniezione. La risposta IFNα innescata da polyI:C induce cambiamenti significativi in BM, conseguente l'espansione di immunophenotypic di HSC e diminuito output di progenitori maturi nel sangue periferico16,17. Rappresentazione dei sottoinsiemi ematopoietici è normalizzato a 3 settimane dopo l'iniezione e i topi possono essere utilizzati senza gli effetti confondenti di infiammazione. Questo protocollo di induzione è stato ottimizzato per RBPJ. Se l'eliminazione di un gene differente, il protocollo di induzione può variare a seconda del costrutto, e cancellazione dovrà essere convalidati. Abbiamo validato ~ 100% omissione della regione RBPJ tra i siti loxP mediante RT-PCR dopo un totale di quattro iniezioni di polyI:C.

2. preparazione di cellule del midollo osseo di Lys-EGFP donatore per trapianto

  1. Eutanasia di un mouse di Lys-EGFP (anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale) 1 o 2 h prima del trapianto.
  2. Spruzzare la superficie del corpo animale con etanolo al 70%.
  3. Utilizzare forbici chirurgiche per effettuare un'incisione della pelle su entrambe le gambe intorno alla caviglia e con pinze chirurgiche tirare via pelle e pelliccia insieme per esporre il tessuto muscolare pulita.
  4. Utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere come muscolo molto dalle gambe come possibile. Utilizzando un paio di forbici, tagliare le ossa (presso il ginocchio e della caviglia) e pulire qualsiasi residuo tessuto muscolare dai femori e le tibie utilizzando spugne garza. Inserire le ossa (due femori e due tibie) in una piastra a 6 pozzetti contenenti DMEM 10% FBS.
  5. Schiacciare le ossa in un mortaio con 10 mL di EDTA PBS al freddo 2mM e dispensare le cellule del midollo osseo per portare le cellule in sospensione unicellulare. Alternativamente, svuotare le ossa con tempi di 2 mM EDTA PBS 3 da ogni lato con una siringa da 1 mL.
  6. Filtrare le cellule del midollo osseo utilizzando un filtro da 70 µm in una provetta da centrifuga da 15 mL. Risciacquare il filtro con 2-3 mL di PBS. Le celle in basso 10 min a 460 x g di spin, risospendere le cellule in 10 mL di fresco DMEM 10% FBS.
  7. Contare le celle del midollo osseo su un emocitometro e regolare la concentrazione a 1,5 x 107 cellule/mL in IMDM senza siero. Utilizzare 3 x 106 cellule per animali con un volume di 200 µ l. Cellule di circa 1/3 del totale BM sono GFP + cellule mieloidi. Lasciare le cellule su ghiaccio fino a che pronto per l'iniezione. Utilizzare 0,5 x 105 celle per determinare l'espressione di GFP di FACS9.

3. midollo osseo trapianto di cellule di Lys-GFP in topi RBPJKO

  1. Trattenere il destinatari topi in una gabbia di torta. Irradiare topi con una dose letale di radiazione gamma (1.200 Rad) su un irradiatore di Cs 137. Utilizzare un protocollo di dose di Spalato: 900 rads la sera seguita da 300 rads la mattina successiva (16h apart).
  2. Trapiantare i topi irradiati letalmente di destinatario RBPJWT e RBPJKO 5-6 h dopo la seconda dose di radiazione. BM di iniettare cellule ottenute da topi di Lys-EGFP ad una concentrazione di 3 x 106 cellule per animali tramite iniezione della vena della coda (Vedi dettagli per la raccolta delle cellule nella sezione 2).
  3. Immagine indipendente coorti di topi trapiantati da IVFM in diversi momenti: 24 h ed alle settimane 2, 4 e 6, come descritto di seguito (vedere paragrafo 4 & 5 per in vivo imaging procedura).

4. preparazione chirurgica per l'Imaging di videomicroscopia

  1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici. Due bei forcipe (uno dritto, uno ad angolo), un paio di forbici bene e un paio di Portaghi. Preparare area operativa con tutte le forniture necessarie per la procedura.
  2. Dare il mouse un'iniezione di IP di ketamina anestetico cocktail (xilazina 2.5-5 mg/kg + acepromazina 1.0-2.5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) utilizzando una siringa ago 26-28 G.  Animale sarà monitorati ogni 15 minuti durante la procedura e anestetico si aggiungeranno come necessario a ¼ della dose originale.
  3. Posizionare il mouse su una fonte di calore adeguata (37 ° C riscaldamento pad, animale protetto dal contatto diretto con il rilievo di riscaldamento) e monitorare visivamente la frequenza respiratoria.
  4. Controllare i riflessi usando la punta pizzico risposta. Garantire che l'animale è completamente sotto anestesia prima di iniziare qualsiasi procedure chirurgiche.
  5. Uso un 26-28 calibro ago siringa per dare topi un'iniezione della vena della coda di un marcatore fluorescente vascolare (destrano, 100 μL di soluzione di 20 mg/mL).
  6. Applicare unguento oculare IFP in entrambi gli occhi. Clip della superficie dorsale della testa dell'animale con piccoli tagliatori elettrici. Applicare una crema depilatoria per 5 min. utilizzare spugne garza rimuovere la crema e poi sciacquare con soluzione fisiologica. Preparare il cuoio capelluto pulito con alcol al 70% con un batuffolo di cotone.
  7. Utilizzare una pinzetta e forbice per fare un'incisione della pelle del midline piccole (10-20 mm) sul cuoio capelluto per esporre la superficie dorsale teschio sottostante. Utilizzare seta chirurgica 5-0 per due soggiorno suture in pelle su ogni lato dell'incisione, creazione di un lembo per esporre la volta cranica per l'imaging.
  8. Posizionare i mouse sulla loro schiena e immergere il cuoio capelluto esposto in un piatto fondo di vetro riempito con olio di microscopio. Trasportare l'animale a mutiphoton camera di imaging.
  9. Metti l'animale sul palco microscopio con calvarium posizionato sul piatto di vetro sopra l'obiettivo e poi coprire con un 37rilievo di riscaldamento ° C (l'animale deve essere protetto dal contatto diretto con il calore).

5. in Vivo Imaging ad alta risoluzione del Calvarium Mouse

  1. Utilizzare un sistema confocale invertito modificato per l'imaging multiphoton (Vedi materiali tavolo). Seguenti istruzioni sintonizzare un laser 2-fotone a 830 nm, posto a 20 W X, NA 0.95 lente obiettiva nel nasello di microscopio e controllare l'allineamento del fascio laser.
    Nota: Sistemi di microscopio verticale sono più comunemente utilizzati per questi studi, ma un sistema multifotonica invertito può anche essere utilizzato. In questo studio, è stato utilizzato un dispositivo stereotassiche personalizzato progettato atraumatica. Anche se ci sono diversi dispositivi stereotassiche commercialmente disponibile per i sistemi di microscopio dritto, non c'è nessun dispositivo stereotassica commercialmente disponibile per un sistema di microscopio invertito per assicurare il cranio del mouse. Come alternativa a un dispositivo personalizzato stereotassica, il cranio può essere fissato in posizione sopra l'obiettivo utilizzando diversi metodi di nastro o colla per la stabilità.
  2. Aprire un software di acquisizione immagini. Nella sezione "impostazioni di acquisizione" pannello Verifica se è selezionata una modalità di scansione direzionale. Impostare la velocità di scansione a 4 μs/pixel, frame rate a 512 x 512 pixel e zoom a 1.5. Selezionare 20 X W Na 0.95 obiettivo dall'elenco delle lenti obiettivo disponibili per abbinare l'obiettivo posizionato a ogiva.
  3. Accedere alla "lista di tintura" dal pannello "Controllo di acquisizione immagine" e selezionare "Due fotoni". Aprire la finestra di "Luce percorso & coloranti" e selezionare DM690-980 eccitazione DM. Apri l'otturatore laser 2P selezionando la casella di controllo nell'unità Laser 2. Nella finestra "Microscopio Controller", selezionare RDM690 specchio.
  4. Selezionare "EPI LAMP", scegliere cubo epi-filtro B/G e focalizzare l'obiettivo sul campione per visualizzare il flusso vascolare e la nicchia di midollo osseo calvarium, utilizzando come riferimento la biforcazione della vena centrale (a) e la sutura coronaria (b) (Figura 2A).
  5. Raccogliere immagini utilizzando la modalità non-descanned. Selezionare tre rivelatori esterni: PMT detector1 per raccogliere il segnale SHG di collagene (filtro di emissione - 430/100 nm), GaAsP detector2 a raccogliere GFP segnale (filtro di emissione - 525/50) e GaAsP detector3 per raccogliere il segnale di TRITC-destrano (filtro di emissione - 605/90 nm).
    1. Eseguire la creazione di immagini a una velocità di scansione di 4μs/pixel con nessun media per ridurre al minimo la fototossicità. Raccogliere immagini a un guadagno di potenza e rivelatore laser costante regolata per utilizzare l'intera gamma dinamica del rivelatore con saturazione minima.
    2. Raccogliere serie delle sezioni attraverso la profondità del tessuto (60 x 1 μm Z-stack) da 6 regioni del midollo osseo calvarium. Utilizzare le impostazioni di dimensione di passo di 1 μm, zoom 1.5 e grandezza di 512 x 512 pixel (423 µm x 423 µm).
      Nota: Nel complesso tempo totale richiesto per un mouse di immagine è 1-1,5 h.

6. analisi quantitativa

  1. Eseguire le ricostruzioni di quantificazione e 3D immagine utilizzando un software di quantificazione e la visualizzazione di immagini 3D/4D dedicati secondo le istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). Visualizzare in modo interattivo Z-stack in 3D utilizzando la massima intensità di proiezione (MIP), alfa-blend o algoritmi di rendering di ombra proiezione volume.
  2. Segmentare le cellule GFP utilizzando il "modulo di segmentazione di Spot oggetto". Applicare l'elaborazione dello stack aritmetica (sottrazione di canale) per eliminare i false positive conte di cellule GFP (questo Elimina il segnale di cellule ossee visualizzazione forte fluorescenza nei canali verde e rosso).
  3. Eseguire la segmentazione della superficie dell'osso e del sistema vascolare, utilizzando il modulo di superficie segmentazione. Se necessario, calcolare le distanze delle cellule a qualsiasi delle suddette superfici applicando algoritmi di X-tension, chiamati "distanza di punto di superficie".

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Representative Results

Coorti di 2 RBPJKO e 2 RBPJWT destinatari erano imaged in una singola sessione di imaging in diversi momenti: 24 h e 2, 4 e 6 settimane dopo il trapianto di cellule BM Lys-GFP (flusso di lavoro è illustrato in Figura 1A).

In ogni mouse, le immagini sono state acquisite da 6 regioni standard del calvarium BM, identificati dalla loro posizione in relazione alla biforcazione della vena centrale (Figura 2A, un) e la sutura coronaria (Figura 2A, b). Iniezione del dextrano del Texas-Red prima di imaging permette l'identificazione di questi punti di riferimento e la selezione di 6 regioni (Figura 2A): in alto a sinistra, Medium e diritto (UL, UM, UR) e in basso a sinistra, Medium e diritto (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-stack vengono raccolti da ogni regione e il rendering come 3-d massima intensità Projection (MIP), (fig. 2B); Proiezione 3D Shadow, che include il componente di osso (grigio) generato da microscopia del seconda generazione armonica (SHG) sondaggio organizzazione di collagene (Figura 2); e infine, un'immagine 3D Segmented, che permette la quantificazione delle cellule e la misurazione delle loro distanze dall'osso e i vasi (Figura 2D).

A causa di differenze di potenziale nelle preferenze di homing delle cellule emopoietiche nelle diverse regioni del calvarium BM dopo trapianto, è importante assaggiare più aree nel calvarium di ogni mouse. La figura 3 Mostra un esempio di distribuzione delle cellule nelle 6 regioni analizzate in un RBPJWT e un RBPJKO destinatario a 2 settimane dopo BMT (verde - cellule mieloidi, grigio-osso) utilizzando l'algoritmo di rendering 3D di proiezione ombra. Numero di celle per regione variato da 64 a 258 nel topo RBPJWT e da 265 a 573 nel topo RBPJKO. Risultati finali sono quindi espressi come numero medio delle 6 regioni analizzate: numero di celle per regione / per topo (media 135 a RBPJWT vs 469 in RBPJKO). Questo esperimento rappresentanza indica che c'è una più grande variazione nella distribuzione delle cellule per regione in RBPJWT che nel destinatario RBPJKO. Inoltre, oltre alla variazione trovata nelle regioni calvarium all'interno di un mouse, che è comune, ci sono variazioni tra topi individuali all'interno del gruppo stesso. Quindi, è importante che per ogni punto di tempo almeno 4 topi sono valutati ogni esperimento per ottenere un minimo di un totale 24 a 30 regioni per essere analizzati per condizione.

La figura 4 Mostra la dinamica di espansione progenitrici mieloidi in un microambiente di BM difettoso tacca rispetto al controllo oltre 6 settimane dopo il trapianto. In questo esperimento rappresentativo, RBPJWT 8 e 8 RBPJKO topi sono stati trapiantati ed imaged presso i punti di tempo indicato (2 RBPJWT topi e 2 RBPJKO topi in ogni punto del tempo). Figura 4A Mostra una ricostruzione 3D rappresentanza delle regioni 1 su 6 ha acquisito. Celle in ognuna delle 6 regioni sono stati contati e il numero medio di cellule/regione di due topi in ogni momento (Totale 12 regioni) è stato calcolato per i destinatari RBPJWT e RBPJKO (Figura 4). Questa analisi indica che: (i) le cellule erogarici Lys-GFP in RBPJWT e RBPJKO i destinatari hanno un'efficienza di homing simile; II) le cellule nei destinatari del RBPJKO espandere più rapidamente e sono due volte il numero di cellule nei destinatari del RBPJWT alla settimana 2 dopo BMT; III) le cellule nei destinatari RBPJWT espandere più tardi e sono 2 volte superiore rispetto alle cellule nei destinatari RBPJKO alla settimana 4 dopo BMT; e iv) numero di cellulare nei destinatari sia RBPJWT e RBPJKO diventano simili alla settimana 6 dopo BMT. Analisi delle cellule mieloidi del donatore nel PB indica una maggiore produzione di cellule mieloidi dai destinatari del BM di RBPJKO rispetto ai destinatari di BM di RBPJWT alla settimana 4, al momento quando i topi di BM di RBPJKO hanno mostrato un minor contenuto di celle di Lys-GFP. L'analisi combinata di cellule mieloidi residente in BM e di cellule mieloidi circolanti nel PB, indicano che il BM di RBPJKO cellule di Lys-GFP microambiente espandere e sono pronte a mobilitare più rapidamente. Parallela analisi Citofluorimetrica delle cellule di Lys-GFP in ossa lunghe BM da stessi topi ha mostrato una tendenza simile a quella osservata da IVFM; Tuttavia, le differenze tra le condizioni erano che meno pronunciati (Figura 4B).

Misurazione della distanza delle singole celle di Lys-GFP dall'osso o il sistema vascolare è indicata nella Figura 5. In questo studio rappresentativo, analisi di segmentazione 3D della regione LM del calvarium RBPJWT e RBPJKO a 6 settimane da BMT è stata usata (Figura 5A). Distanza dall'osso e i vasi sono stati calcolati per ogni cella nell'area: 200 cellule in cellule di 255 in RBPJKO e RBPJWT e, pertanto, espresso come media. L'analisi dimostra che le cellule di Lys-GFP localizzare a distanza simile dall'osso nei topi RBPJWT e RBPJKO (11 μm), ma che si trovano più distanti dal sistema vascolare nei topi RBPJKO che nei topi RBPJWT (15 μm vs 5 μm, rispettivamente). Questo risultato è intrigante, come nella RBPJKO topi Lys-GFP cellule mobilitati nella circolazione più che nei topi di RBJWT e sarebbero quindi essere previsto per localizzare il più vicino ai vasi. Tuttavia, è possibile che la differenza nella localizzazione riflette una diversa fase di differenziazione di queste due popolazioni (in RBPJWT e RBPJKO), un punto che non può essere affrontato da questa analisi. Il significato di questo risultato sarà essere continuati con una piscina più grande di cellule in tutte le 6 regioni e combinando l'analisi di FACS.

Nel complesso, non ottimali risultati si ottengono quando un piccolo numero di regioni è analizzato per topo. La formazione immagine è particolarmente difficile nei primi punti di tempo dopo BMT, come irradiazione letale danneggia il sistema vascolare e perdita di destrano dai capillari riduce la definizione dell'immagine. Pertanto, è importante avere un gran numero di ripetizioni, soprattutto presso i primi punti di tempo.

SHG è uno strumento utile per indagare l'organizzazione di fibre di collagene in 3D. È un processo ottico non lineare di secondo ordine che trae origine da strutture quali le fibre di collagene che possiede non-centrosymmetry e un alto coefficiente non lineare del secondo ordine. Quando intensa luce incidente interagisce con tali strutture, che genera luce al doppio della frequenza degli incidenti o mezza lunghezza d'onda incidente. Pertanto, nessuna etichettatura è necessario al fine di catturare il segnale SHG durante 2-fotone microscopia. Con lunghezza d'onda di eccitazione nm 830, catturiamo segnale SHG nel canale blu con emissione filtro 430/100 nm.

Figure 1
Figura 1: Sperimentale Workflow. (A) induzione di Mx1-Cre/RBPJlox/lox topi per generare RBPJKO e RBPJWT topi ~ 4 settimane precedenti di immagine; (B) preparazione di BM cellule da topi transgenici di Lys-GFP; (C) trapianto di BM Lys-GFP di celle in irradiati letalmente RBPJKO o RBPJWT destinatari; (D) IVFM della volta cranica del mouse a 24 h, 2, 4 e 6 settimane dopo BMT, seguita da analisi di BM di FACS e l'eutanasia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: IVFM della nicchia vascolare BM. (A) immagine di multi-fotone mosaico della volta cranica del mouse di Lys-EGFP mostrando le 6 regioni standard di imaging (UL: in alto a sinistra, alla messaggistica unificata: medio alta, UR: in alto a destra, LL: in basso a sinistra, LM: Lower middle, LR: in basso a destra) (cellule mieloidi, verde, rosso, sistema vascolare; grigio, osso) Ingrandimento 10x; (B-D) Dettaglio di nicchia BM sottoposto a rendering come: MIP (B), (C) 3-d proiezione delle ombre, immagine 3-d di segmentazione (D). Le immagini sono state elaborate - utilizzando un software di quantificazione e visualizzazione di immagini 3D/4D dedicati (tabella 1). Scala bar = 50 μm in B, C, D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Cellule mieloidi Engraftment alla settimana 2. Immagini delle cellule di Lys-GFP (verde) e dell'osso in superficie (grigio) in 6 regioni BM dall'osso calvarium di uno RBPJWT e uno RBPJKO mouse (u: superiore, l: a sinistra, m: medio, r: diritto). Scala bar = 50 μm. Grafici a barre (a destra) indicano il numero di cellule contate in ciascuna regione (gamma RBPJWT 64-258; RBPJKO gamma 265-573) e il loro numero medio 135 STD + /-73 e 469 STD + /-121. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Cinetica di attecchimento di cellule mieloidi e Output segue BMT. (A) cellule di immagini di Lys-GFP (verde) e superficie ossea (grigio) in una regione rappresentanza dalla volta cranica di un mouse RBPJWT e RBPJKO in ogni punto il tempo indicato. Scala bar = 50 μm; (B) Dot macchie Visualizza percentuale di Lys-GFP cellule positive tramite flusso cytometry entro il BM delle ossa lunghe raccolte dal mouse stesso imaging in vivo (Vedi sopra). (C) grafici a barre indicano il numero medio di cellule/regione in 2 topi (Totale 12 regioni) in ciascun punto di tempo, + /-STD (D) linea grafico mostra aumento del numero totale dei neutrofili (enumerati da contatore di cellule) presentato nel PB di stessi topi rispetto in (A) presso i punti di tempo indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Localizzazione delle cellule mieloidi nel parente di BM fino all'osso e al sistema vascolare. (A) immagini segmentate 3D rappresentative delle cellule di Lys-GFP e sistema vascolare e cellule di Lys-GFP e osso nella stessa regione dell'osso della volta cranica nei destinatari RBPJWT e RBPJKO alla settimana 6 da BMT. Scala bar = 50 μm. (B) Bar grafico riassume la distanza media in μm + /-cellule di SEM di Lys-GFP dalla superficie dell'osso o del sistema vascolare. Numero delle cellule misurata in: RBPJWT n = 200 cellule e RBPJKO n = 255 celle. Distanza delle cellule di Lys-GFP dal sistema vascolare è maggiore in RBPJKO topi RBPJWT, p < 0,001 (test t di Student). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive un disegno sperimentale ottimizzato per studiare la cinetica di attecchimento di cellule ematopoietiche da microscopia di fluorescenza Intravital. In questo studio, l'espansione di cellule progenitrici mieloidi in un BM WT o in una tacca di segnalazione difettosa BM è stato registrato in calvarium osseo dalle cellule mieloidi positive di Lys-GFP seguente dopo BMT in destinatari RBPJWT o RBPJKO. Questo approccio è proposto come un modello che può essere applicato per affrontare simili questioni, per esempio: io) per determinare l'espansione e la localizzazione nelle nicchie BM delle cellule di altri lignaggi, come degli eritrociti linfoidi, o cellule megakaryocytic, utilizzando come cellule del donatore cellule ematopoietiche che trasportano promotori specifici di stirpe guida GFP o rosso pomodoro; II) per valutare diversi fattori determinanti micro-ambientali utilizzando altre specifica KO o topi transgenici come destinatari.

Forza del presente protocollo imaging all'osso della volta cranica, è che i limiti anatomici utilizzati per selezionare le regioni di BM, biforcazione della vena centrale e la sutura coronaria, sono ragionevolmente conservati in tutti i topi, permettendo la coerenza tra i singoli esperimenti mentre il requisito di una fase automatica di rinunciare. Inoltre, l'uso del modello GFP per tenere traccia di cellule ematopoietiche rivelato per essere molto efficace, come GFP fornito un segnale stabile in condizioni non ottimali, come ad esempio dopo irradiazione. Infine, il set-up imaging descritto, usando un microscopio invertito e un dispositivo stereotassica su misura in cui il mouse è in posizione supina, minimizzare notevolmente gli artefatti di respirazione.

Due aspetti di questo disegno sperimentale, se attuato, potrebbero portare a un uso più ampio e più efficace del IVFM del calvarium. In primo luogo, è importante ottimizzare e standardizzare i protocolli di longitudinale imaging che permette l'osservazione dello stesso mouse in diversi momenti (dal 2 ° giorno a diverse settimane) dopo intervento (cioè BMT o terapia) invece di utilizzare coorti indipendente dei topi. Come questo approccio richiede condizioni adeguate per il recupero post-operatorio e l'utilizzo di misure volte a contrastare l'infiammazione, infezione e formazione presso il sito dell'imaging della cicatrice, la sua applicazione è attualmente limitata. In secondo luogo, sarà preziosa per sviluppare una matrice di lignaggio rilevamento modelli murini che trasportano le proteine fluorescenti in specifiche cellule della nicchia BM (vascolare, endosteal, perivascolare e neuronale) per combinare le funzioni delle cellule ematopoietiche con specifiche caratteristiche delle nicchie BM.

La formazione immagine dell'osso ha ancora alcune sfide e limitazioni rispetto ad altri tessuti. Anche se il microscopio a due fotoni possa penetrare profondamente nei tessuti 100-1.000 micron, è comunque impegnativo all'immagine attraverso l'intero spessore dell'osso calvarium. Le immagini perdono di qualità con l'aumento di profondità così il protocollo qui descrive un'analisi affidabile delle regioni BM da pile spessore 60 micron. Un altro fattore che può provocare incoerenza o suboptimale imaging è la forma curva dell'osso calvarium, che può portare l'immagine fuori fuoco. È fondamentale avere il cranio perfettamente posizionato sul piatto di vetro sopra l'obiettivo, possibilmente con un dispositivo stereotassica. Infatti, è importante la dimensione del cranio: cranio di topi troppo giovani o troppo piccoli non aderisca perfettamente in un determinato dispositivo stereotassica. Ad esempio, il dispositivo utilizzato qui non va bene topi di età inferiore a 6 settimane e meno di 20 g.

Un'ulteriore limitazione è che il sistema di imaging utilizzato in questo studio è limitato a 3 canali. Il canale blu viene automaticamente assegnato a raccogliere non-etichettatura di segnale SHG base del collagene dell'osso, solo 2 canali sono disponibili per l'etichettatura di fluorescenza specifica. Inoltre, questo sistema ha un limite di velocità di 1 frame/s a 2 μs/pixel dwell time e grandezza di 512 x 512 pixel, che non è ideale per i processi di dinamici veloce (ad esempio di misura di flusso sanguigno e la valutazione della mobilizzazione di cellule nel flusso sanguigno).

Una sfida significativa è che l'irradiazione eseguita per compromessi BMT l'integrità del sistema vascolare. La perdita vascolare presente in BM dopo irradiazione provoca difficoltà con segmentazione/quantificazione delle singole strutture, che può comportare difficoltà nell'analisi quantitativa.

Infine, è importante considerare che la formazione immagine del mouse prende circa 1 h, e il numero dei topi che possono essere imaged in un dato giorno è limitato (~ 4 a 6 topi). Così, aumento della dimensione del campione per ottenere la potenza di analisi potrebbe richiedere più esperimenti indipendenti, che possono aumentare la variabilità.

A seguito di questo protocollo, il numero di cellule ematopoietiche rilevate dal IVFM in BM dopo 24 h da BMT è ~ 30 cellule/regione e le cellule di Lys-GFP+ è piuttosto un piccolo numero rispetto all'ingresso iniziale delle cellule (3 x 106). Anche se parte di questo problema è dovuto a cella intrappolamento nel polmone e fegato prima di homing al BM segue l'iniezione i.v., resta da essere esplorato se ci sono regioni in calvarium diversi da quelli selezionati dove le cellule trapiantate home al più alto efficienza.

Homing ed engraftment delle cellule in BM dopo BMT sono comunemente seguite da citometria a flusso di misura degli indicatori CD45.1/CD45.2, GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) o combinazione di lignaggio e gli indicatori delle cellule staminali. L'uso di IVFM, soprattutto nei primi punti di tempo, rende disponibili informazioni uniche e altre che non possono essere fornite tramite flusso cytometry. Ad esempio, spesso non è facile distinguere dagli eventi di FACS che sono "cellule" da eventi che sono "artefatti", in particolare quando viene raccolto un numero basso di eventi positivi (cioè a 24 h da BMT). IVFM fornisce informazioni sulla morfologia e localizzazione delle cellule che aiuta questa distinzione. Allo stesso modo, analisi Citofluorimetrica delle cellule ematopoietiche BM raccolte da vampate di calore o schiantarsi le ossa includerà le cellule che erano residenti nella nicchia e le cellule che erano già in circolazione nel sistema vascolare. Infatti, IVFM permette la distinzione e la valutazione delle cellule a riposo all'interno della nicchia di BM e cellule che si stanno mobilitando nel flusso sanguigno. Questa distinzione è di grande valore, quando si studia la cinetica di homing, di localizzazione, di differenziazione e di mobilitazione in un dato modello. D'importanza, IVFM può fornire informazioni univoche sulla posizione delle cellule ematopoietiche rispetto le cellule del microambiente che costituiscono una specifica nicchia.

Sono stati utilizzati altri metodi utilizzati per affrontare la composizione della nicchia BM, tali analisi istologica. Confronto tra microscopia intravital del BM e l'analisi istologica mediante microscopia confocale è stato discusso accuratamente ed elegantemente da Lo Celso et al. 18.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

La formazione immagine è stata effettuata nel centro Indiana per microscopia biologica presso l'Indiana University, diretto da Dr. Ken Dunn. Il dispositivo stereotassica è un prototipo progettato e realizzato da Mark Soonpaa, Wells Center per la ricerca pediatrica. Questo lavoro è stato supportato da NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN research Foundation (NC) e la collaborazione di CTSI progetto IUSM/Notre Dame (NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

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References

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