Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Los monocitos son células inmunes innatas que se pueden activar por patógenos y la inflamación asociados con ciertas enfermedades inflamatorias crónicas. La activación de monocitos induce funciones efectoras y un cambio concomitante de oxidativo con el metabolismo glicolítico que se acompaña de aumento de la expresión del transportador de glucosa. Este aumento del metabolismo glicolítico se observa también para la inmunidad entrenado de los monocitos, una forma de memoria inmunológica innata. Aunque se han descrito los protocolos in vitro que examinan la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos, ninguno ha sido examinado por el flujo multi-paramétrico citometría en la sangre entera. Se describe un protocolo de citometría de flujo multiparamétrica para la medición de la absorción de glucosa análogo 2-NBDG fluorescente en sangre entera por los monocitos totales y la clásica (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) y no clásica ( CD14 + CD16 ++) monocitossubpoblaciones. Este método se puede utilizar para examinar la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa para los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria, y se puede modificar fácilmente para examinar la captación de glucosa para otros leucocitos y subpoblaciones de leucocitos en la sangre.

Introduction

Los monocitos son un componente importante del sistema inmunitario innato humano que se movilizó rápidamente a los sitios de infección e inflamación 1. La activación de los monocitos es crítico para limitar los daños por patógenos aguda y también es central en la patogénesis de varias enfermedades crónicas, incluyendo la aterosclerosis 2, cáncer de 3, y el VIH 4,5.

El metabolismo de reposo y monocitos activados difiere drásticamente, con monocitos en reposo que utilizan el metabolismo oxidativo y monocitos activados que utilizan el metabolismo glucolítico (es decir, la fermentación de la glucosa a lactato) 6. La activación de los monocitos induce la expresión de los transportadores de glucosa que permite un aumento de la captación de glucosa para el metabolismo glucolítico 7. glucosa monocitos transportador 1 (Glut1) es uno de esos transportador upregulated durante la activación y su expresión se ha demostrado que conducen a la producción de citoquinas pro-inflamatorias en vitro y en el tejido adiposo de ratones obesos 8. La infección de una línea celular de monocitos por el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi conduce a la regulación positiva celular de Glut1 9, y recientemente hemos demostrado que durante la infección crónica por el VIH un aumento del porcentaje de monocitos que expresan GLUT1 están presentes durante la infección terapia antirretroviral tratados y sin tratar 10 de combinación. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que la captación de glucosa y el metabolismo glicolítico por los monocitos son aspectos importantes de muchas enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, un método simple para medir la expresión Glut1 de monocitos y la captación de glucosa durante la homeostasis y la enfermedad inflamatoria es probable que sea de utilidad para una amplia gama de investigadores.

Los monocitos humanos son heterogéneos, que se compone de tres subconjuntos distintos que se pueden examinar por la expresión diferencial de la CD14 y marcadores de superficie celular CD16 11,12. monocitos clásicas expresan un alto nivel de CD14 pero no expresan CD16 (CD14 CD16 ++ -), monocitos intermedios expresan un alto nivel de CD14 y un nivel intermedio de CD16 (CD14 ++ CD16 +), y no clásica monocitos expresan un bajo nivel de CD14 y un alto nivel de CD16 (CD14 + CD16 ++). Los monocitos que expresan CD16 se denominan monocitos CD16 +, que compararon a CD16 - monocitos tienen una alta expresión de citoquinas inflamatorias y la capacidad de forma más efectiva presentan antígenos 13,14. Aproximadamente el 10% de los monocitos expresan CD16 durante homeostasis con porcentajes más altos observados durante la inflamación 15. Subpoblaciones de monocitos están asociados con ciertos estados de enfermedad y podrían ser marcadores biológicos útiles de progresión de la enfermedad y la enfermedad 16.

Nuestro objetivo era identificar un método que puede medir la expresión del transportador de glucosa y la captación de glucosa por los monocitos humanos y subpoblaciones de monocitos en condiciones lo más cercanas a phycondiciones siological como sea posible. Estudios anteriores miden la expresión del transportador de glucosa de monocitos y la captación de glucosa 17,18, aunque estos métodos examinados monocitos aislados que pueden haber alterado la expresión de proteínas en comparación con las condiciones fisiológicas 19, y ningún estudio previo ha examinado las subpoblaciones de monocitos humanos. El uso de flujo multi-paramétrico citometría, se describe un método para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción del análogo de la glucosa fluorescente 2-NBDG por los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos (basado en CD14 y la expresión de CD16) dentro de la sangre no manipulada conjunto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: infectados por el VIH y los sujetos no infectados por VIH fueron reclutados de la Unidad de Enfermedades Infecciosas en el Hospital Alfred en Melbourne, VIC, Australia, y de la comunidad local, respectivamente. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes, y la investigación fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Hospital Alfred.

1. Glut1 Detección de la superficie celular en monocitos y monocitos subpoblaciones

  1. Recoger la sangre en tubos anticoagulantes de citrato ACD-B y comenzar los experimentos en una cabina de seguridad biológica dentro de 1 hora de recogida.
  2. Añadir 100 ml de sangre a tubos de polipropileno. Añadir 2 ml de solución de lisis 1x (véase la Tabla de Materiales) a los tubos, mientras que en el hielo, pipeteado suavemente para mezclar. Incubar durante 15 minutos en hielo. Centrifugar a 220 xg durante 5 min.
  3. Decantar y lavar dos veces mediante la adición de aproximadamente 2-4 ml de solución de lavado (0,5% de BSA en PBS 1x) y centrifugación a 220 xg durante 5 min.
  4. Use un tuboTTE para eliminar cuidadosamente como gran parte de la solución de lavado como sea posible. Se colocan los tubos en hielo y volver a suspender en 100 l de solución de lavado.
  5. Para identificar las subpoblaciones de monocitos específicos tiñen las células con el siguiente volumen de anticuerpos por cada 100 l de suspensión celular preparada en el paso 1.4: 5 l anti-CD3-PE, 5 l anti-CD14-APC, 5 l anti-CD16-PECy7, 5 l Glut1 FITC o IgG2b-FITC (tubo de control de isotipo).
  6. Colocar en hielo durante 30 min en la oscuridad. Lavar 2 veces con solución de lavado. Fijar con 200-300 l de formaldehído al 0,5% en PBS 1x hecho.
  7. El análisis en un citómetro de flujo capaz de detectar 4 colores dentro de las 24 horas dentro de la siguiente onda de excitación y emisión: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. la captación de glucosa por los monocitos

  1. Pipeta 90 l de sangre recogida en el paso 1.1 en tubos de polipropileno. Añadir 10 l de una solución de trabajo de 14.60 M-2 a NBDGlos 90 l de sangre (1,46 mM concentración final) y golpee suavemente para mezclar. Es crítico para limitar 2-NBDG exposición a la luz cubriendo tubos con papel de aluminio.
  2. Se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 15-30 minutos y luego se coloca inmediatamente en hielo. Añadir 4 ml de 1x FACS solución a tubos de lisis, mientras que en hielo. Centrifugar a 220 xga 4 ° C durante 5 min.
  3. Lavar una vez mediante la adición de 4 ml de solución de lavado (0,5% de BSA en PBS 1x). Centrifugar a 220 xga 4 ° C durante 5 min. Se decanta y el lugar en el hielo.
  4. Las células se tiñen con anticuerpos: 5 l anti-CD3-PE, 5 l anti-CD14-APC y 5 l anti-CD16-PECy7. Mezclar y colocar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
    NOTA: Durante este período asegúrese de que el citómetro de flujo está listo para su análisis inmediato. Adquirir las células dentro de la siguiente onda de excitación y emisión: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Se añaden 4 ml de tampón de lavado helado (0,5% de BSA en PBS 1x) a los tubos.Lavar una vez por centrifugación a 220 xg en 4 ° C durante 5 min. Se decanta y se añade 200-300 l de hielo de edad PBS y mantener en hielo en la oscuridad (cubierto con papel de aluminio). El análisis en un citómetro de flujo dentro de los 10 minutos utilizando la excitación y la configuración de onda de emisión como en el paso 2.4.

3. Adquisición y Análisis de Datos

NOTA: Se asume que un conocimiento de la citometría de flujo y análisis de datos.

  1. El uso de un citómetro de flujo capaz de análisis de al menos 4-color, ajustar la compensación utilizando muestras no teñidas y se tiñeron de forma individual.
    NOTA: tinción única utilizando una CD4 marcado con FITC y CD14 puede ser utilizado para Glut1 y compensación 2-NBDG.
  2. Configurar y etiquetar las ventanas apropiadas antes de la adquisición de muestras. Dibuje una puerta alrededor de la población de monocitos, y adquirir 100.000 y 300.000 eventos por muestra a tipo de medio. 50.000 eventos por muestra de compensación es suficiente.
    NOTA: La compensación puede ser llevada a cabo antes de probaradquisición o en el software solo análisis celular, siguiendo los procedimientos estándar.
  3. Exportar y guardar los datos en un lugar adecuado. Abre el software de análisis único de células tales como FlowJo u otro software de análisis (Adicional Figura 1) y las muestras de arrastrar y soltar como se especifica (Adicional Figura 2).
  4. Haga doble clic para abrir el archivo (Adicional Figura 3). Dibujar un círculo con los monocitos basa en la cara y las propiedades de dispersión de lado como se muestra en la Figura 1A y Figura Adicional 4 puerta. Doble clic en la población de monocitos. Observar y dibujar un cuadro alrededor del CD3 - población (Adicional Figura 4).
  5. Doble clic en el CD3 - población. Para observar las subpoblaciones de monocitos CD14-APC seleccionar en el eje 'x', y CD16-PECy7 en el eje 'y'-, y la etiqueta en consecuencia (Adicional Figura 5).
  6. Donde no hay diferenciapoblaciones positivas y negativas, medir la expresión de Glut1 o captación 2-NBDG en las subpoblaciones de monocitos específicos. Determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Glut1 y 2-NBDG restando el isotipo y sin fondo 2-NBDG (Adicional Figura 6).
  7. Cuando existan poblaciones definidas, utilice el IgG2b-FITC para establecer la puerta, y determinar las células positivas porcentuales (Figura 3).
    NOTA: Utilice este procedimiento para analizar los monocitos CD14 + totales. Ya que la captación de 2 NBDG suele estar marcada por un cambio en la intensidad de fluorescencia de los datos está mejor representado por las IFM y los histogramas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La compensación debe ser realizada por fluorocromos individuales para prevenir las fluorescencias. Los monocitos son primero enriquecidas mediante la selección sobre la base de dispersión frontal y lateral. Las parcelas presentados son representantes de al menos seis experimentos independientes llevados a cabo en toda la sangre de seis o más participantes como se informó anteriormente 10 La figura 1A muestra la gating inicial de los monocitos por dispersión celular y la exclusión de las células T por gating dentro del CD3 -. Población. Los monocitos son entonces cerrado para la expresión de CD14 solo o en combinación con CD16 para identificar monocitos totales o subpoblaciones de monocitos, como se muestra en la Figura 1B y la Figura 1C, respectivamente. Para el análisis de subpoblaciones de monocitos, la siguiente nomenclatura se debe aplicar como se ha descrito previamente 12: monocitos clásicos (CD14 ++ CD16 -) debe expresar aproximadamente 100 veces mayor CD14 MFI que el control de isotipo y CD16 MFI debe ser similar a la de control de isotipo; monocitos intermedios (CD14 + CD16 ++) deben expresar aproximadamente 100 veces mayor que el CD14 IFM control de isotipo y aproximadamente 10 veces mayor CD16 IMF en comparación con el control de isotipo; monocitos no clásicos (CD14 + CD16 ++) deben tener MFI similar para CD14 y el control de isotipo y aproximadamente 100 veces mayor CD16 MFI que el control de isotipo. Las células sin expresión de CD14 y CD16 no son considerados monocitos y no deben ser incluidos en gating. Gated monocitos o subpoblaciones de monocitos pueden entonces ser examinados para la expresión del transportador de glucosa. Como se indica en la Figura 2, se pueden observar distintas poblaciones de CD14 + monocitos GLUT1 +, más notablemente en células obtenidas de individuos VIH +, donde la infección se caracteriza por un estado crónico de inflamación. Similar pero rara CD14 + células GLUT1 + puede ser observed dentro de subconjuntos de monocitos específicos en personas no infectadas por VIH (Figura 3A), pero son más pronunciadas en los individuos VIH + (Figura 3B). Digno de mención, en ausencia de poblaciones distintas, puede ser apropiado para representar los resultados como intensidades florescence Mediana Media o, lo que tiene en cuenta el incremento acumulado en la expresión de la superficie celular Glut1.

La captación de glucosa puede evaluarse mediante la comparación de la sangre entera se incubaron con 2-NBDG o control del vehículo para los monocitos cerradas o subpoblaciones de monocitos. Anteriormente puso de manifiesto que aproximadamente el 50% de los monocitos eran 2-NBDG positiva después de una incubación de 15 minutos 10. Este nivel de absorción permite la detección de 2-NBDG sin saturación de llegar, cuando ya no pueden existir diferencias en la captación de monocitos-2 NBDG. Análisis de la captación de 2-NBDG por los monocitos de VIH y no infectadas por VIH + personas reveló una mayor captación por las células de las personas VIH +, queestá de acuerdo con los datos de expresión Glut1 (Figura 4-5). En general, estos resultados ilustran que los ensayos descritos aquí se pueden utilizar para estudiar potencialmente las actividades de monocitos metabólicos en contextos biológicos que provocan un estado inflamatorio tales como diabetes, enfermedades cardiovasculares, y las infecciones virales y bacterianas.

Figura 1
Figura 1:. Compuertas a la estrategia utilizada para analizar los monocitos totales y subpoblaciones de monocitos de VIH representativa y muestras VIH + de sangre Las muestras de sangre entera se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de la superficie celular de monocitos Glut1 el plazo de 1 h de la colección. Las células (A) fueron con acceso basado en características dispersión frontal y lateral y la expresión de CD3. (B) Para examinar los monocitos totales, CD3 - células fueron entonces cerrado para la expresión de CD14. (C Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:.. Análisis de la expresión Glut1 superficie celular en monocitos totales de VIH representativa y muestras VIH + sanguíneos CD14 + monocitos de los no infectados por VIH o el tratamiento personas ingenuas fueron teñidas con control de isotipo marcado con FITC o anticuerpo Glut1 infectados por el VIH Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3:. Análisis de la expresión Glut1 superficie celular en subpoblaciones de monocitos de VIH representativa y muestras + de sangre de VIH subpoblaciones de monocitos fueron teñidas con control de isotipo marcado con FITC o anticuerpo Glut1 (B) para el tratamiento del VIH-infectada (A) sin VIH o ingenuo muestras de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. La captación de 2-NBDG por CD14 totales + monocitos de VIH representante y el VIH muestras de sangre + de sangre de tratamiento de personas no tratados previamente no infectadas por VIH o VIH-infectados se incubó con vehículo o 2-NBDG a una concentración final de1,46 M durante 15 min antes del lavado y la incubación con los anticuerpos de la superficie celular de monocitos a la puerta tal como se describe en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. La captación de 2-NBDG por subpoblaciones de monocitos de VIH representativa y VIH + muestras de sangre completa La sangre de tratamiento de personas no tratados previamente no infectadas por VIH o VIH-infectados se incubó con vehículo o 2-NBDG a una concentración final de 1,46 mM para 15 min antes del lavado y la incubación con los anticuerpos de la superficie celular a subpoblaciones de monocitos puerta como se describe en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

together.within-page = "1"> Supp. Figura 1
Adicional Figura 1:. Ventana área para citometría de flujo software de análisis celular Haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

Supp. Figura 2
Adicional Figura 2:. Los datos de muestra se arrastrar y soltar en este espacio de trabajo Haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Adicional Figura 3: Las muestras de espacio de trabajo, los datos 085 se hace doble clic, y una segunda ventana apareció mostrando las tres principales poblaciones de células (linfocitos, monocitos y neutrófilos) dentro de la nueva muestra de sangre entera basa en la cara (FSC) y dispersión lateral (SSC) . Haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

Supp. Figura 4
Adicional Figura 4: Los monocitos son cerradas basan en adelante (FSC) y dispersión lateral (SSC). La población se ha hecho clic doble que hizo subir a una nueva ventana. CD3 está seleccionada en la "x" eje y CD3-negativas población (Supresión linfocitos) fue selecto. Haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

Supp. Figura 5
Adicional Figura 5: El CD3 - población de monocitos se ha hecho clic doble que hizo subir a una nueva ventana en la subpoblación de monocitos podría definirse sobre la base de CD16 y CD14 expresión. Por favor, haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

Supp. Figura 6
Adicional Figura 6: Msubpoblaciones onocyte son seleccionados, y la expresión de la superficie celular Glut1 (intensidad media de fluorescencia: IMF) se obtiene mediante la selección de "estadística" en la ventana del histograma, "media" de la ventana "añadir estadísticas ', y seleccionando Glut1 desde el" parámetro "desplegable menú. Haga clic aquí para ver o descargar esta cifra complementaria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El protocolo descrito aquí detalla un método simple para examinar la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa análogo fluorescente por monocitos y monocitos subpoblaciones en la sangre entera. Mediante la evaluación de la captación de 2-NBDG en sangre entera, esta técnica permite condiciones similares a las in vivo. Un estudio anterior examinó 6-NBDG captación en monocitos resultantes de la separación por centrifugación de densidad 17. Sin embargo, este estudio no examinó las subpoblaciones de monocitos y la separación de los monocitos de sangre entera puede potencialmente alterar la expresión de ciertas moléculas de la superficie celular 19. Trazadores radiactivos de glucosa también se han utilizado para medir la captación de monocitos de la glucosa 20,21, pero los monocitos deben ser aislado previamente para este procedimiento y el uso de la radiactividad requiere precauciones de seguridad significativos. Nuestro protocolo utiliza procedimientos de bioseguridad de rutina y es mínimamente manipulador, permitiendo así la medición de citometría de flujo de 2-NBDGla captación por los monocitos y las subpoblaciones de monocitos que imitan las condiciones in vivo.

2-NBDG entra en la vía glucolítica y se ha demostrado para ser metabolizado por las células en moléculas no fluorescentes 22. Por lo tanto, es fundamental para limitar el metabolismo después del 2-NBDG incubación manteniendo las células refrigeradas a 4 ° C. 6-NBDG es otro análogo de la glucosa fluorescente que se puede utilizar pero es menos útil, ya que no entra en la vía glucolítica y por lo tanto no refleja con precisión el estado bioenergético de las células 23.

Si se utilizan fluorocromos con espectros superpuestos, la compensación se convierte en fundamental para impedir el vertido fluorocromo. En este protocolo se utiliza monocitos teñidos individualmente con CD14 y CD16 para establecer los parámetros de compensación, sino a la reparación de los marcadores de superficie celular también se puede realizar usando bolas de compensación.

Los granulocitos pueden expresar CD16, pero pueden ser excluidos por la SupresiónCD15 células que expresan. Sin embargo, gating estricto de monocitos basados ​​en las propiedades de dispersión de luz se puede limitar el número de granulocitos incluido en el análisis. Si un citómetro de flujo es una disposición con más canales, el marcador de granulocitos CD66b también se puede utilizar para excluir los granulocitos del análisis.

El anticuerpo Glut1 utilizado en este estudio se une a un epítopo de la superficie celular y por lo tanto no se une a intracelular Glut1. Un anticuerpo que se une a un epítopo Glut1 intracelular se puede utilizar para medir la expresión total de Glut1 monocitos, pero las células debe ser permeabilizadas antes de la tinción 10. Además de los monocitos, esta técnica puede ser utilizado para examinar la captación de glucosa y el metabolismo en otros leucocitos se encuentran dentro de la sangre. Hemos examinado ampliamente la absorción de células T de 2-NBDG usando el método descrito aquí, y también han examinado 2-NBDG absorción por las células NK 24. Para la detección exitosa de expresión Glut1 y la absorción de 2-NBDG es imperativo para limitarrastros de la memoria intermedia de color rojo lisis de glóbulos por lavado de las células con el exceso de tampón de lavado de acuerdo con el protocolo, y hemos encontrado que FITC o anticuerpo marcado con APC Glut1 dar mejores señales de que el PE o PerCP conjugados. No hemos investigado las razones para ello.

Dado que las células son metabólicamente activas incluso a bajas temperaturas, es crítico que, tras la incubación de 2 a 37 NBDG ° C, que los tubos se mantienen directamente en hielo y centrifugación a cabo a 4 ° C. En la fuerte señal de 2 NBDG ausencia, compruebe que la concentración correcta está siendo utilizado, reducir la exposición a la luz en la habitación y del gabinete de bioseguridad y cubre los tubos con papel de aluminio cuando sea apropiado. Optimización puede ser requerido por la creación de un curso de tiempo experimento captación de 2-NBDG para 5, 15, 20, 30, 60, y 90 min. Típicamente, el tiempo óptimo debería ser 10 a 60 min, dependiendo de los tipos de células y su estado de activación.

Una limitación importante con el ensayo de captación de 2-NBDG es sens ligerositivity junto con el hecho de que está siendo utilizado por las células. Por lo tanto, es importante limitar el número de muestras para asegurar que la última muestra se analiza dentro de 30 min de la primera. Una limitación biológica es que, a pesar de que la frecuencia de Glut1-expresión de monocitos no clásicos, y la expresión en monocitos no clásicos Glut1 fueron significativamente mayores que los monocitos clásicos, no existían diferencias en la absorción de 2-NBDG entre las dos subpoblaciones 10. Esto plantea la posibilidad de que otros Gluts, como GLUT3 y Glut4 expresan en monocitos pueden estar implicados en el metabolismo de la glucosa en diferentes contextos de enfermedades. También es posible que la actividad de Glut1 también puede estar regulada después de la traducción.

Una ventaja importante de nuestro protocolo de la captación de glucosa por citometría de flujo sobre el etiquetado de radioisótopos es la capacidad de combinar la técnica con el análisis inmunofenotípico para identificar y estudiar subpoblaciones específicas de células inmunes en small volumen de sangre. Además, el APC-conjugado anti-Glut1 se puede aplicar para analizar simultáneamente la expresión de la superficie celular y la absorción de Glut1 2-NBDG. Un cambio en la expresión Glut1 debido a la absorción de 2-NBDG no se ha demostrado anteriormente, pero esta posibilidad no puede ser descartada.

El aumento de la captación de glucosa y el metabolismo por las células inmunes es una característica de las células y los monocitos 25-27 T activadas. Estas células pueden ser activadas en respuesta a la infección por patógenos 28,29, y señales inflamatorias en condiciones tales como enfermedades autoinmunes como el lupus 30-32, y la obesidad y la diabetes de 8,33. También se requiere el aumento del metabolismo de la glucosa por la supervivencia de células de cáncer, el crecimiento y la metástasis 34. En particular, la desregulación metabólica en las células inmunes se ha convertido en una característica de la infección por VIH, y se asocia con la activación inmune 24, inflamación 10, y la infectividad de las células T CD4 + 35-37. Por lo tanto,este método será de interés para un público diverso incluidos los que tienen un interés en las enfermedades mediadas inflamatorias, cáncer, enfermedades infecciosas, inmunología y immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por el Centro Australiano para el VIH y la hepatitis Virología Investigación (ACH 2) y una subvención del desarrollo 2010 (CNIHR) de la Universidad de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programa financiado por el NIH con el número premio AI027757 que se apoya por el siguiente NIH Institutos y Centros (NIAID, NCI, NIMH, el NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP es un receptor de la subvención 2 CNIHR y ACH. SMC es un receptor de un Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación de Australia (NHMRC) Principal beca de investigación. Los autores agradecen la contribución a este trabajo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa Victorian recibida por el Instituto Burnet. Reconocemos la ayuda de Geza Paukovic y Eva Orlowski-Oliver de la Facilidad AMREP Citometría de Flujo Core para citometría de flujo capacitación y asesoría técnica. Agradecemos a Angus Morgan para el entrenamiento y la organización de la sesión de vídeo medios de comunicación. nuestro agradecimientoa Jesse Masson y Jehad Abdulaziz K. Alzahrani para la asistencia de laboratorio durante la filmación del video. Damos las gracias a los esfuerzos del Dr. David Simar de la Facultad de Ciencias Médicas, UNSW, Australia que ofrecieron asesoramiento metodológico crítico. CSP quisiera agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.

CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES:

CSP concibió el proyecto, diseñó y llevó a cabo experimentos, analizado e interpretado los datos, y escribió el manuscrito. JJA interpreta los datos y escribió el manuscrito. TRB escribió el manuscrito. JMM interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos, y revisó el manuscrito. SMC interpretado los datos, hizo sugerencias intelectuales críticos y revisó el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics