Ein hoher Gehalt

Medicine

GE Global Research must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Diabetes umfasst eine Sammlung von Störungen des gemeinsamen Endpunktes gestörter Glukose-Homöostase zu teilen. Obwohl die pathogenen Mechanismen von Diabetes - Subtypen unterschieden sind, sie die Folge einer verminderten β-Zellmasse teilen, dh Verlust von Insulin Produktionskapazität 1,2. Derzeit verlassen Diabetes Behandlungsstrategien auf die chronische Verabreichung von exogenen Insulin, pharmakologische Stimulation der Insulinproduktion oder Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und in seltenen Fällen die Transplantation von Pankreas - Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse 3,4. Leider ist der Erfolg dieser Strategien ist von kurzer Dauer und / oder nicht in ausreichendem Maße die Funktion der endogenen Insulinproduktion rekapitulieren. Trotz der Nützlichkeit, ein Verfahren zur Entwicklung von β-Zell-Regeneration zu stimulieren, kein solcher Ansatz vorhanden ist. Folglich ist ein wichtiges Ziel der Diabetesforschung , Methoden zu entwickeln neue β-Zellen zu erzeugen , oder endogene β-Zellmasse 5 zu erweitern 6,7. Wichtig ist , ist die vorherrschende Quelle von neuen β-Zellen in vivo vorbestehenden β-Zellen und nicht spezialisierte Vorläuferzellen 8,9. Obwohl β-Zellen begrenzte Replikationskapazität, eine geringe Zunahme der β-Zellmasse zu haben scheinen (~ 30%) ausreichend sein Glucosehomöostase in viele Diabetiker wiederherzustellen. Darüber hinaus ist in situ pharmakologische Stimulation der β-Zellmasse eine potentiell kostengünstige und skalierbare Behandlungsstrategie. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Molekülen, die β-Zellwachstum stimulieren dargestellt.

Eine Vielzahl von in vitro experimentellen Methoden verwendet werden können Genprodukte und / oder Moleküle zu identifizieren , That fördern primäre β-Zell-Replikation. Frühe Bemühungen für β-Zell - Replikation Induktionsmessung verwendet fötalen Nagetier Bauchspeicheldrüsen Kultur oder intakte isolierte Inselkulturen zu messen [3 H] Thymidin - Einbau, BrdU - Einbau oder mitotischen Körper innerhalb der Aldehyd-Thionin oder Insulin gefärbten Population als Reaktion auf bestimmte Behandlungsbedingungen 10, 11. Diese in - vitro - Ansätze und nahe Varianten davon haben einige Einschränkungen. Prominent Mängel umfassen (1) die Verwendung von fetalen Zellen , die, im Gegensatz zu reifen β-Zellen, eine hohe basale 12 in einer bestimmten Weise reguliert β-Zellreplikationsrate und das Wachstum anzuzeigen; (2) die subjektive Natur der Experimentator abhängigen Jurierung von β-Zellen-Replikationsereignisse; (3) die arbeits- und zeitintensiv Natur der Experimentator abhängige Zählung von β-Zellen-Replikationsereignisse verzögert experimentellen Durchsatz; (4) die Nutzung der Kern Einbau / Fleck / Aussehen Replikation zu identifizieren, selbstts und eine nicht-überlappenden zytoplasmatischen stain β-Zellen zu identifizieren, führt zu Fehlattribution von proximalen nicht-β-Zell-Replikationsereignisse-Zellen ß.

In jüngerer Zeit reifen haben primäre β-Zellen , die die Auswirkungen von Transgen Überexpression sowie Genprodukts oder Verbindung Behandlung auf β-Zell - Replikation 13-16 zu bewerten verwendet worden. Allerdings haben diese Studien auch auf subjektive Zählen von Replikationsereignisse verlassen, zytoplasmatische staining- oder nicht-spezifischen Methoden für die β-Zellen - Identifikation und / oder arbeitsintensive Schritte , die den Durchsatz begrenzen, beispielsweise einzelne Einschub gut Plattieren von Zellen oder intakten islet Paraffineinbettung und Verarbeitung 17. Bemerkenswert ist , ein bildbasiertes menschliche β-Zellreplikation Screening Methode, ähnlich der hier vorgestellten, wurde 18 veröffentlicht wurde ; jedoch hat erfolgreiche Verwendung dieses Assays nicht nachgewiesen werden, und die Verwendung von menschlichen Inseln zur Vorabsiebung nicht breit sein FEAwortlich.

Eine alternative Strategie zur Identifizierung von Replikationsfördernde Substanzen das Wachstum Induktion von β-Zelllinien zu bewerten. Erste Versuche umgewandelt β-Zell-Linien verwendet wie MIN6 Zellen oder INS 832/13-Zellen 14,19-21. Allerdings zeigen diese Zelllinien ungebremst Wachstum und wenig Ähnlichkeit mit gut differenzierten β-Zellen 22. Folglich wachstumsInduktionsLeistung ist minimal, unklarer Relevanz und manchmal schwer zu rekapitulieren. Eine verbesserte Strategie für die zellbasierte Screening - Linie nutzt Zellen "reversibel umgewandelt" , das Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin (Doxycyclin) -abhängigen SV40 T - Antigen - Expression 23,24 verhaftet sind. Es ist jedoch unklar, ob diese Zellen zu einer "normalen" β-Zell-ähnlichen Zustand auf Doxycyclin Entfernung zurück. Leider hat die Verwendung dieser Zellen verallgemeinert wachstumsfördernden Verbindungen ergab, dass offenbar nicht unmittelbaren Nutzen haben24. Insgesamt ist die Verwendung von Zell-Linien Wachstumsregulation eines Zelltyp - Anzeige von minimal spontane Replikationsaktivität zu studieren , können begrenzte Anwendbarkeit aufweisen.

Die β-Zellreplikation präsentiert Screening - Plattform hierin verwendet reifen primären Ratten - β-Zellen in vivo Wachstumsregulierung in dem Maße möglich, Inselzellkulturen von gemischten Zelltyp - Zusammensetzung zu erhalten Identifizierung von Lineage-restricted wachstumsfördernden Aktivitäten zu ermöglichen, multi -well Formatierung Durchsatz und automatisierte Analyse zu maximieren Bias zu beseitigen und den Durchsatz zu erleichtern. Der erfolgreiche Einsatz dieser Plattform hat Identifizierung mehrerer Verbindungen aktiviert , die β-Zell - Replikation 25,26 fördern. Zusätzlich wurde der Test für die Struktur-Wirkungs-Beziehung Studien und chemischen epistasis Experimenten verwendet worden mechanistische Einblicke in die molekulare Regulation von β-Zell-Replikation zu ermöglichen. Die vorgestellte Plattform wurde erfolgreich angepasst for lentiviralen RNAi-basierte Untersuchung von β-Zell - Replikation Pfade 25. Einschränkungen des Tests umfassen Skalierbarkeit (Verwendung von Primärzellen) beschränkt, die Verwendung von Nagetier anstatt menschlichen Inselzellen (obwohl der Test auf menschlichen Insel Studien angepasst werden kann), Aufwendungen im Zusammenhang mit Antikörper-basierte Bildgebung und primäre Insel Nutzung, die Nutzung von dispergierten Inseln (gestört islet Architektur) automatisierten Bildaufnahme und die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit eines automatisierten Mikroskop mit Bildaufnahme und Analysefähigkeit zu erleichtern. Obwohl eine leichte In - vivo - Screening - Methodik Genprodukte oder zur Identifizierung von Verbindungen , die β-Zell - Regeneration in situ stimulieren ideal wäre, eine solche Plattform ist noch nicht 27 zur Verfügung. Folglich ist die beschriebene Plattform geeignet für Forscher interessiert sich für die meisten Aspekte der β-Zell-Replikation zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Stanford University School of Medicine durchgeführt. 300 g - Das beschriebene Protokoll wird von sechs 250 für Inselisolierung skaliert (8 - 9 Wochen alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 228 Wells einer 384-Well-Platte für die Inselzellen-Replikationsabschätzung zu erzeugen ausreichend ist.

1. Material Vorbereitung

  1. Bereiten Beschichtungsmedien vor Beginn der Inselisolierung durch den konditionierten Medien von 804G Rattenblasenkarzinom - Zellen bei Konfluenz für 3 Tage (20 ml RPMI1640) gehalten Sammeln in einer 15 cm - Gewebekulturschale 28. Sterilfilter und zu speichern (-20 ° C) das konditionierte Medium für die spätere Verwendung.
  2. Sterilisieren chirurgische Instrumente (eine 12 cm Zahngewebe Zange, ein 11,5 cm feinen Schere, ein 14,5 cm chirurgische Scheren, zwei 16 cm gebogenen Pinzette, ein 12 cm gebogen hemostat, ein 12 cm Skalpell Griff) und ein 30 mesh Gewebe Sieb vor initiating Inselisolierung.
  3. Vorbereitung pankreatischen Verdauungslösung durch eine 60% ​​zum Auflösen: 40% Mischung von gereinigtem Klasse I: Klasse II Kollagenasen (total Kollagenase - Aktivität von 300.000 - 400.000 Einheiten) in 60 ml 1x Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) , supplementiert mit Calcium und Magnesium. Last 10 ml Pankreasverdauungspuffer in 10 ml Spritzen (sechs) mit einem 1 "22 G Nadel und auf Eis.
    Anmerkung: 10 ml Aufschlußlösung pro Ratte injiziert. Skalieren entsprechend.
  4. Bereiten 4,5 ml des Anästhetikums Cocktail in einer belüfteten Haube von 1,3 ml Ketamin Mischen (100 mg / ml), 0,2 ml Xylazin (100 mg / ml) und 3 ml PBS. Bereiten Sie das Anästhetikum Cocktail innerhalb 1 Stunde von Inselisolierung zu initiieren.
  5. Bereiten Waschpuffer durch Zugabe von 25 ml Serum von neugeborenen Kälbern auf 500 ml HBSS. Legen Waschpuffer auf Eis für die spätere Verwendung.
  6. Bereiten Sie 1 Flasche Insel Medium , das 500 ml niedriger Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) ist, 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin.
  7. Bereiten Inselfunktion Medium von Funktionalität / Lebensfähigkeit Lösung (500 ml) mit 2% FBS, 2 mM Glutamin, 5 mM Glucose, 5,000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin. Speichern Sie die Inselfunktion Medien (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
  8. Vorbereitung 40 ml Puffer durch Zugabe von 2,5 ml Esel Blockierungsserum und 0,12 ml Triton X-100 bis 37,38 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Store Blockierungspuffer (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
  9. Besorgen Sie sich die benötigten Antikörper vor, das Protokoll zu initiieren.
    Hinweis: PDX-1 (TRITC) und Ki-67 (FITC) Co-Färbung ist für die primäre β-Zell-Replikation-Screening verwendet. zusammen mit Kern (DAPI), PDX (Cy5) und Ki-67 (FITC) Färbung; Für linienspezifische Replikationsanalyse, Immunfluoreszenzanfärbung für zusätzliche Zellidentität Marker (TRITC Insulin, Glukagon, Vimentin oder Somatostatin) durchführen. Alternative replication Marker, beispielsweise PCNA, können ebenfalls verwendet werden.
  10. Bereiten Sie eine 228-Well-Behandlungsplan mit jedem in vierfacher Ausfertigung durchgeführt Behandlungszustand. Positiv- Fügen (5-Iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 & mgr; M]) und Fahrzeugkontrolle (DMSO 1: 666 Verdünnung) Brunnen.

2. Perfusion des Pancreas

  1. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von verdünntem Anästhetikum Cocktail-Lösung (0,30 ml / 100 g Körpergewicht). Sobald die Ratte vollständig betäubten und reagiert nicht mehr auf schädliche Reize, führen Zervikaldislokation.
  2. Legen Sie die eingeschläfert Ratte in Rückenlage (kranial-kaudal-Orientierung) auf einem Stapel von Papiertuch und sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem U-Schnitt (Basis am Schambereich) und einfahren Haut in der rostralen Richtung über der Brust in die Bauchhöhle zu belichten.
  4. packen Sie vorsichtig das Duodenum mit zwei Paaren von gebogenen Pinzette, suchen Sie den duodenalen Eintrag der gemeinsamen bile Kanal (Sphinkter Oddi) und der Zwölffingerdarm-Öffnung an der Papille mit einer gekrümmten hemostat festzuklemmen.
  5. Heben Sie den gekrümmten hemostat verwendet, um den gemeinsamen Gallengang Papille zu klemmen und den Gallengang nahe an Leber schnappen Sie sich einen gebogenen Pinzette verwenden. Verwenden Sie stumpfe Präparation mit den gebogenen Pinzette zu isolieren und den Gallengang aus.
  6. Positionieren Sie die Ratte mit dem Kopf proximal und distal die Füße.
  7. Kanülieren den gemeinsamen Gallengang (CBD) an oder gerade distal zu der Verbindung der zystischen und gemeinsame -beladene Lebergänge mit einer pankreatischen Verdauungslösung 10 ml Spritze und 10 langsam ml der pankreatischen Verdauungslösung injizieren. Während die Injektion, die CBD mit einem Skalpell Griff unterstützen. Positionieren Sie die Nadel, wenn der Kanal und der Bauchspeicheldrüse aufzublasen scheitern.
  8. Entfernen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse die gebogenen Pinzette und einer feinen Schere mit ihm zu trennen von dem absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz. Legen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse auf Eis in einem 50-ml-Röhrchen mit 5 ml Hinweis: Für eine maximale Inselausbeute, sammeln Sie alle Bauchspeicheldrüsen innerhalb von 30 min und Ort nur 1 oder 2 Bauchspeicheldrüsen in je 50 ml Aufschlußrohr.

3. Die Dissoziation des Pancreas

  1. Sobald alle Bauchspeicheldrüsen gesammelt, legen Sie die Verdauung Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig schwenken alle 3 Minuten die Röhrchen.
  2. Nach 15 min kräftig schütteln (vertikal) die Rohre 10 - mal und 10 ml kaltem Waschpuffer hinzufügen. Kräftig schütteln die Rohre zusätzlich 5 mal auf Eis stellen.
  3. Füllen Sie die Verdauung Rohre bis 50 ml mit kaltem Waschpuffer und Mischung von Röhren 5 - mal umgekehrt wird .
  4. Zentrifugiere die Röhrchen bei 97 × g bei 4 ° C für 1 min und giesst den Überstand. Achten Sie darauf, nicht die pelle Gewebe zu entfernen.
  5. 25 ml Waschpuffer und erneut zu suspendieren , das Gewebe durch sanftes Vortexen. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 noch zweimal.
  6. Legen Sie ein 30 mesh Gewebe Sieb über eine sterile 250-ml-Becher und gießen Sie die Gewebesuspension auf das Sieb. Spülen Sie das Aufschlußrohr mit zusätzlichen 20 ml Waschpuffer und gieße auf das Netz. Die unverdaute Pankreas und Fettgewebe sind bei diesem Schritt entfernt.
  7. Gießen Sie das gefilterte Material in zwei frische 50-ml-Röhrchen und das Gewebepellet durch bei 4 ° C bei 97 × g für 1 min drehen. Decant Überstand und Invert-Röhren überschüssige Puffer zu entleeren.

4. Reinigung von Inselchen

  1. 20 ml kaltem Polysaccharose / Natriumdiatrizoat-Lösung (1,119 g / ml Dichte) an die pelletierten Pankreasgewebe. Homogen erneut zu suspendieren, den Inhalt jedes Röhrchen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren fünfmal.
  2. Overlay vorsichtig die Polysucrose / Natriumdiatrizoat Lösung mit 10 ml HBSS. Pflegen Sie eine scharfe Flüssigkeit-Grenzfläche durch langsam die HBSS entlang der Rohrwand hinzufügen.
  3. Zentrifugieren der verdauten Bauchspeicheldrüsen bei 560 × g für 15 min (4 ° C) mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse.
  4. Collect die Inselschicht von der Oberfläche einer 10 ml Pipette und Platz Inselchen in frischen 50-ml-Röhrchen mit. Pool nicht Inselchen in diesem Stadium.
  5. Werden 40 ml Waschpuffer in jede 50 - ml - Röhrchen und Schleuder für 1 min bei 140 × g bei 4 ° C.
  6. Gießen Sie den Überstand ab und erneut zu suspendieren gepoolt Inseln in 50 ml Waschpuffer durch die Rohre mehrmals umgekehrt wird . Zentrifugiere die Röhrchen für 1 min bei 97 × g bei 4 ° C Inselchen in einem Pellet zu sammeln.
  7. Gießen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche ab. Bringen Inseln in die Gewebekultur Haube und den Überstand aspirieren.
  8. Re-suspend jedes Rohr von Inseln in 6 ml Insel Medium.
  9. Übertragen Sie die Inseln von je 50 ml Tube in eine Vertiefung Sechs-Well-Gewebekulturschale. Schwenken Sie die 6-well Schale Inseln in der Mitte des Brunnens zu sammeln und Inselchen Qualität und Reinheit unter dem Mikroskop beobachten.
  10. Manuell sammeln Inselchen einer 1 ml Pipette und übertragen die aufgenommenen Inseln in die benachbarte Verwendungenthält, gut 6 ml Insel Medien. Wiederholen Sie Inselchen Verwirbelung und Kommissionierung bis> 90% Reinheit erreicht.
  11. Übertragen Sie die gereinigten Inseln zu einer 10 cm Gewebekulturschale mit 20 ml Insel Medium.
  12. Ort Inselchen in einem Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) über Nacht (1A).
  13. In Vorbereitung der Inselzellen Plattieren, Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen mit 40 ul 804G konditionierten Medium pro Well. über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.

5. Dispersion und Beschichtung von Inselzellen

  1. Am folgenden Tag, nehmen Sie sanft kleine Inseln aus dem 10-cm-Schale mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Inseln in einen 50-ml-Tube.
  2. Pellet die Inseln durch Zentrifugation für 1 min bei 22 · g bei Raumtemperatur. Den Überstand aspirieren.
  3. Waschen Sie die Inselchen mit 20 ml warmem PBS und wie oben dekantiert.
  4. Re-suspend Inseln in 0,25% Trypsin (150 & mgr; l pro Ratte Bauchspeicheldrüse) Und für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Pipette Inselchen nach oben und unten 10-mal mit 1 ml Pipette nach 5 und 10 Minuten Inkubation.
  5. Nach 10 min wurde eine 20 ul Probe der trypsiniert Inseln unter dem Mikroskop ausgewertet vollständige Verdauung zu gewährleisten und die Inselzellen mit einem Hämocytometer gezählt. Wenn unverdaute Inseln bleiben, weiterhin Inkubation für eine weitere 3-5 min und Pipette auf und ab 10 weitere Male. Bei Bedarf wiederholen.
    Hinweis: Die typische Ausbeute von ~ 125.000 - 150.000 Insel-Zellen pro Ratte.
  6. Entfernen 804G konditionierten Medien beschichteten 384-Well-Platte aus dem Inkubator und entfernen Medien eine 12-Well-Verteiler Absauger verwenden.
  7. Suspend - Inselzellen in einer Dichte von 45.000 Zellen pro ml in Islet Funktionsmedium und der Platte 70 & mgr; l (3.150 Zellen) pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette (1B).
    Hinweis: Da in den äußeren Wells β-Zellen sind in der Regel 4 in Richtung des Umfangs der Platte Verwendung Reihen C bis N und Spalten zu migrierenbis 21 228 Vertiefungen mit den Inselzellen von 6 Ratten isoliert auf den Teller.
  8. Die Platte wird in der Gewebekultur-Inkubator für 48 Stunden Zelladhäsion zu ermöglichen.

6. Islet-Zellkultur-Behandlung, Fixierung und Färbung

  1. Bereiten 200 ul Vehikel und Verbindungen (Behandlungsbedingungen werden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt) bei einer 2x - Konzentration in Islet Funktionsmedium. Anordnen Verbindungen in einer sterilen 96-Well-Platte mit mehreren Vertiefungen Pipettieren zu erleichtern.
  2. Sorgfältig Inselchen Medium mit einer 12-Well-Verteiler Absauger entfernen und mit Inselfunktion Medium (35 & mgr; l / Well) unter Verwendung eines 12-Well-Pipette ersetzen. Entfernen und Ersetzen Medien von einer Zeile zu einer Zeit , Risiko zu begrenzen , Trocknen (1C).
  3. Initiieren Behandlung von 35 ul / Vertiefung der 2x Verbindungslösungen zu übertragen. Rückplatte in den Inkubator für die 48 Stunden Behandlungsdauer.
  4. Nach 48 Stunden der Behandlung, dekantiert die Behandlungsmedien durch Umdrehen der Platte. </ Li>
  5. Waschen Sie sich leicht die Inselzellen mit 50 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS (1 min). Fügen Sie den PBS einen Mehrkanal-Pipette.
  6. Dekantiert die PBS und die Zellen beheben, indem 50 ul Zugabe pro Vertiefung von kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS. Inkubiere Zellen für 15 min bei 4 ° C.
  7. Waschen Sie die Zellen dreimal (jeweils 5 min) durch die Platte Invertieren des PFA zu entfernen, und die Zugabe vorsichtig 60 ul PBS pro Vertiefung wie oben.
  8. Vorbereitung 15 ml Antigen-Retrieval-Lösung durch Mischen von 14,25 ml Formamid und 0,75 ml 0,15 M Natriumcitrat (pH 6). Sprechen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
  9. Entfernen PBS aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte und fügen Sie zu jeder Vertiefung 60 ul Antigen-Retrieval-Lösung. Anschließend wird die Platte in 70 ° C warmen Wasserbad für 45 min. Platzieren einem Heizblock auf der Oberseite der Platte während dieser Inkubation Verziehen der Multiwell-Platte zu verhindern.
    Hinweis: Das Wasser sollte bis zur Hälfte der Platte Rock sein; Die Platte sollte nicht in Wasser getaucht werden.
  10. Waschen Sie die Zellen mit 60 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS dreimal (jeweils 5 min). Hinzufügen PBS mit einer Mehrkanalpipette und dekantieren PBS durch Umdrehen der Platte.
  11. Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 40 ul pro Vertiefung Blockierungspuffer hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Blockierungspuffer durch Umdrehen der Platte und dekantiert.
  12. Werden 40 & mgr; l Maus-anti-human Ki-67 (1: 200) und Ziege-anti-human PDX-1 (1: 100) in Blockierungspuffer auch mit jedem verdünnten Antikörper und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
  13. Am nächsten Tag, dekantiert die Antikörperlösung und wasche die Zellen mit 1x PBS dreimal (jeweils 5 min), wie oben beschrieben. Umfüllen PBS.
  14. In 40 ul pro Vertiefung verdünnt (1: 200) biotinyliertes Esel-anti-Maus-IgG und Rhodamin-konjugierten Esel-Anti-Ziegen-IgG in Blocking-Puffer. Inkubieren für 1 Stundebei Raumtemperatur.
  15. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. Werden 40 & mgr; l verdünnt (1: 400 in Blockierungspuffer) fluorescein-konjugiertem Streptavidin zu jeder Mulde. Inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  16. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. In 40 ul pro Vertiefung DAPI (300 nM in Blocking-Puffer) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
  17. Wash-Zellen mit 1x PBS zweimal und lassen Zellen in 40 ul 1x PBS. Die Platte ist nun bereit, analysiert zu werden.

7. β-Zellreplikation Analyse

Hinweis: Ein Testprotokoll für das High Content Screening-Mikroskop hergestellt werden muss verwendet, um β-Zell-Replikation zu messen. In seiner einfachsten Zusammensetzung Dieses Protokoll ist ein Zwei-Farben - Assay in dem ein Identitätsmarker verwendet wird β-Zellen (PDX-1 + -Zellen) und einen Replikationsmarker (Ki-67) zu definieren Zellteilung Ereignisse zu definieren.

  1. Identifizieren Sie Objekte (β-Zellen), basierend auf dem average Fluoreszenzintensität von PDX-1 - Färbung (549 - nm - Filter) innerhalb eines angenäherten Kreises (Länge: Breite <1,6) innerhalb des erwarteten Pixelbereich einer β-Zellkerns (2A).
  2. Als nächstes etablieren Einstellungen Replikationsereignisse (Ki-67-Positivität) , basierend auf der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (485 nm Filter) innerhalb des PDX-1 + Fläche (2B) zu identifizieren.
    Hinweis: Die Belichtungszeiten muss festgelegt werden, um Pixelintensität Vergleiche zwischen den Bildern ermöglichen. Assay-Protokoll-Parameter werden so eingestellt, dass Anrufe Maschine konstant unspezifische Färbung, Schutt und Zellaggregate auszuschließen, die sich nachteilig auf die Datenqualität beeinträchtigen könnten.
  3. Analysieren Sie ein Minimum von 500 β-Zellen pro Well Genauigkeit und Grenz Variabilität zu maximieren.
    Anmerkung: Die basale β-Zell-Replikation in Kulturen Index rat islet erwartet wird, 0,5 bis - 3%. Typischerweise beträgt 40 Bilder pro Vertiefung mehr als ausreichend 500 β-Zellen zu identifizieren.
  4. Vor der Analyse dergesamte Platte, Analyse ausgewählt Negativ- (DMSO-behandelten) und Positivkontrolle (5-iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 uM]) -behandelten Vertiefungen die Gültigkeit des Testprotokolls zu bewerten. Wenn der Test richtig hergestellt ist, induzieren positive Kontrollverbindungen mindestens eine zweifache Erhöhung des Prozentsatzes β-Zellen zu replizieren.
  5. Lesen Sie die gesamte Platte, sobald das Testprotokoll bestätigt wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zu β-Zelle oder α-Zellreplikation, eine Vierfarben-Assay-Protokoll ist erforderlich, zu beurteilen. Zuerst werden Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1, 386 nm) identifiziert. Als nächstes gezählt β-Zellen (Ereignis 1): Objekte , die und peri-Kern Insulin (Kanal 3, 549 nm) PDX-1 + (2, 650 nm - Kanal) zusammen auszudrücken. Anschließend replizieren β-Zellen (Ereignis 2) gezählt: ß-Zellen (Ereignis 1) coexprimierender Ki-67 (Kanal 4, 485 nm) (Abbildung 3). Der Prozentsatz der replizierenden β-Zellen wird berechnet: (Ereignis 2 / Ereignis-1) x 100 α-Replikation der Zellen zu quantifizieren, Gesamt Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1) und dann α-Zellen (Ereignis 1) identifiziert werden, aufgezählt durch das Fehlen von PDX-1-Färbung (Kanal 2) und die Anwesenheit von perinukleären Färbungs Glucagon (Kanal 3). Replizieren von α-Zellen (Ereignis 2) sind die Anzahl der α-Zellen coexprimierender Ki-67 (Kanal 4) (Abbildung 4).Der Anteil der Replikation von α-Zellen berechnet: (Ereignis 2 / Ereignis 1) x 100.

Vor dem Experiment initiiert wird eine Verbindung Behandlungsplan (Tabelle 1A) hergestellt. Hier eine kleine Skala-Test durchgeführt wurde unter Verwendung von Negativkontrolle (DMSO-behandelten) und der positiven Kontrolle (Dipyridamol behandelt [15 & mgr; M]) Bedingungen PDX-1 zu bewerten, β-Zellen und α-Zell-Replikation in einem 384-Well-Format ( 49 Bilder pro Vertiefung). Experimentelle Daten zeigen , Dipyridamol , um selektiv PDX-1 + -Zelle und β-Zell - Replikation fördern , aber nicht α-Zell - Replikation. Die durchschnittliche Anzahl der identifizierten PDX-1-Zellen pro Well betrug 5.541 ± 555 für DMSO-behandelten und 6439 ± 363 für Dipyridamol behandelten Bedingungen (p <0,01); zeigt eine Dipyridamol-abhängige Zunahme der PDX-1 - Zellnummer (Tabelle 1B, oben). Die durchschnittliche Prozent PDX-1 + -Zelle Replikation (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + <sup /> / DMSO + PDX-1 +) beträgt 3,35 ± 0,50% für DMSO-behandelten und 10,10 ± 0,98% für Dipyridamol behandelten Bedingungen (p <0,01) (Tabelle 1B unten). Wichtig ist , gibt es ähnliche PDX-1 + -Zelle Replikationsraten in Wells anschließend für β-Zellen analysiert (Zeilen CF) und α-Zell - Replikation (Zeilen GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (Zeilen CF) und 3,4 ± 0,23 (Reihen GJ) (p = 0,80); Dipyridamol = 9,8 ± 0,86 (Zeilen CF) und 10,4 ± 0.1.1 (Zeilen GJ) (p = 0,43). Obwohl also diese Brunnen, gebeizt für verschiedene Zell-Linie Marker (Insulin und Glukagon), reagierte ähnlich auf eine medikamentöse Therapie.

Weiter , um die Replikationsraten von β-Zellen und α-Zellen wurden aus den Rohdaten (Tabelle 2) berechnet. DMSO 3.930 ± 488 vs: Die durchschnittliche Anzahl der β-Zellen (Ereignis 1) wurde als Reaktion auf Dipyridamol Behandlung erhöht. Dipyridamol 4589 ± 218 (p <0,05). Bemerkenswert ist, gibt es eine signifikante Reduktion in der Anzahl der β-Zellen (3930 ± 488) im Vergleich zu PDX-1-Zellen (5541 ± 555) (p <0,01). Dies ist ein Ergebnis des Ausschlusses PDX-1 + -Zellen , die Insulin sind - aus der β-Zellzahl, beispielsweise δ-Zellen oder β-Zell - Vorläuferzellen und die zusätzlichen Stringenz erfordern β-Zellen Insulin + sein. Bemerkenswert ist , die Anzahl der α-Zellen (Ereignis 1) nicht mit Dipyridamol - Behandlung (p = 0,93 DMSO 1465 ± 123 vs Dipyridamol 1467 ± 74,7) erhöhen. Daher erhöht Dipyridamol selektiv β-Zellzahl. Aber die Anzahl von replizierenden α-Zellen (Ereignis 2) nicht (DMSO, die Anzahl der replizierenden β-Zellen (Ereignis 2) in Reaktion auf Dipyridamol Behandlung (p <0,01 DMSO 131 ± 31 vs. Dipyridamol 476,5 ± 39,6) erhöht 10,25 ± 3 vs. Dipyridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Schließlich wird der Prozentsatz der replizierenden β-cells und α-Zellen berechnet ((Ereignis 2 / Ereignis 1) x 100). Tatsächlich erhöht Dipyridamol den Prozentsatz β-Zellen zu replizieren , aber nicht α-Zellen (zusammengefasst in Figur 5). Wichtig ist, variiert die basale β-Zellreplikationsrate einer gesunden Kultur zwischen den Experimenten (0,5 bis 3%), aber sollten in Vertiefungen innerhalb eines Experiments sehr konsistent sein. Weil die basale Replikations Variable ist, die Verbindung induzierten β-Zellreplikationsrate ist auch über Versuche variabel; jedoch ist der Klapp Induktion von β-Zell-Replikation in Experimenten konsistent und ermöglicht Verbindung Wirksamkeit zuverlässig über Experimenten verglichen werden. Bemerkenswerterweise ist die α-Zellen-Replikationsrate ~ 5-mal niedriger als die β-Zellen-Replikationsrate und Kulturen enthalten ~ 1/3 so viele α-Zellen als β-Zellen; Folglich erhöht sich die α-Zell-Replikation Index zeigt Variabilität im Vergleich zu den β-Zell-Replikation Index. Um die Variabilität zu begrenzen, werden die Bilder pro Wellvon 49 (hier verwendet) bis zu einem Maximum von 81 erhöht.

Abbildung 1
Abbildung 1: Getrennte und Dispersed Ratten - Inseln. (A) Eine mikroskopische Aufnahme von gesunden isolierten Ratten - Inseln; 100 & mgr; m Maßstab gezeigt. (B) Mikroskopische Aufnahmen (5X und 10X Ziele) dispergierter Ratten - Inseln 1 Stunde nach der Beschichtung; 100 & mgr; m (links) und 200 & mgr; m (rechts) Skala Balken angezeigt. (C) Mikroskopische Aufnahmen (5X und 10X Ziele) von verteilten Ratten - Inseln 48 Stunden nach der Plattierung; 100 & mgr; m (links) und 200 & mgr; m (rechts) Skala Balken angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Automatische Identifikation von PDX-1 + + Inselzellen. (A) Verbindung behandelten Ratten dispergierte Inselzellen gefärbt PDX-1. PDX-1 + Objekte werden blau eingekreist; ausgeschlossen Objekte werden in orange eingekreist. Maßstabsbalken von 150 & mgr; m gezeigt. (B) Das gleiche Feld von Inselzellen gefärbt Ki-67. PDX-1 + ki-67 + doppelt positiven Zellen sind grün eingekreist. Maßstabsbalken von 150 & mgr; m gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Automatische Identifizierung von Replizieren von β-Zellen Replizieren von β-Zellen durch DAPI identifiziert werden (links oberen Ecke, blaue Kreise), PDX-1 (rechte obere Ecke, grüne Kreise), Insulin (linke untere Ecke, Magenta Kreise) und Ki-67 (rechte untere Ecke, rote Kreise) co-expression. Das fusionierte Bild (rechts) zeigt mehrere replizierende β-Zellen. Maßstabsbalken von 150 & mgr; m gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Automatische Identifizierung von Replizieren von α-Zellen Replizieren von α-Zellen durch DAPI identifiziert werden (links oberen Ecke, blaue Kreise), das Fehlen von PDX-1 (rechte obere Ecke, grüne Kreise), Glukagon (links-unten Ecke, Magenta Kreise) und Ki-67 (rechte untere Ecke, roter Kreis) Co-Expression. Das fusionierte Bild (rechts) zeigt eine seltene replizierenden Dublette von α-Zellen (gelber Pfeil). Maßstabsbalken von 150 & mgr; m gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 5:. Dipyridamol Induziert PDX-1 + - und β-Zell - Replikation aber nicht α-Zell - Replikation Grafische Darstellung von PDX-1-Zellen (oben links), β-Zellen (oben rechts) und α-Zellen (links unten) Replikation in DMSO und Dipyridamol-behandelten Vertiefungen sind gezeigt. Balken stellen den Mittelwert von unabhängig behandelten Vertiefungen (PDX-1-Replikation, n = 8; β-Zelle und α-Zell-Replikation, n = 4). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (* p <0,01). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<td> 3,77
EIN. Behandlung: Die Färbung:
4 5
C DMSO DIPYRIDAMOL Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
D DMSO DIPYRIDAMOL Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
E DMSO DIPYRIDAMOL Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
F DMSO DIPYRIDAMOL Insulin, DAPI, PDX-1, Ki-67
G DMSO DIPYRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
H DMSO DIPYRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
ich DMSO DIPYRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
J DMSO DIPYRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
B. Anzahl von PDX-1 + Zellen
DMSO DIPYRIDAMOL
4 5
C 5158 6249
D 6365 6795
E 4830 6974
F 5988 6408
G 5574 6532
H 5939 6411
ich 5612 6387
J 4862 5759
Prozent des PDX-1 + Ki-67 + -Zellen
DMSO DIPYRIDAMOL
4 5
C 3,04 9.99
D 3.91 10,57
E 2.51 8,58
F 10.14
G 3,44 10.1
H 3,06 10,69
ich 3,58 9.07
J 3,52 11,74

Tabelle 1: Repräsentative Versuchsplan und PDX-1 + -Cell Replikationsdaten. (A) Eine Darstellung des Behandlungsplans gezeigt. Wells wurden mit DMSO (Spalte 4) oder Dipyridamol (Spalte 5) behandelt. Färbung wurde mit DAPI durchgeführt, anti-PDX-1, anti-Insulin (normale Schrift) oder Anti-Glukagon (kursiv Beschriftung) und Ki-67 (B) Gesamtzahl der PDX-1 + Zellen (oben, DAPI +PDX-1 +) pro Vertiefung und der Prozentsatz PDX-1 - Zellen replizieren (unten, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) pro Vertiefung gezeigt.

Ereignis 1:
DMSO DIPYRIDAMOL
4 5
C 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
D 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
E 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
G 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
H 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
ich 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Ereignis 2:
DMSO DIPYRIDAMOL
4 5
C 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
D 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
E 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
G 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
H 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
ich 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
% Replikation:
DMSO DIPYRIDAMOL
4 5
C 3.18 9.77
D 3,47 11,25
E 2.8 9.55
F 3,78 10.99
G 0,82 0,57
H 0,68 0,63
ich 0,4 0,79
J 0,92 0,48

Tabelle 2: Repräsentative β-Zellen und α-Zellen - Replikationsdaten Die Gesamtzahl der β-Zellen (Ereignis 1: DAPI + PDX-1 + Insulin +; obere Tabellenzeilen CF, normal Beschriftung).), Α-Zellen (Ereignis 1 : DAPI + PDX-1 + Glucagon +; obere Tabellenzeilen GH, kursiv Beschriftung), β-Zellen (Ereignis 2 replizierende: DAPI + PDX-1 + Insulin + Ki-67 +; mittlere Tabellenzeilen CF, normal Beschriftung) und α -Cells (Ereignis 2: DAPI + PDX-1 + Glucagon + Ki-67 +; mittlere Tabellenzeilen GH, kursiv Beschriftung)pro Vertiefung dargestellt. Außerdem ist der Anteil der Replikation von β-Zellen (DAPI + PDX-1 + Insulin + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + Insulin + x 100; unteren Tabellenzeilen CF, normal Beschriftung) und α-Zellen (DAPI + PDX -1 + Glucagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + Glucagon + x 100; unteren Tabellenzeilen GJ, kursiv Beschriftung) pro Vertiefung dargestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Experimentelle Methoden für die molekularen Mechanismen zu studieren, die β-Zellwachstum und Regeneration zu steuern sind wichtige Werkzeuge für die Diabetes-Forscher. Hierbei wird eine Ratte-Insel-basierte Screening-Plattform für kleine Molekül Stimulatoren der β-Zell-Replikation identifizieren und zu charakterisieren, wird präsentiert.

Während die meisten Aspekte dieses Protokolls leicht von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, erfordern ein paar Schritte besondere Technik. Erstens, während Inselisolierung, Kanülierung des Gallengang, ohne seine Integrität zu stören erfordert Übung. Eine hilfreiche Strategie ist es, minimal den Gallengang aufblasen die richtige Positionierung der Nadel, um sicherzustellen, bevor sie vollständig die Pankreas-Verdauungslösung zu verzichten. Zweitens effiziente Inselisolierung von exokrinen Gewebe erfordert besondere Aufmerksamkeit, um die Verdauung Dauer und angemessene Bewegung. Es sollte eine gleichmäßige Erwärmung der ganzen verdauen durch intermittierende wirbelnden zu achten. Drittens experimentellen Erfolg abhängens auf kompetente Unterscheidung zwischen kleinen Inseln und exokrinen Schutt während der manuellen Kommissionierung Inselchen; Diese Fähigkeit verbessert mit der Praxis. Viertens islet Dispersion und Plattieren erfolgt so, dass alle Inseln in eine Mischung aus einzelnen Zellen und kleinen Clustern von zwei oder drei Zellen dispergiert sind. Über- und Unter Verdauung von Inseln vor dem Beschichten mit experimentellen Leistung beeinträchtigen. Frisch plattiert Insel-Zellen sollte ca. 50% konfluent sein , bevor die Verbreitung und erlaubt über die 48 Stunden zu befestigen , ohne gestört zu werden. Abbildung 1 das Aussehen der erfolgreichen Inselzellkulturen zu verschiedenen Zeiten zeigt nach der Plattierung. Fünftens Medienwechsel für Inselzellkulturen werden sorgfältig Unterbrechung von schwach anhaftenden Zellen zu vermeiden, erfolgen. Sechstens muß Antigen-Retrieval vorsichtig erfolgen Verziehen der Multiwell-Platte zu vermeiden, aber ausreichend erfolgreich Ki-67-Färbung zu ermöglichen, die sowohl unterempfindlich ist und eine Überbelichtung einer Temperaturerhöhung; verzogene Platten können nicht verwendet werdenautomatische Bildaufnahme. Beachten Sie, übermäßige Bauchspeicheldrüse Verdauung, die Exposition gegen exokrinen Gewebedebris und / oder Trypsinierung sind häufige Ursachen für Inselzellkultur Versagen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist das Vertrauen auf spezifische Expressionsmarker für β-Zellidentität und Replikationsereignisse. Verwendung einzelner Marker hat das Potenzial, irreführend. Zum Beispiel PDX-1 wird durch β-Zellen, einer Untergruppe von Somatostatin-exprimierenden δ-Zellen und β-Zell - Vorläuferzellen exprimiert 29,30; daher Verbindungen, die PDX-1-Replikation der Zellen erhöhen kann spezifisch auf einem nicht-β-Zellpopulation handelt sein. Folglich bestätigende Studien, die alternative β-Zellmarker verwenden, sind notwendig. In ähnlicher Weise ist Ki-67 - Expression keine perfekte Marker für die Replikation und weitere Indikatoren wie BrdU und Phospho-Histon - 3 sollte 31 verwendet werden. Eine zweite Begrenzung dieses Assays ist, dass Verbindungen, die β-Zell-Replikation induzieren simultanéβ-Zell-Apoptose oder Entdifferenzierung laufend erhöhen. Daher ist es wichtig , zu beurteilen , ob eine Verbindung in β-Zellzahl einen absoluten Anstieg induziert, und / oder induziert β-Zell - Apoptose und ob Verbindung behandelten β-Zellen normale Funktion (Glukose-stimulierte Insulinsekretion) 32 beibehalten. Eine dritte Einschränkung dieses Tests ist die bescheidene Durchsatz bei Verwendung von primären Inselzellen verbunden sind; Inseln aus sechs Ratten erzeugt 228 experimentelle Vertiefungen, die ~ 55 Verbindungen können in vierfacher Ausfertigung zu sehen sein (plus positive und negative Kontrollen). Eine weitere Einschränkung der beschriebenen β-Zellreplikation Screening-Plattform ist die Verwendung von Ratten-Inseln, anstatt menschlichen Inselchen. Die Unterschiede zwischen den menschlichen und Ratten-Inseln sind ausreichend, zu verlangen, dass alle Replikationsfördernden Verbindungen Kulturen unter Verwendung von Ratten-Insel identifiziert werden unter Verwendung von menschlichen Inselkulturen bestätigt. Um jedoch die begrenzte Verfügbarkeit und hohen Kosten der menschlichen Inselchen, das primäre Screening mit humanen i gegebenslets ist für die meisten Forscher nicht praktikabel.

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind: 1) die Verwendung von frisch isolierten primären Inselchen normale Wachstum Beschränkungen weit wie möglich zu halten, 2) die Verwendung einer 384-Well-Format moderate throughput screening zu ermöglichen (typischerweise Inseln aus sechs Ratten isoliert die Verwendung von automatisierten Bildaufnahme und Analyse den Schritt des Experimentierens und zu begrenzen Vorspannung zu beschleunigen sind ausreichend für 228 Vertiefungen) und 3). Im Gegensatz dazu häufig verwendete alternative Ansätze beruhen auf manuelle Bildaufnahme und subjektive Beurteilung von β-Zellen - Replikationsereignisse oder ganze Insel Einbau von radioaktivem Thymidin , die nicht zwischen Zell-linages, zB Fibroblasten im Vergleich zu β-Zell - Replikation 15,17 diskriminieren. Daher stellt die dargestellte Protokoll ein wichtiges und verbessertes Werkzeug zur Wachstumsregulierung von β-Zellen zu untersuchen.

Wir stellen uns eine Vielzahl von angepasstenverwendet für diese Screening-Plattform. Oder Insulin + -Zellen - Zunächst wird eine absolute Zunahme der β-Zellzahl kann durch Zählen der Anzahl von PDX-1 + gemessen werden. Zur Berücksichtigung Variabilität in der Anzahl der pro Vertiefung einer höheren Anzahl von Replikaten pro Bedingung plattierten Zellen enthalten sein kann (typischerweise n = 8). Zweitens werden die Plattform kann für Lentivirus-basierte Überexpression oder Knock-out / down Experimente angepasst Wege in β-Zell-Replikation beteiligt sind zu identifizieren. Zusammenfassend ist die beschriebene experimentelle Technik allgemein nützlich für die Verbindungen und die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die β-Zell-Replikation regulieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4, (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58, (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19, (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163, (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159, (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15, (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92, (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128, (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478, (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58, (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61, (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21, (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28, (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17, (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127, (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290, (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57, (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28, (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7, (9), e44600 (2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41, (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150, (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26, (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11, (4), 201-212 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics