Hurtig og forenklet metode til High Through-sætte Isolering af miRNA fra Highly Renset High Density lipoprotein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MikroRNA'er spiller en vigtig regulerende rolle og dukker op som nye terapeutiske mål for forskellige humane sygdomme. Det har vist sig, at miRNA transporteres i højdensitetslipoproteiner. Vi har udviklet en forenklet metode til hurtigt at isolere oprensede HDL egnet til miRNA analyse fra humant plasma.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Indsamling af blodprøver

  1. Indsamle fastende perifere venøse blodprøver i 10 ml plastrør indeholdende antikoagulerende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (som har flere fordele i forhold til andre antikoagulanter) ved standard venepunktur af en fremtrædende vene i antecubital fossa.
  2. Centrifuger blodprøverne ved 1.600 xg i 20 minutter ved 4 ° C i en bordcentrifuge for at opnå plasma fri for røde blodlegemer og små mængder RNA.
  3. Sekventielt centrifugeres supernatanten ved 3000 g (4 ° C) i en svingende spand-rotor i 10 minutter til fjernelse af WBC & blodplader og derefter yderligere 15 minutter for at fjerne resterende celledebris hhv.
  4. Måle densiteten af ​​plasma under anvendelse af et densitometer ved stuetemperatur som pr fremstilling anvisninger.
    BEMÆRK: Justering af densiteten (d = 1.023 g / ml) med 0,9% saltvandsopløsning kan kræves efter fjernelse af exosomer men før densitetsgradientultracentrifugering.
  5. 2. exosome Fjernelse fra plasma

    1. Fjern de cirkulerende exosomer der har en tæthed svarende til HDL og repræsenterer et kvantitativt væsentlig kilde til miRNA 3.
      1. Gør dette ved at tilføje 252 pi exosome nedbør løsning til 1 ml plasma efterfulgt af inkubation i 30 minutter ved 4 ° C. At pelletere ud exosomerne centrifugeres blandingen i 30 minutter ved 1.500 g ved 4 ° C.
      2. For at isolere HDL, overførsel 1 ml af den resulterende supernatant til et polycarbonat tykvægget ultracentrifugerør for yderligere behandling med densitetsgradientultracentrifugering (se nedenfor).

    3. densitetsgradientultracentrifugering (figur 1).

    1. At adskille HDL bruge en 3-trins proces, der anvender et gulv ultracentrifuge med en fast vinkel rotor opererer ved 448.811 x g og 8 ° C.
    2. Forbered tre forskellige tæthed løsninger sekventielt og frisk for hver isolation.
      1. Forbered Opløsning A (isolering af VLDL, d = 1,006 g / ml) ved at opløse 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na og 1 ml 1 N NaOH i 1000 ml autoklaveret vand. Derpå tilsættes yderligere 3 ml autoklaveret vand.
      2. Forbered Opløsning B (isolering af LDL, d = 1,182 g / ml) ved tilsætning af 25,2 g NaBr til 100 ml opløsning A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
      3. Forbered Opløsning C (isolering af HDL, d = 1.470 g / ml) ved blanding af 78,8 g NaBr med 100 ml opløsning A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Bekræft passende tæthed ved stuetemperatur under anvendelse af et densitometer. Hold alle opløsninger ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.

    4. Isolering af VLDL

    1. Bland 1 ml plasma (gennemsnitlig densitet = 1,023 g / ml) og nucleasefrit 200 pi Fat Red 7B i et 6,5 ml polycarbonat tykvægget ultracentrifugerør.
    2. Derefter omhyggeligt Lag 5 ml opløsning A på toppen af ​​blandingen. Hvis det er nødvendigt, tilføje ekstra Fat Red 7B på toppen af ​​opløsning A to balancere vægten af ​​hvert rør. Centrifuger i 2 timer (acceleration - 5), (deceleration - 7).
      BEMÆRK: Under centrifugering, er lipoproteiner akkumuleres som et bånd ved deres regioner ligevægt densitet.
    3. Ved afslutningen af ​​kørslen observere 2 lag. Fjern 1,5 ml VLDL-fraktionen repræsenterer det øverste lag og opbevares ved 4 ° C.
    4. Endelig anvendelse af en pipette transfer 4 ml fra bunden af ​​røret med LDL, HDL, albumin og fedtsyre fraktion til en ny polycarbonat rør til LDL isolation.

    5. Isolering af LDL

    1. Bland 2 ml opløsning B og 100 pi nukleasefrit Fat Red 7B i røret, der indeholder LDL og HDL-fraktionen (afsnit 4), hhv.
    2. Derefter centrifugeres ud i 3 timer (acceleration 9, deceleration 7). Derefter fjernes 1,5 ml LDL-fraktionen, der repræsenterer det øverste lag og holde ved 4 ° C eller opbevares ved -80 ° C. Endelig overføres 4 ml fra bunden af ​​røret med HDLfraktion til en ny polycarbonat rør.

    6. Isolering af HDL

    1. Bland 2 ml opløsning C, 100 pi nukleasefrit Fat Red 7B og 15 pi 98% β-mercaptoethanol i røret indeholdende HDL-fraktionen, hhv.
    2. Centrifuger i 3 timer (acceleration 9, deceleration 7). Derefter fjerne 2 ml HDL-fraktionen, som repræsenterer det øverste lag og enten holde ved 4 ° C eller opbevares ved -80 ° C.

    7. Afsaltning og Koncentration af lipoproteinfraktioner

    1. At undgå interferens med efterfølgende agarosegelelektroforese og PCR, fjerne overskydende salt tilsættes under densitetsgradientultracentrifugering hjælp centrifugalfilter enheder med den passende molekylvægt cutoff (3K rør til VLDL og 10K rør til LDL / HDL) som beskrevet af producentens anvisninger.
      1. Kort fortalt, efter tilsætning 2,5 ml kold PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifuge hele VLDL fraktionen opsamlet-ved densitetsgradient ultracentrifugering ved 4 ° C i 60 minutter under anvendelse af en svingende spand-rotor.
      2. Afsalte LDL-fraktionen to gange med 10 ml iskold PBS i 30 minutter hver. Dernæst Brug 13 ml iskold PBS to gange for afsaltning HDL-fraktionen. Den højere PBS volumen er nødvendig for at forbedre mobiliteten med agarosegelelektroforese. Efter centrifugering fjernes lipoprotein indeholdende opløste stoffer og holde ved 4 ° C eller opbevares ved -80 ° C.

    8. Agarosegelelektroforese

    1. Perfrom lipoprotein agarosegelelektroforese ansætte sættet med mindre ændringer af producentens anvisninger som følger.
      BEMÆRK: Dette trin er bare at vurdere kvaliteten og renheden af ​​de koncentrerede lipoprotein prøver.
      1. Kort beskrevet opnå 6 pi af afsaltet lipoproteinfraktion med densitetsgradientultracentrifugering og indlæse på en præ-støbt lipoprotein gel. Brug menneskelige lipoprotein standarder for VLDL, LDL og HDL som størrelse reference. Udføre elektroforese ved stuetemperatur ved 100 V i 60 minutter under anvendelse Rep Prep puffer.
      2. Tør gel i 10 minutter og derefter farves i 10 minutter ved stuetemperatur med Fat Red 7B. Affarves gelen i en blanding af methanol-vand 75:25 (vol / vol) og tør igen i 5 min.

    9. RNA-ekstraktion og oprensning

    1. Perfrom isolering af miRNA ved oprenset humant HDL hjælp af serum / plasma miRNA isolering og oprensning kit.
      1. Kort beskrevet tilsættes 1 ml af RNA lysis reagens til 200 pi oprenset HDL, blandes med en vortexer og derefter inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur for at sikre fuldstændig dissociation af nukleoprotein komplekser og inaktivering af RNaser.
      2. Derefter spike 3,5 pi syntetisk Caenorhabditis elegans microRNA (cel-MIR-39; 1,6 x 10 8 kopier / pi) i blandingen. Derefter udfører RNA-ekstraktion ifølge producentens anvisninger.
    2. Udfør purificatipå af ekstraheret-miRNA med eluering spin-søjler i henhold til producentens anvisninger. Måle koncentrationen af ​​miRNA fra renset HDL med en spectrophorometer.
      BEMÆRK: Eluering af miRNA fra spin-søjler anvendes 16 pi RNase-frit vand.

    10. Reverse Transcription (RT-PCR)

    1. Isoler 100 ng af miRNA fra HDL tilsat syntetisk miRNA (cel-MIR-39) og revers-transcriberet i et 20 pi reaktionsvolumen under anvendelse af den reverse transkription kit og ifølge producentens anvisninger.
    2. Udfør passende kontroller uden skabelon miRNA (NTC), og uden revers transkriptase-enzymet mix (NRT).

    11. Real-time PCR (QRT-PCR)

    1. Perfrom Real-time PCR i et samlet volumen på 20 pi med 2 pi af en 1: 2 fortynding af cDNA, 10 pi PCR-blanding, 2 pi universel primer, 2 pi miRNA primere og 4 pi RNase-frit vand.
    2. Kør Reactiindenfor plader med 96 brønde ved 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 94 ° C i 15 sek og 55 ° C i 30 s og en udvidelse fase ved 70 ° C i 30 s.ec perfrom alle reaktioner i tre eksemplarer .
    3. Dernæst Calcuate relative mængder af miRNA ved at bruge 2 -ΔΔ Ct metode, efter normalisering til det syntetiske housekeeping-gen i henhold til producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering af High density lipoprotein efter fjernelse af Exosomer
Til opnåelse miRNA fra højt oprenset HDL er det nødvendigt at fjerne exosomer der udgør en kilde til miRNA forurening 7. Dette blev gjort før densitetsgradientultracentrifugering med et kommercielt tilgængeligt kit. Til praktiske formål en tre trins standard densitetsgradientultracentrifugering protokol udviklet af kommerciel virksomhed blev ændret (figur 1). Denne protokol kræver centrifugering med en fast vinkel rotor ved en hastighed på 140.000 rpm hvilket er væsentligt hurtigere end almindeligt anvendte protokoller med centrifugalkraft op til 54.000 rpm 3, 8, 9 og 10. Anvender en alment tilgængelig T-1270 rotor med en maksimale kraft af 70.000 rpm, blev centrifugering oprindeligt udført med polyallomer rør, som har undladt at modstå centrifugalkraft. At undgå kollaps af rør,polycarbonat rør blev med held anvendt. Centrifugering tid er afgørende for lipoprotein oxidation og potentielt miRNA nedbrydning 11. Derfor flere forskellige centrifugeringstider, lige fra en total på 8 til 96 timer, blev testet. Endvidere temperatur, ved hvilken centrifugering blev udført blev indstillet baseret på centrifugeringstid og kraft hhv.

Renhed af High Density lipoprotein fraktioner
Renhed af isolerede high density lipoprotein fraktioner blev kontrolleret med agarosegelelektroforese. Figur 2. viser en typisk elektroforese resultat for HDL subtraktion isoleret ved ultracentrifugering. Det viste klart, at HDL var blottet for enhver forurening af VLDL og udviser typisk α-mobilitet. Fraværet af eventuelle a-migrerende lipoproteiner i VLDL og LDL-fraktionerne viser fuldstændig helbredelse fra HDL under ultracentrifugation trin. HDL-fraktionen viste dog også nogle spor af β-mobilitet, en kendt elektroforetisk båndmønster på grund af forurening med lipoproteiner (Lp (a)) 12.

Eliminering af Lp (a) fra isolerede HDL
At studere miRNA transporteres i HDL kræver isolering af HDL af højeste renhed. Interferens af Lp (a) med HDL potentielt bidrager til krydskontaminering af HDL med miRNA transporteres i LDL. For at minimere denne forurening af HDL, blev 15 pi β-mercaptoethanol 10 tilsat til opløsning C under den sidste centrifugeringstrin (figur 1). Tilsætning af β-mercaptoethanol har vist sig ikke at ændre HDL tæthed egenskaber 10. Som vist i figur 3. tilsætning af β-mercaptoethanol resulterede i fravær af enhver B-migrerende lipoproteiner konsistente med meget effektiv fjernelse af Lp (a).

Rensning af miRNA fra HDL
Isolering af miRNA blev oprindeligt forsøgte anvendelse af lysis reagens, som er almindeligt anvendt til RNA-ekstraktion fra blod. Selv om denne metode resulterede i en meget god RNA udbytte (91,45 ng / pl), men efter spektrofotometrisk analyse viste utilfredsstillende RNA renhed. Yderligere oprensning af det isolerede RNA ved at fjerne phenol forbedret renhed, men RNA udbyttet var nu et særlig lavt. Dernæst blev en anden kit testet som viste acceptabel RNA renhed (260/280 nm forhold på 1,7), men RNA udbytte var 26 gange lavere sammenlignet med lysis reagens (3,45 vs. 91,45 ng / pl). De bedste resultater for acceptabel RNA renhed med et godt udbytte blev opnået med miRNeasy serum / plasma-kit (48,2 ng / pl; 260/280 nm på 1,6), og derfor denne udvinding procedure blev efterfølgende anvendt til påvisning af miRNA fra den isolerede HDL lipoprotein fraktionen.

3 og blev vist at undertrykke HDL-kolesterol optagelse 5. Den figur 4A. viser en typisk log plot af amplifikationsprodukter kurver sammenligner baseline tærskel- og tærskelcyklus værdier efter optimering af PCR-reaktionen for MIR-223 og den spidse-i Cel-mir-39. Denne syntetiske gen blev anvendt som intern kontrol, som der er ingen rapporter om kendte normalisering kontrol for miRNA i plasma. Desuden flere potentielle etablerede endogene husholdning gener som RNU6-2, RNU-48, HY3 kunne ikke blive opdaget og kunne påvises SNORD95 i renset HDL, men forskellen i Ct-værdier for miR-223 og SNORD95 er mindre end fem ( data ikke vist). Smeltekurveanalyse illustreret i figur 5. viser klart en tydelig enkeltpeak overensstemmelse med amplifikation af en selektiv miRNA i foregående PCR. Som vist i figur 4B., Kunne konsekvent detekteres både MIR-223 og referencen Cel-mir-39 i alle seks pro bands. Relativt små variationer blandt alle personer blev observeret for Cel-mir-39 sammenlignet med miR-223. Disse fund understøtter isolering af HDL ved høj renhed til at muliggøre detektion af dens miRNA last.

Påvisning af miR-223 i renset HDL
Real time kvantitativ PCR-fremgangsmåde blev anvendt til at kvantificere dobbelt hårnål-struktur miRNA forstadier til enkeltstrenget miRNA. Denne metode kræver en frem / tilbage genspecifikke primere og en termostabil revers transkriptase til at konvertere hårnålestrukturen af ​​miRNA til cDNA. CDNA blev efterfølgende forstærket og kvantificeres ved hjælp af real-time qPCR med hjælp fra SYBR grøn detektion. MicroRNA fra serum, plasma og renset HDL plasma kan være nøjagtigt profiled hjælp af miRNA RT PCR-system.

Vores eksperimentelle produkt af gennemsnitlig miR-223 genekspression viste en Ct-værdi på 30,9 i renset HDL og dets tilsvarende negative kontroller var over cut-off 35 (NTC = 38.1 Ct-værdi, NRT og NAC blev ikke forstærket). I dette eksperiment så vi i de oprensede HDL prøver dannelsen af primer-dimer med lav smeltetemperatur (73 ° C i MIR-223 og 75,5 ° C i Cel-MIR-39) og højere C t-værdi end de specifikke miRNA assays (tabel 1). Primeren-dimerer i tabel 1. opstår sandsynligvis på grund af høj koncentration af primere i opløsningen. Dette sker oftest, når primer molekyler tillægger hinanden efter 30 PCR-cyklusser 13. Det giver dem mulighed for at anneale til andre primer molekyler og i kraft, bliver lineære mini-skabeloner, og det vil medføre højere baggrund og kan føre til en generation af C t-værdien <40 for NTC (Ingen template kontrol) prøver.

figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af HDL isoleringsprocedure. HDL blev fremstillet ved densitetsgradientultracentrifugering i en serie af tre centrifugeringstrin. Fordeling af lipoprotein bands og mellemliggende fraktioner i tætheden gradient er illustreret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Agarosegelelektroforese af lipoproteiner isoleret Uden β-mercaptoethanol. VLDL, LDL og HDL fraktioner isoleret ved densitetsgradientultracentrifugering uden at tilføje β-mercaptoethanol til opløsning C demonstbedømme tilstedeværelsen af ​​Lp (a) i HDL-fraktionen. Bane 1, 2, 9 og 10 repræsenterer hver størrelse markør; Lanes 3/4, 5/6 og 7/8 repræsenterer VLDL, LDL og HDL henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Agarosegelelektroforese af HDL isoleret med β-mercaptoethanol. Tilføjelse β-mercaptoethanol til opløsning C, før det sidste centrifugeringstrin resulterede i fjernelse af Lp (a) fra HDL-fraktionen. Bane 1, 2, 9 og 10 hver repræsenterer størrelsen markør; Lanes 3-8 repræsenterer HDL. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 4. Amplification Plot af to forskellige miRNA og ekspression af Cel-miR-39 og miR-223. (A) Real-time kvantitativ PCR under anvendelse af isolerede HDL blev udført som beskrevet. PCR blev kørt i 45 cykler og det punkt, hvor kurven skærer tærskelværdien er C T-værdien. Dataene viser ekspressionen af ​​Cel-MIR-39 (venstre felt) og MIR-223 (højre panel), hhv. Den vandrette linje repræsenterer detektionsgrænsen. En cyklus på 35 blev fastsat som cutoff for positiv forstærkning. (B) repræsentant realtids-PCR-data fra isolerede HDL opnået fra 6 prøver er vist. Raw betyder Ct-værdier er vist for Cel-MIR-39 og MIR-223, hvis ekspression varierer mindre end 2 Ct-værdi i oprenset HDL plasmafraktionen mellem 6 prøver, hver fra en anden donor. Expression profilering blev udført ved hjælp af PCR System og Human Serum & plasma miRNEn QRT-PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. smeltekurver for Cel-MIR-39 og MIR-223. Som vist tilstedeværelse af en enkelt top indikerer specifik amplifikation af Cel-MIR-39 (højre panel) og MIR-223 (venstre panel), henholdsvis. Zoom klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1. Række C t-værdi af negativ og positiv kontrol af syntetisk Cel-MIR-39 og MIR-223 kendetegnet ved serum, plasma, cDNA og oprensede HDL-fraktionen. NTC (nr template kontrol), NRT (nr revers transkription-enzymet), NAC (nr amplifikation kontrol, kun vand og reagenser af QRT-PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifikation af hidtil ukendte biomarkører fra blod vil støtte i den kliniske diagnose og prognose af forskellige sygdomme. MikroRNA'er har kendt for at besidde alle de kvaliteter af biomarkører og er blevet vist i forskellige undersøgelser 14-17. I denne undersøgelse har vi vist hurtig og enkel nem metode til at isolere miRNA fra plasma HDL. Konventionel densitetsgradientcentrifugering ultracentrifugering fremgangsmåde til isolering af VLDL, LDL og HDL afhænger nøjagtig prøveudtagning af plasma, præcis fremstilling af pufferopløsningen, måling af densitet og kvantitativ overførsel af bottom lipoproteinfraktioner 8. Der er mange metoder, der er beskrevet til isolering af HDL 8 -11. Disse fremgangsmåder er ofte enten meget omstændelig eller kræver store mængder plasma og omfattende dialyse til afsaltning isoleret lipoproteiner og ikke helt fjerne exosomer og lipoproteiner som en kilde til miRNA 3. For at afhjælpe disse mangler, vi har etableret denne simple og hurtig metode til isolering af miRNA fra plasma HDL.

Nøglen mål og primære formål med denne undersøgelse var at adskille og isolere HDL-miRNA komplekset ved ultracentrifugering uden RBC, buffy coat, exosomer, sekretoriske vesikler, VLDL, LDL og lipoprotein (a) interferens, derefter isolere miRNA fra oprenset HDL. Forurening og indblanding af nogen af ​​disse komponenter med HDL vil ændre de forventede eksperimentelle resultater og miRNA profilering af data. Isolering af DNA, RNA og miRNA fra blod er en meget vanskelig opgave på grund af sin komplekse karakter. Det har altid været stillet med masse tekniske udfordringer for nukleinsyrer (herunder miRNA) ekstraktion og oprensning i forhold til celler, væv og organprøver 18. Også der er relativt færre miRNA gener til stede i cirkulerende blodceller. Blod er en kendt bærer for exosomer, sekretoriske vesikler og HDLs samt gratis cirkulerende miRNA, som er relativt mindre 18. Derfor større enmount af blodplasma prøvevolumen er nødvendig for behandling og isolation af HDL-miRNA-komplekset. Hertil kommer, at korte karakter af miRNA og deres målsekvenser, gør det endnu vanskeligere at opnå tilstrækkelig specificitet med standard-PCR oligonucleotid teknologier. De cellulære komponenter i blod altid ved at udskille miRNA og mRNA i respons til at ændre i eksternt miljø, herunder temperatur, mikroorganismer og toksiner eller stress. Også tilstedeværelsen af ​​nukleaser, RNaser, cirkulerende proteiner og andre enzymer i blodet vil påvirke disse miRNA isolation.

Den cirkulerende miRNA forstærkning mangler også et veletableret kendte husholdning gener som β-actin eller GAPDH for data normalisering, mens du bruger ΔΔCt metode QRT-PCR. Dette igen udgør en af de største hurdle for miRNA profilering af cirkulerende blod serum eller plasma 19. Almindeligt anvendte korte ikke kodning snoRNAs og snRNAs sjældent udtrykkes i blod og denne mform ål det yderligere vanskeligt i at udnytte dem som interne kontrolsystemer gener. For at løse disse ulemper ved snoRNAs og snRNAs og for at undgå eventuelle tekniske vanskeligheder, vi brugte Serum / plasma syntetisk Spike-In kontrol i analyserne som intern kontrol gen som fulgte ifølge producenten protokol. Det hjælper i normalisering for enhver ikke-specifik forstærkning og ændringer skete i løbet af miRNA rensning og PCR-reaktion 18. Selv i tilfælde af nedbrydning af miRNA eller fravær af specifikke miRNA forstærkning signaler, spike-in kontrol bør forstærke i QRT-PCR-reaktioner og give en forventet signal med en rimelig konstant og ensartet Ct-værdi. Baseret på spyd i kontrol forstærkning sammen med tre negative kontroller og positive kontroller fik vi god optimale datavalidering for miR-223-genet. Dette bekræftede, at vi har fået godt udbytte af MIR-223 fra cirkulerende plasma HDL fra denne simple metode.

Afslutningsvis har vi etableret en metode of densitetsgradientultracentrifugering (DGUC) med tilsætning af β-mercaptoethanol til oprensning af miRNA fra plasma HDL. Fremgangsmåden har adskillige fordele: (a) VLDL, LDL og HDL er adskilt inden for et kort tidsrum ved gulv ultracentrifuge sammenlignet med andre metoder, der har brug 24 - 96 timer 8-11; (b) LDL og HDL dialyse, afsaltning / koncentrering finde sted inden for 1 time sammenligne med andre metoder, der fandt 24 eller flere timer 8,9; (C) Forurening af lipoproteiner fjernes ved β-mercaptoethanol i HDL-fraktionen, men er ikke beregnet til at blive brugt i LDL-fraktionen; (D) Prøven volumen kræves, er kun 1 ml for alle trinvis VLDL, LDL og HDL isoleringer sammenligne med de andre metoder, der har brug for mere eksemplar volumen; (e) Det minimeret oxidative skader på HDL under isolering 11; (F) Højst 12 prøver kan analyseres i et enkelt lipoprotein adskillelse analytisk kørsel; (G) Den 250 pi prøvevolumen af ​​ekstraheret HDL er nok til at analysere mIRNA koncentration / renhed, agarosegelelektroforese, proteinkoncentration, microarray og RT-qPCR procedurer. Begrænsningerne i vores metode er, at lille procentdel af HDL-miRNA kan miste under exosomet udfældningstrin og det krævede plasmaprøve volumen bør være mere end 200 pi at isolere HDL-miRNA.

Endelig er plasma microRNA ikke kun stammer fra beskadigede eller frafaldne blodlegemer i omløb, men også fra sunde normale blodlegemer og celler fra andre dele af kroppen, som omfatter forskellige raske og syge væv og organer, der berøres af løbende sundhedstilstand af kroppen 20. nærværende undersøgelse har systematisk renset modent miR-223 fra isolerede HDL af humant plasma. Denne undersøgelse viser klart, at niveauerne af modent MIR-223 i den stærkt oprensede HDL plasma kan påvises, stabil, reproducerbar og konsistent blandt individer prøve, hvilket i høj grad letter kliniske anvendelse af Futurity tests for lipoproteiner, liver, kardiovaskulære og andre metabolisk syndrom. Overraskende, modne miRNA, især MIR-223 fra HDL plasma er sandsynligvis resistente over for nucleasefordøjelse og andre barske betingelser, som potentielt forklare stabiliteten af ​​MIR-223 i renset HDL. Mekanismen af ​​resistens af miR-223 til RNaser kræver yderligere undersøgelse. Det er klart, at studere miRNA udtryk profiler i disse renset HDL plasma ville kaste lys over de kommende miRNA-markører i at studere forskellige sygdomme. Disse HDL associerede microRNAer i plasmaet kan anvendes som et potentielt kliniske diagnostiske biomarkører og personaliseret medicin i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33, (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114, (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16, (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717, (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2, (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics