Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

Bioengineering

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Summary

Ein Protokoll für die Herstellung und Charakterisierung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladen 1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Amino (Polyethylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) Micellen beschrieben.

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Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

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Abstract

Introduction

Chemotherapie wird häufig verwendet, um verschiedene Formen von Krebs zu behandeln. Die meisten, wenn nicht alle, chemotherapeutische Medikamente haben toxische Nebenwirkungen, die von handhabbaren minor Bedingungen, wie Übelkeit und Diarrhö, um mehr lebensbedrohlichen Zuständen variieren kann. Da die meisten Krebsmedikamente toxisch, nicht-selektive Belichtung dieser Medikamente zu normalem Gewebe sind verursacht unweigerlich Toxizität. Daher besteht ein großer Bedarf für einen therapeutischen Ansatz, der selektiv Drogen in Krebszellen liefern kann. Eine weitere Herausforderung bei der Verabreichung von Anti-Krebs-Medikamente ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Üblicherweise werden Solubilisierungsmittel notwendig, um diese schlecht löslichen Arzneimitteln zu formulieren. Allerdings sind die meisten Lösungsvermittlern, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, und Polysorbat 80 (Tween 80) kann zu Leber- und Nierentoxizität, Hämolyse und akute Überempfindlichkeitsreaktionen und periphere Neuropathien. 1 daher sicher und biokompatibel Formulierungen erforderlich sind für die klinische Verwendung von schlechtenly löslichen Krebsmedikamente. Nanocarriers sind vielversprechende Wirkstoffabgabesysteme für die oben genannten Herausforderungen. Diese Nanocarriern umfassen Liposomen, 2 Nanopartikel, 3 Mizellen, 4-7 Polymer-Wirkstoff - Konjugate, 8 und anorganischen Materialien. 9 Mehrere Nanoprodukte (zB Caelyx, Abraxane und Genexol) wurden von den Aufsichtsbehörden genehmigt worden , um Krebspatienten zu behandeln. 10

Polymere Mizellen sind vielversprechende nanoskalige Wirkstoffabgabeträger, die für die Abgabe von Antikrebsmitteln erfolgreich verwendet wurden. 4-7,11,12 Typische polymere Mizellen werden aus amphiphilen Polymeren durch eine Selbstorganisation. Die Kern-Schale-strukturierte polymere Mizellen umfassen eine hydrophile Schale und einen hydrophoben Kern. Die hydrophile Schale kann sterisch Mizellen stabilisieren und ihre Zirkulation im Blutstrom zu verlängern. Der hydrophobe Kern kann wirksam hydrophob d einzukapselnTeppiche. Aufgrund der geringen Größe der Mizellen (typischerweise weniger als 200 nm) und Langzirkulationseigenschaften werden polymere Mizellen angenommen Tumor-Targeting durch erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekte (passive Tumor Targeting) zu erreichen.

Wirkstoffbeladung Stabilität ist für den Tumor kritische Fähigkeit von Mizellen Targeting. Um eine optimale Tumor-Targeting zu erreichen, sollte Mizellen minimale Medikamenten Leckage haben, bevor die Tumorstelle zu erreichen, noch kurz die Droge nach Krebszellen gelangt. Zusätzlich ist Formulierungsstabilität auch eine wesentliche Voraussetzung für die Produktentwicklung, weil Formulierungsstabilität, die Durchführbarkeit der Produktentwicklung bestimmt, sowie die Haltbarkeit der entwickelten Produkte. Kürzlich wurde viel Anstrengung unternommen, die Belastung von Medikamenten in Lieferträger zu verbessern. Die lipophile Prodrug - Ansatz ist eine Strategie , die erforscht wurde Wirkstoffbeladung in Lipid - Nanopartikel und Emulsionen zu verbessern. 13,14 Die Konjugation von Lipiden mit Medikamenten deutlich ihre Lipophilie verbessern und in den lipophilen Komponenten von Nanocarriern Laden und Retention zu verbessern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladenen Mizellen. Zunächst wird die Syntheseprozedur lipophilen Prodrug für Doxorubicin beschrieben. Dann wird ein Protokoll für die Mizellen mit einem filmDispersionsVerfahren Erzeugen eingeführt. Diese Methode wurde in unseren früheren Studien. 5 DSPE-PEG wurde ausgewählt als Trägermaterial zur Herstellung von Micellen , weil es wurde für Micelle Arzneimittelabgabe erfolgreich eingesetzt erfolgreich eingesetzt. 15,16 Schließlich wir Micelle mehrere in vitro - Assays zur Charakterisierung beschreiben Formulierungen und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.

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Protocol

1. Synthese von DOX-PA

  1. Wiegen 390 mg Doxorubicin und 243 mg Palmitinsäure Hydrazid, und in einen Rundkolben gegeben.
  2. Zugabe von 150 ml wasserfreiem Methanol in den Kolben mit einer Glasspritze. In 39 ul Trifluoressigsäure (TFA) mit einer Pipette. Verwendung eines magnetischen Rührers, rühre das Reaktionsgemisch 18 h bei RT im Dunkeln.
    HINWEIS: Die Mengen an Reaktionsmaterialien skaliert werden können oder nach unten unterschiedlichen Mengen von DOX-PA zu erhalten. Das Verhältnis der Reaktanten sollte in den gleichen Proportionen eingehalten werden. Reaktionen unter Verwendung von DOX Mengen im Bereich von 78 mg bis 1.170 mg in einem regelmäßigen Chemielabor durchgeführt werden.
  3. Reinigung von DOX-PA eine Kieselgelsäule mit. 17
    1. Entferne das Lösungsmittel in dem Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer. Werden 3 g Kieselgel, nachdem das Volumen des Gemisches auf etwa 20 ml reduziert. Weiter Rotationsverdampfen trockene Pulver zu ergeben, und t zu ermöglichener Adsorption von Produkten auf das Silicagel. Halten der Probe unter einem Vakuum für weitere 30 min, nachdem die Trockenpulver gebildet werden.
    2. Pack 50 g Kieselgel in einer Kolonne von Dichlormethan als Lösungsmittel verwendet wird. Vorsichtig die Kieselgel-Probe adsorbierte Produkt an die Säule enthält.
    3. Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus Dichlormethan und Methanol, wobei nach und nach den Anteil an Methanol zu, wodurch Lösungsmittelpolarität zunehmende (Tabelle 1).
    4. Sammle Fraktionen des Eluenten in Teströhrchen (25 ml / Röhrchen) und den Fortschritt durch Dünnschichtchromatographie (TLC).
    5. Kombinieren Sie alle Fraktionen, die reine DOX-PA und entferne das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bis trockenes Pulver gebildet wird. Trocknen das Produkt weiter unter Vakuum O / N.
  4. Analyse von DOX-PA durch TLC.
    1. Schneiden Sie ein 4 cm x 8 cm langen Abschnitt der DC-Platte. Spot-Probenlösungen 0,5 cm von der Unterseite der Platte mit TLC Spek Kapillaren unter Verwendung erfülltHANOL als Lösungsmittel.
    2. Platzieren Sie die DC-Platte in eine Entwicklungskammer mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol, das (3/1, v / v). Die Tiefe der Lösungsmittel sollte als 0,5 cm nur weniger.
    3. Entfernen Sie die Platte aus der Entwicklerkammer, wenn die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht. Markieren Sie die Stelle des Lösungsmittelfront mit einem Bleistift und lassen Sie die Platte zu trocknen. Legen Sie die DC-Platte in eine Färbungskammer gesättigt Joddampfes enthält, um Proben zu visualisieren.
  5. Analyse von DOX-PA mit 1 H-Kernresonanzspektroskopie (1 H-NMR). 18
    1. Man löst 15 mg des DOX-PA in 1 ml Methylsulfoxid-d 6 (DMSO) und Übertragung der Probe in ein NMR-Röhrchen.
    2. Legen Sie die NMR-Röhrchen in den Magneten des NMR-Instrument. Messung der Protonenspektrum, Auswählen DMSO als Lösungsmittel. Entfernen Sie das NMR-Röhrchen von dem Magneten. Analysieren Sie den NMR - Ergebnis 18.

2. Herstellung von DOX-PA Mizellen durch Film-Dispersionsverfahren

  1. Auflösen DSPE-PEG (40 mg) und DOX-PA (4 mg) mit 2 ml Methanol in einem 10 ml Glasfläschchen.
  2. Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum am Rotationsverdampfer, bis sich ein dünner Film bildet sich in der Phiole verwendet.
    HINWEIS: Alternativ verdampfen die organischen Lösungsmittel unter Inertgas (zB Argon oder Stickstoffgas) einen Film zu bilden und das Fläschchen in einem Vakuumexsikkator halten , um weitere Lösungsmittelreste zu entfernen.
  3. Transfer 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4, DPBS) auf dem Glasfläschchen.
  4. Legen Sie das Fläschchen in einem Ultraschallbad für 3 min bei RT zu Mizellen erzeugen.
    HINWEIS: Die Ultraschall-Leistung variiert zwischen den verschiedenen Modellen von Ultraschallbädern. Wählen Sie eine Einheit, die genügend Ultraschallleistung erzeugen kann, die dünne Polymer / Arzneimittel-Film zu zerstreuen. Die Ausgangsleistung des Ultraschallbades in diesem Protokoll verwendet ist 110 W.
  5. Halten Mizellen bei 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -20 ° C für lange-term Lagerung.
    HINWEIS: Alternativ können Mizellen auch gefriergetrocknet und vor Gebrauch mit Wasser rekonstituiert. Normalerweise kein Gefrierschutzmittel oder Lyoschutzmittel wird für diese Formulierung erforderlich.

3. Charakterisierung der DOX-PA Mizellen

  1. Bestimmung der DOX-PA - Konzentration in Mizellen und Drogen Verkapselungswirksamkeit
    1. Auflösen DOX-PA in vorherigen Schritten in DMSO synthetisiert DOX-PA-Lösungen von fünf verschiedenen Konzentrationen herzustellen: 1 & mgr; g / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml und 100 & mgr; g / ml. Messen der Absorption von DOX-PA-Lösungen mit einem UV-VIS-Spektrometer bei 490 nm. Generieren Sie eine Standardkurve auf der Basis der DOX-PA Wirkstoffkonzentrationen und deren bei 490 nm entsprechenden Absorption.
    2. Verdünne 25 & mgr; l von mit Wirkstoff beladenen Mizelle mit 500 ul DMSO. Messen Sie die Absorption bei 490 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Berechnen Wirkstoffkonzentrationen mit der Standardkurve in 3.1.1 erzeugt.
    3. Berechnen Verkapselungseffizienz Verwendung der folgenden Gleichung:
      Drug Umhüllungs-Effektivität (%) = (Menge an Arzneimittel in Mizellen) / (Menge an zugesetztem drug) × 100%
  2. Charakterisierung von Partikelgröße mit dynamischer Lichtstreuung (DLS)
    1. Verdünnte Mizellen mit DPBS (pH 7,4) auf eine endgültige DSPE-PEG-Konzentration von 1 mg / ml. Analysieren eine 2 ml Probe mit einem Teilchengrßenanalysator das Z-gemittelte Größe und Polydispersitätsindex (PDI) zu erhalten.
  3. Bewertung der in - vitro - Aktivität gegen Krebs
    HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sterile Technik und in einem Biosicherheitsschrank bedienen.
    1. Entfernen des Zellkulturmediums aus einer Zellkulturflasche (beispielsweise T25) enthält , DU-145 menschlichen Prostatakrebszellen und spülen Sie die Zellen mit 2 ml DPBS (pH 7,4).
    2. Aspirat DPBS, 1 ml Trypsin-Lösung (0,25%) und bei 37 ° C für 2 min inkubiert, um die Zellen abzulösen.
    3. In 10 ml Zellkulturmedium (RPMI 1640 + 10% fötales Rinderserum + 1% Antibiotic-Antimykotische), wenn die meisten der Zellen aus dem Kolben abgelöst werden. Transfer-Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere die Zellen bei 1.000 × g für 5 min.
    4. Resuspendieren des Zellpellets mit 5 ml Kulturmedium Zelle und Entfernen mit einem Hämozytometer eine Probe Zellzahlen zum Zählen. Verdünne die Zellen mit Zellkulturmedium bis zu einer Dichte von 50.000 Zellen / ml. Fügen Sie die verdünnten Zellsuspensionen in einer 96-Well-Zellkulturplatte (100 & mgr; l / Well). Inkubieren der Zellen in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) für 18 h Zellanheftung zu ermöglichen.
    5. Verdünnte DOX Dimethylsulfoxid (DMSO) -Lösung und DOX-PA DMSO Lösung mit Zellkulturmedium bis zur endgültigen Arzneimittelkonzentrationen von 0,1 & mgr; M zu erhalten, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Halten DMSO-Endkonzentration in allen obigen Proben auf 0,5%. Verdünnte DOX-PA Mizellen mit Zellkulturmedium endgültige Arzneimittel co zu erhaltenncentrations von 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Verwenden Sie die leere Zellkulturmedium, das eine Kontrolle.
    6. Entfernen Sie die 96-Well-Zellkulturplatte aus dem Inkubator und ersetzen Sie die Zellkulturmedium mit 100 ul Medium unterschiedliche Behandlungsmittel enthalten, hergestellt in Schritt 3.3.5 (n = 4 für jede Gruppe). Inkubieren der Zellen in der Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) für eine weitere 72 hr.
    7. Anzusaugen, das Medium und füge 100 ul Medium, enthaltend 0,5 mg / ml 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid (MTT).
    8. Inkubieren der Zellen in der Zellkultur-Inkubator für weitere 2 Stunden. Sie vorsichtig das Medium zu entfernen und 100 ul DMSO hinzufügen Formazankristallen aufzulösen.
    9. Messung der Extinktion mit dem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 670 nm.
    10. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      (A Test / A - Steuerung) × 100%
      HINWEIS: Vergleichen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen unter Verwendung einer Einwegvarianzanalyse (ANOVA) statistischer Test. Berechnen Sie die IC 50 basierend auf die Lebensfähigkeit der Zellen gegen die Arzneimittelkonzentration Daten.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt das Syntheseschema von DOX-PA. DOX-PA wurde durch Konjugation von Palmitinsäure synthetisiert mit Doxorubicin über eine pH-sensitive Hydrazonbindung. Ein geringer Überschuß an Palmitinsäure Hydrazid wurde verwendet, um die Vervollständigung der Reaktion zu erleichtern. Dieses Reaktionsverfahren hat einen sehr hohen Wirkungsgrad und nur eine geringe Menge von Doxorubicin blieb nach 18 h Reaktion (Abbildung 2). Die Ausbeute betrug etwa 88%. Am Ende der Reaktion wurde DOX-PA gereinigt eine Kieselgelsäule mit und ein reines Rot festes Produkt zu erhalten getrocknet. DOX-PA wurde mit TLC analysiert, die einen einzigen Fleck für gereinigtes DOX-PA ergab (Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt das 1 H-NMR - Spektrum von DOX-PA. Charakteristische NMR-Peaks sowohl von Doxorubicin und Palmitinsäure wurden, beobachtet, was den weiteren Erfolg der Konjugationsreaktion bestätigt.

Abbildung 4. Blank DSPE-PEG - Mizellen ohne Arzneimittel als transparente Flüssigkeit erscheinen gezeigt. DOX-PA DSPE-PEG-Mizellen erscheinen als rote Flüssigkeit; die rote Farbe ist aufgrund der DOX-PA in den Mizellen geladen. Repräsentative Ergebnisse der Partikelgrößenanalyse sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Z-Durchschnitt mittlere Teilchengröße für leere DSPE-PEG - Mizellen betrug 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Die Belastung des DOX-PA erhöht Mizellen Partikelgröße leicht; das Z-gemittelte mittlere Teilchengröße für DOX-PA DSPE-PEG-Micellen war 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

Die DOX-PA-Konzentration in der Micelle Formulierung wurde bei 490 nm auf der Basis der Absorption bestimmt. DSPE-PEG hat eine vernachlässigbare Absorption bei dieser Wellenlänge ist somit nicht in der Analyse von DOX-PA-Konzentration stören. Die DOX-PA-Konzentration in der Formulierung war Mizelle1,99 ± 0,11 mg / ml und die Wirkstoffbeladungseffizienz betrug 99,3 ± 5,7%. Die hohe Einkapselungseffizienz ist aufgrund der lipophilen Eigenschaft von DOX-PA, die ihre Retention im hydrophoben Kern von Micellen verbessert. Die Formulierung zeigte eine hervorragende Stabilität. Es gab keinen sichtbaren Niederschlag bei Lagerung bei - 4 ° C für 3 Wochen. Keine signifikante Veränderung der Arzneimittelkonzentration wurde während der Lagerung beobachtet.

DU-145 menschlichen Prostatakrebszellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von freiem Doxorubicin, freies DOX-PA behandelt und DOX-PA DSPE-PEG-Mizellen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde am Ende eines 72 Stunden - Behandlung unter Verwendung eines MTT - Assays (6) bestimmt. Eine konzentrationsabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Behandlung DU145 Zellen mit freiem Doxorubicin (IC 50 = 0,10 & mgr; M), freies DOX-PA (IC 50 = 0,33 & mgr; M) oder DOX-PA - Mizellen (IC 50 = 0,25 & mgr; M) erzielt. Obwohl freies Doxorubicin ist wirksamer als freie DOX-PA oder DOX-PA Mizellen bei niedrigeren Konzentrationen (0,1 uM und 0,5 uM), DOX-PA Gruppen zeigte eine größere Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen als freies Doxorubicin bei höheren Konzentrationen (2-10 uM). Außerdem schien es keinen signifikanten Unterschied zwischen DOX-PA und DOX-PA Mizellen an beiden höheren und niedrigeren Konzentrationen zu sein. Blank DSPE-PEG-Micellen zeigte keine Toxizität (Daten nicht gezeigt), was auf eine gute Biokompatibilität und Sicherheit von DSPE-PEG als Wirkstoffträgermaterial.

Abbildung 1
Figure 1. Synthese von lipophilen Prodrug von Doxorubicin (DOX-PA) Reagentien und Bedingungen:. Doxorubicin (DOX), Palmitinsäure hydrazid (PA) und Trifluoressigsäure (TFA) gelöst in Methanol wurden 18 h bei RT in die gerührte dunkel. t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Dünnschichtchromatographie (TLC). TLC (1) Doxorubicin, (2) rohe Reaktionsgemisch, (3) Palmitinsäure Hydrazid, und (4) DOX-PA - Konjugat. Die Proben wurden mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol entwickelt (3/1, v / v) und mit Jod gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3. 1 H-NMR von DOX-PA in deuteriertem DMSO. Die Anwesenheit von charakteristischen Peaks von sowohl DOX und PA zeigt den Erfolg der Konjugationsreaktion.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Aussehen von Mizellen. (A) DSPE-PEG - Mizellen und (B) DOX-PA DSPE-PEG - Mizellen. Repräsentative Zahlen wird das Auftreten von leeren DSPE-PEG - Mizellen und DOX-PA DSPE-PEG - Mizellen zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Partikelgröße und Größenverteilung von Mizellen. (A) DSPE-PEG - Mizellen und (B) DOX -PA DSPE-PEG-Mizellen. Die Mizellgröße wird durch dynamische Lichtstreuung bestimmt. Repräsentative Figuren werden vorgestellt, um Partikelgröße und Größenverteilung zeigen. Die vorgelegten Daten sind Mittelwert ± SD (n = 3). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Anti - Krebs - Aktivität der Mizelle - Formulierungen. DU145 Zellen wurden 72 h , und die Lebensfähigkeit der Zellen behandelt , um das MTT - Assay gemessen. Die Daten in der Abbildung dargestellt sind Mittelwert ± SD (n = 4). *, P <0,01, im Vergleich zu DOX Gruppen behandelt. Es gibt kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen DOX-PA und DOX-PA Mizellen behandelten Gruppen. IC 50 wurde berechnet , basierend auf die Lebensfähigkeit der Zellen gegen die Arzneimittelkonzentration Daten.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1

Tabelle 1 CH 2 Cl 2 / CH 3 OH Eluierungslösungsmittel verwendet bei der Reinigung von DOX-PA.

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Discussion

In dieser Arbeit beschreiben wir eine unkomplizierte, schnelle Filmdispersionsverfahren zur Herstellung von Mizellen. Dieses Verfahren nutzt die Selbstorganisation eines amphiphilen Polymers (zB DSPE-PEG) Kern-Schale - strukturierten Mizellen in einer wässrigen Umgebung zu bilden. Diese Mizellen Herstellungsverfahren hat mehrere Vorteile. 1. Es handelt sich eine einfache Formulierungsverfahren, die die Verwendung von komplizierten Zerkleinerungsschritten (wie Extrusion oder Homogenisierung) vermeidet üblicherweise bei der Herstellung von Liposomen verwendet, Nanopartikel und Nanoemulsionen. 19 2. Es hat eine gute Reproduzierbarkeit. Excellent Charge zu Charge kann Konsistenz erreicht werden, wenn die Formulierung optimiert und hergestellt wurde. Das Protokoll ist tolerant gegenüber Variationen in der Herstellung von Prozessvariablen, wie beispielsweise Beschallung Kraft und Zeit. Obwohl andere Verfahren (wie beispielsweise die Dialyse Ansatz oder dem Emulsionslösungsmittelverdampfung Ansatz) zur Herstellung von Micellen vorliegen, die FilmdispersionsVerfahren ist bequemer und effizienter. Daher hat es ein großes Potenzial für die in großem Maßstab Herstellung von Mizellen in der pharmazeutischen Industrie Verwendung angepasst werden. Die Beschränkung dieses Verfahrens ist, dass es auf die Selbstorganisation von Trägermaterialien und somit begrenzt ist auf Materialien mit solchen Eigenschaften abhängt. Die unangemessene Auswahl von Polymermaterialien können bei der Erzeugung von zufriedenstellenden Mizellen Formulierungen zum Ausfall führen. Darüber hinaus stützt sich das Herstellungsverfahren auf Ultraschallbehandlung der Polymer / Arzneimittel Film zu dispergieren, und um die Bildung von Mizellen zu erleichtern. Die meisten kommerziell erhältlichen Ultraschallbäder geeignet sind, da nur eine schwache Ultraschallleistung Mizellen zu bilden, wird benötigt. Es könnte jedoch ein Problem, wenn ein Ultraschallbad mit einem sehr schwachen Leistung verwendet werden soll.

Schlechte Wirkstoffbeladung und vorzeitige Wirkstofffreisetzung sind wichtige Anliegen für Mizellen Arzneimittelabgabe. In diesem Protokoll entwickelten wir einen lipophilen Prodrug-Strategie, die Last zu erhöhening von Doxorubicin in DSPE-PEG-Mizellen. Konjugation von Doxorubicin mit Lipiden Kompatibilität und Wechselwirkung des Arzneimittels mit dem Lipid-Kern aus DSPE-PEG-Micellen signifikant verbessert. Das Prodrug, DOX-PA wurde durch Konjugieren von Doxorubicin mit Lipid über einen sauren pH-responsive Hydrazon-Linker synthetisiert. Dieser Linker ist stabil bei neutralem pH und spaltbare bei saurem pH. 20,21 Somit wird DOX stabil in DSPE-PEG - Micellen als Prodrug bei neutralem pH geladen und ist während der Lagerung und während der Zirkulation im Blut minimal Arzneimittel Leckage. Sobald DOX-PA Mizellen Tumorzellen über Endozytose, DOX-PA pro-drug treten wird in freies DOX in Reaktion auf die saure Endosomen Umgebung (pH 5-6) gespalten und umgewandelt werden. Da DOX hydrophiler als DOX-PA ist, wird diese Umwandlung die Wechselwirkungen zwischen DOX und dem hydrophoben Kern der Mizellen, stören und damit die schnelle Freisetzung von DOX von Mizellen erleichtern. Dieses innovative Design-Funktion unvollständig Wirkstofffreisetzung zu vermeiden, dieist ein Hauptproblem bei der Wirkstoff - Konjugate nicht spaltbaren oder sich langsam Abspalten Linker assoziiert werden. Dieser Ansatz 22 auch für die Lieferung von anderen Arzneimitteln angewendet werden kann. Die Auswahl eines geeigneten Linkers ist für den Erfolg dieses Ansatzes entscheidend. Die Linker sollte in einer physiologischen Umgebung, um stabil sein, um die Stabilität der Formulierung zu maximieren. Die Linker sollte auch effizient in Reaktion gespalten werden , in der Tumor - Mikroumgebung zu auslöst (beispielsweise pH, Enzyme, etc.) der Stammwirkstoff freizusetzen.

In diesem Protokoll wurde DOX-PA effizient in Mizellen mit hohen Verkapselungseffizienz geladen (~ 100%). Die Mizellen Formulierung zeigte auch eine überlegene Stabilität und blieb intakt für mindestens drei Wochen ohne Medikament Fällung oder eine Verringerung der Wirkstoffkonzentration. Dies ist auf die verbesserte Wechselwirkung zwischen Lipideinheiten in der Prodrug und der Lipidkern von DSPE-PEG-Micellen. Engineering the compatibikeit von Trägermolekülen mit Medikamenten ihre Wechselwirkung zu verbessern, ist eine vielversprechende Strategie für die Leistung von Mizellen und andere Nanocarriern zu verbessern. Dieser Ansatz kann die Wirkstoffbeladung zu verbessern und verfrühte für diese Nanocarriern Wirkstofffreisetzung zu minimieren. 23 Die Auswahl eines geeigneten Arzneimittel / Polymer - Paar ist ein entscheidender Schritt in die Mizellen Formulierung zu entwerfen. Die Struktur der Arzneimittelmoleküle können (Pro-Drug - Ansatz) oder die Konstruktion von Trägermaterialien optimiert werden kann , um die Kompatibilität zu verbessern , modifiziert werden und Arzneimittel / Träger - Wechselwirkungen zu verbessern. 23 24 Darüber hinaus rechnerische Modellierung ein nützliches Werkzeug sein kann , zu helfen bei der Optimierung von Nanocarriern und machen es möglich, eine individuelle entworfen Nanocarrier für spezifische einem bestimmten Medikament herzustellen.

Zusammenfassend beschreiben wir hier ein Verfahren zur Herstellung eines lipophilen Prodrug von Doxorubicin zu synthetisieren. Protokolle für die Herstellung und Charakterisierung von wirkstoffbeladenen Mizellen auch Beschribed. Die filmDispersionsVerfahren ist eine einfache und vielversprechendes Verfahren für eine Vielzahl von nanoskaligen Selbstorganisation Abgabesysteme vor. Die Charakterisierung hier beschriebenen Methoden können als Standard - in vitro - Assays verwendet werden , um die Eigenschaften von Nanomedizin , um zu bestimmen, kann somit die Optimierung der Formulierung und Produktentwicklungsprozesse zu erleichtern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

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References

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