जन Cytometry विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना

Biology

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McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

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Abstract

जन cytometry भारी धातु लेबल, एक दृष्टिकोण है कि बहुत अच्छी तरह से क्या पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित फ्लो के साथ संभव है परे मानकों और गहरे विश्लेषण के लिए अवसरों की संख्या बढ़ गई है के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है। किसी भी नई तकनीक की तरह ही, महत्वपूर्ण चरण हैं, जो मदद उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की विश्वसनीय पीढ़ी सुनिश्चित कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि बड़े पैमाने cytometry विश्लेषण के लिए सेल के नमूने के प्रसंस्करण के लिए कई तकनीकों को शामिल किया गया है। तरीकों यहाँ वर्णित में मदद मिलेगी उपयोगकर्ता सामान्य कठिनाइयों से बचने और परिवर्तनशीलता है, जो गलत डेटा को जन्म दे सकता कम करके संगत परिणाम प्राप्त। प्रयोगात्मक डिजाइन को सूचित करने के लिए, प्रोटोकॉल और सिस्टम जांच की जा रही के जीव विज्ञान में नए निष्कर्ष को उजागर करने में उनकी प्रभावोत्पादकता में वैकल्पिक या वैकल्पिक कदम के पीछे के तर्क कवर किया जाता है। अन्त में, प्रतिनिधि डेटा तकनीक presente से उम्मीद परिणाम वर्णन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता हैयहाँ d।

Introduction

Cytometry कोशिकाओं की विशाल जनसंख्या में एक एकल कोशिका स्तर पर अनेक एंटीबॉडी लक्ष्यों के एक साथ माप सक्षम बनाता है। पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित फ्लो में, पैरामीटर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की संख्या कई fluorophores के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है, जो मानकों की संख्या बढ़ जाती के रूप में जटिल मुआवजा गणना की आवश्यकता के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप द्वारा सीमित है। ये सीमाएं जन cytometry, जहां भारी धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता चला और उड़ान (टीओएफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के समय बहुत एक साथ एकत्र पैरामीटर की संख्या का विस्तार करने और प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए एक उच्च आयामी प्रोटीन बहुतायत प्रोफ़ाइल उपज द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं ने संबोधित कर रहे हैं।

साधन cytometry जन के कामकाज का एक बुनियादी समझ उपयोगकर्ता के लिए फायदेमंद है और समस्या निवारण के लिए आवश्यक हो सकता है। ट्यूनिंग की एक अधिक गहन विवरण और एक बड़े पैमाने पर cytometry मशीन को चलाने के लिए,संबंधित पांडुलिपि 1 देखें। संक्षेप में, एक सेल नमूना धातु संयुग्मित कोशिका की सतह मार्करों, cytoplasmic प्रोटीन, परमाणु प्रोटीन, क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन या ब्याज (चित्रा 1 मैं) के अन्य एपीटोपों को लक्षित एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ लेबल है। लेबल कोशिकाओं एक autosampler का उपयोग कर मैनुअल इंजेक्शन द्वारा एक समय में एक मशीन पर भरी हुई है, या तो या कर रहे हैं कि एक 96 अच्छी तरह से थाली से नमूने हैं। लोड कोशिकाओं नेब्युलाइज़र, जो कोशिकाओं (चित्रा 1ii) encapsulating तरल बूंदों की एक स्प्रे उत्पन्न करता है के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता। इस स्प्रे तैनात ताकि कोशिकाओं एक आर्गन प्लाज्मा मशाल द्वारा आयनित कर रहे हैं। यह आयनीकरण एक कण बादल प्रत्येक कक्ष (चित्रा 1iii) के सभी संघटक परमाणुओं के शामिल उत्पन्न करता है। इस कण बादल डिटेक्टर के लिए यात्रा के रूप में, कम परमाणु भार परमाणुओं एक quadrupole मास फिल्टर द्वारा उच्च द्रव्यमान आयनों से अलग होती है। शेष उच्च द्रव्यमान आयनों डिटेक्टर, जहां abund के लिए जारीप्रत्येक आइसोटोप की मंजूरी मात्रा निर्धारित है (चित्रा 1iv)। डिटेक्टर द्वारा एकत्र कच्चे डेटा, जन cytometry साधन सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया जाता है सेल की घटनाओं की पहचान। प्रत्येक पहचान सेल घटना के लिए, संकेत प्रत्येक चैनल में पाया मात्रा निर्धारित और एक आउटपुट .fcs फाइल करने के लिए सहेजा जाता है। बड़े पैमाने पर भारी धातु संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया चैनलों न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप है, जो 1% से नीचे सबसे योगदान के साथ 0-4% से पर्वतमाला दिखा रहे हैं। चैनलों के बीच इस कम पार बात के कारण, यह आम तौर पर विश्लेषण 2 से पहले एक मुआवजा मैट्रिक्स के साथ डेटा को बदलने के लिए अनावश्यक है। हालांकि, ध्यान एंटीबॉडी के प्रयोगात्मक पैनल के डिजाइन के दौरान यह सुनिश्चित करें कि एक उच्च बहुतायत एपीटोप के साथ एक एंटीबॉडी एक जन चैनल है कि एक चैनल एक कम बहुतायत एंटीबॉडी करने के लिए आवंटित करने के लिए संकेत योगदान देता है करने के लिए आवंटित नहीं है, यह मई के रूप में लिया जाना चाहिए चैनल संकेत योगदान प्राप्त करने में एक कृत्रिम रूप से उच्च जनसंख्या पैदा करते हैं।

3, 4 के साथ होने के लिए जाना जाता है। जीवित कोशिकाओं पर कोशिका की सतह एंटीबॉडी धुंधला करने में कुछ एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन इस एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले बारकोडिंग के रूप में सबसे बारकोडिंग तरीकों निर्धारण 5 के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, हालांकि एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग 6, 7 एक अपवाद है का विकल्प निवारण होता है।

कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करने के विश्लेषण के लिए तैयार रहने की है, यह जानते हैं कि केवल कोशिकाओं मशीन पर लोड का एक अंश पता लगाया जाएगा और डेटा का निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस नुकसान जब कणित्र मशाल पर नमूना स्प्रे मुख्य रूप से अक्षमताओं के कारण है। सटीक प्रतिशत नुकसान मशीन सेटअप और कोशिका प्रकार लेकिन cytometry जन पर निर्भर करता है 50-85% से लेकर कर सकते हैं और होना चाहिएमाना जाता है जब प्रयोग डिजाइनिंग। यह प्रोटोकॉल नमूना प्रति 2x10 6 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन छोटा या बड़ा नमूना आकार के प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित किया जा सकता। यह प्रोटोकॉल न्यूनतम संशोधनों के साथ, 4 x 10 6 के लिए 1 एक्स 10 6 से नमूना आकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि नमूने का आकार एक प्रयोग के भीतर लगातार रखा जाना। सेल नंबर में परिवर्तन बारकोडिंग और एंटीबॉडी धुंधला की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं और मोटे तौर पर लगातार रखा जाना चाहिए भर में सीधे तुलना करने के लिए नमूने हैं।

इस तरह के मृत सेल लेबलिंग और डीएनए लेबलिंग के रूप में कुछ प्रक्रियाओं, नहीं तो सब प्रयोगात्मक डिजाइन, विशाल बहुमत में बाहर किया जाना चाहिए। केवल सतह मार्कर का विश्लेषण करने के प्रयोगों में मृत कोशिकाओं की लेबलिंग Rh103 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन Rh103 प्रयोगों जहां permeabilization के लिए आवश्यक है के रूप में यह धुंधला नुकसान में परिणाम के लिए बचा जाना चाहिए। permeabilization से जुड़े प्रयोगों के लिए, यह सिस्प्लैटिन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है

बारकोडिंग के नमूने, एंटीबॉडी की खपत को कम अधिग्रहण के समय में कमी और समाप्त कर सकते हैं नमूना करने के लिए नमूना परिवर्तनशीलता 9। बारकोडिंग की प्रक्रिया सभी कोशिकाओं है, जो अपनी उत्पत्ति के नमूने के प्रत्येक कक्ष आवंटित करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए एक अनूठा नमूना-विशिष्ट कोड लागू करना शामिल है। नमूने बारकोडिंग के बाद एंटीबॉडी धुंधला, एक प्रक्रिया है कि यह सुनिश्चित करता है सभी नमूनों समान रूप से दाग हैं करने से पहले जमा किया जा सकता है। प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने के लिए, यह बारकोड समझदारी है और किसी भी नमूने है कि सीधे एक दूसरे की तुलना में किया जाना है पूल। इस समय वहाँ विश्लेषण 5, 6, 7, जिनमें से दो यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं (देखें नीचे) cytometry जन के लिए नमूने बारकोडिंग के लिए कई तरीके मौजूद हैं।

वर्तमान में उपलब्ध reagen के साथयह 38 एंटीबॉडी लक्ष्य की बहुतायत मात्रा ठहराना एस चरण 10 में कोशिकाओं की पहचान, लाइव और मृत कोशिकाओं को अलग 8 और कई नमूनों की एक मल्टिप्लेक्स प्रयोग में हाइपोक्सिया 11 के सेलुलर स्तर को मापने के लिए संभव है टीएस। इस बड़े सेल आबादी के लिए उच्च पैरामीटर एकल कक्ष डेटा एकत्र करने की क्षमता बेहद विषम सेल आबादी के सुधार की रूपरेखा सक्षम बनाता है और पहले से ही उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि 12, 13, 14, 15, 16 के एक नंबर का उत्पादन किया गया। व्याख्या जानकारी के परिणामस्वरूप जटिल डेटा आसवन घनत्व सामान्यीकृत घटनाक्रम स्पैनिंग ट्री प्रगति (स्पेड) 17 और viSNE 18 सहित कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम के उपयोग की आवश्यकता है।

यह लेख एक सुलभ प्रस्तुत करता हैकैसे का अवलोकन डिजाइन और प्रयोग cytometry एक जन बाहर ले जाने और cytometry डेटा द्रव्यमान का बुनियादी विश्लेषण का परिचय करने के लिए।

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Protocol

1. सेल कटाई

  1. प्राथमिक ऊतक से कटाई कोशिकाओं
    नोट: प्रक्रिया प्राथमिक ऊतक से कटाई कोशिकाओं के लिए वर्णित विशेष रूप से माउस स्तन ट्यूमर के ऊतक के लिए लागू है और लागू न हो के रूप में अन्य स्रोतों से प्राथमिक ऊतकों को है।
    1. 5 मिलीग्राम hyaluronidase और ऊतक के प्रति ग्राम 10 एमएल DMEM / F12 मीडिया में 30 मिलीग्राम कोलैजिनेज़ भंग द्वारा पाचन बफर तैयार संसाधित करने के लिए। पाचन बफर नसबंदी फिल्टर।
    2. माउस और रिकॉर्ड ट्यूमर वजन से प्राथमिक स्तन ग्रंथि के ट्यूमर को अलग।
    3. कम से कम 5 मिनट के लिए # 10 स्केलपेल के साथ ऊतक कीमा।
    4. पाचन बफर (ऊतक के प्रति ग्राम 10 एमएल बफर) की उचित मात्रा को कीमा बनाया हुआ ऊतक जोड़ें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घंटे के लिए 100 rpm पर पाचन बफर में कीमा बनाया हुआ ऊतक हिलाएँ।
    6. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 0.4 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को पारित करके एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करें।
    7. 4 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं;सी। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    8. 4 एमएल DMEM / F12 में resuspend गोली और 5 एमएल दौर नीचे ट्यूब को हस्तांतरण।
  2. टिशू कल्चर से कटाई कोशिकाओं
    1. धो थाली या कमरे के तापमान पर कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पक्षपाती कोशिकाओं की कुप्पी।
      नोट: तकनीक कटाई कोशिकाओं के लिए वर्णित विशेष रूप से मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) कल्चर कोशिकाओं पक्षपाती लिए लागू है। हालांकि, वर्णित प्रोटोकॉल के शेष के मोटे तौर पर अन्य सुसंस्कृत सेल लाइनों, गैर पक्षपाती लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए लागू है।
    2. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ट्रिप्सिन या अन्य एंजाइमी पाचन अभिकर्मक पक्षपाती कोशिकाओं से एक एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
      नोट: ट्रिप्सिन और अन्य एंजाइमी पृथक्करण अभिकर्मकों संभावित सेलुलर मार्कर को प्रभावित किया है।
    3. 37 पर थाली सेतेसी ° 2-5 मिनट कोशिकाओं को अलग करने के लिए। उच्च confluency संस्कृतियों के लिए, धीरे थाली मदद करने के लिए कोशिकाओं को अलग करें टैप करें।
    4. एक 5 एमएल दौर नीचे ट्यूब में थाली से पूरी तरह से अलग कोशिकाओं स्थानांतरण और धीरे कोशिकाओं को अलग करने की एक 1 एमएल pipet का उपयोग pipet।
      नोट: नमूने सभी कदम वैकल्पिक रूप से एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे थाली में किया जा सकता की बड़ी संख्या के प्रसंस्करण के लिए। एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में नमूने के प्रसंस्करण के लिए सभी धोने 250 μL की मात्रा में प्रदर्शन किया जा सकता है। अन्य चरणों में वर्णित मात्रा समायोजित किया जा सकता तो कुल मात्रा 300 μL से अधिक नहीं है।
    5. एक समान मात्रा धोने बफर (0.5% बीएसए और पीबीएस में 0.02% सोडियम azide) के साथ एंजाइमी पाचन अभिकर्मक बुझाने।
      ध्यान दें: सोडियम azide एक खतरनाक रासायनिक है। उचित सुरक्षा सावधानियों इसकी तैयारी और हैंडलिंग के लिए मनाया जाना चाहिए।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    7. resuspend1 एमएल सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं।
    8. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन के 10 μL स्थानांतरित करके कोशिकाओं की गणना करें। trypan नीले और एक hemocytometer के हस्तांतरण या स्वचालित सेल गिनती प्रणाली में एक ज्ञात अनुपात करने के लिए विभाज्य पतला।
  3. एस चरण की आबादी का लेबल
    नोट: यदि एस चरण लेबलिंग नहीं प्रदर्शन किया जा रहा है 1.4 स्टेम लिए आगे बढ़ें।
    1. सीरम मुक्त DMEM F12 या अन्य उपयुक्त मीडिया में 10 माइक्रोन 5-iodo-2'-डिऑक्सीयूरिडीन के 1 एमएल (आईडीयू) तैयार करें प्रत्येक 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा रहा है।
    2. प्रत्येक 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं के लिए सीरम मुक्त मीडिया में 10 माइक्रोन को IDU के 500 μL जोड़ें।
      नोट: को IDU लेबलिंग सीरम युक्त मीडिया में प्रदर्शन किया जा सकता है, नि: शुल्क प्रोटीन, सिस्प्लैटिन साथ प्रतिक्रिया करेंगे मृत कोशिकाओं के समुचित लेबलिंग को रोकने। सीरम युक्त मीडिया लेबलिंग को IDU के दौरान प्रयोग किया जाता है एक अतिरिक्त धोने कदम सीरम मुक्त मीडिया सिसप्लैटिन लाइव / मृत स्टेशन से पहले सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए आवश्यक हैining।
    3. धीरे 1 एमएल pipet के साथ छर्रों resuspend।
    4. कोमल कमाल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. लाइव / मृत लेबलिंग
    1. प्रत्येक नमूने के लिए सीरम मुक्त DMEM-F12 या कोशिका प्रकार उपयुक्त मीडिया में 50 माइक्रोन सिसप्लैटिन के 500 μL तैयार करते हैं।
      नोट: यदि Idu से एस चरण आबादी की लेबलिंग नहीं है प्रदर्शन किया जा करने के लिए, 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर resuspend नमूने हैं। कोशिकाओं resuspending से पहले सिस्प्लैटिन जोड़ने वर्दी लाइव / मृत लेबलिंग के लिए समाधान के तेज मिश्रण सक्षम बनाता है।
    2. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति 50 माइक्रोन सिसप्लैटिन के 500 μL नमूने में जोड़े।
    3. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर सेते हैं।
    4. धोने बफर की एक समान मात्रा के साथ सिस्प्लैटिन बुझाने।
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    6. दो बार धो नमूने500 μL धोने बफर के साथ अतिरिक्त सिस्प्लैटिन दूर करने के लिए।
    7. दो बार 500 μL पीबीएस के साथ धो नमूने अतिरिक्त प्रोटीन को हटाने के लिए।
  5. नमूना निर्धारण
    1. 500 μL पीबीएस में resuspend नमूना।
    2. 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में 4% पीएफए ​​के बराबर मात्रा जोड़ें; पिपेट मिश्रण।
      नोट:, पाउडर से 4% पीएफए ​​ताजा तैयार 6.9 पीएच समायोजित करने और एक 0.44 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं। पीबीएस में 4% पीएफए ​​अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। , पूर्व बनाया formalin ampules में आपूर्ति, जब तक कि विशेष परीक्षण किया बचें क्योंकि यह अक्सर धातु दूषित पदार्थों को जो मापा जन चैनलों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल हैं। पीएफए ​​के निचले एकाग्रता के लिए पर्याप्त होना और एंटीबॉडी बाध्यकारी पर निर्धारण के प्रभाव को कम करने में मदद लेकिन अनुभव परीक्षण किया जाना चाहिए सकता है।
    3. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से सतह पर तैरनेवाला वाई aspiratethout गोली परेशान।
    5. पीबीएस के साथ धो नमूने पीएफए ​​समाधान निकालने के लिए।
      नोट: इस चरण में नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर संक्षेप में संग्रहित किया जा सकता। 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक भंडारण नमूना की गिरावट में परिणाम और धुंधला की कमी हुई हो सकती है।

2. बारकोडिंग

नोट: monoisotopic सिस्प्लैटिन बारकोडिंग और पैलेडियम बारकोडिंग के उपयोग के लिए कार्यप्रणाली एक साथ प्रस्तुत किया जाता है, वहीं या तो स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है या पूरी तरह से बचा यदि प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं।

  1. Monoisotopic Cisplatin बारकोडिंग
    नोट: के बाद से सिस्प्लैटिन बारकोडिंग और सिस्प्लैटिन लाइव / मृत धुंधला चैनलों देखभाल ओवरलैपिंग पर भरोसा जीवित कोशिकाओं में है कि पृष्ठभूमि सिस्प्लैटिन लाइव / मृत धुंधला सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए इस के रूप में कम से कम है सिस्प्लैटिन बारकोड की सटीकता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    1. पीबीएस में 200 सुक्ष्ममापी 1 मिमी monoisotopic सिस्प्लैटिन शेयर समाधान पतला।
    2. ई के लिएACH अद्वितीय सिस्प्लैटिन बारकोड प्राप्त कि बारकोड प्रत्येक 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं के लिए 500 μl पीबीएस के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करते हैं।
    3. तैयार करने के लिए प्रत्येक अद्वितीय बारकोड 200 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक लागू monoisotopic सिस्प्लैटिन जोड़ें।
    4. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति पीबीएस के 500 μl में Resuspend कोशिकाओं।
    5. प्रत्येक नमूने के लिए इसी बारकोड समाधान की एक समान मात्रा में जोड़ें।
    6. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर 5 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं।
    7. धोने बफर की एक समान मात्रा के साथ सिस्प्लैटिन बुझाने।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    9. दो बार 500 μL धोने बफर के साथ धो नमूने अतिरिक्त सिस्प्लैटिन दूर करने के लिए।
  2. पैलेडियम बारकोडिंग
    नोट: पैलेडियम बारकोडिंग अभिकर्मकों या तो 5 से तैयार या व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है।
    1. क्षणिक आंशिकpermeabilization 19
      ध्यान दें: अभिकर्मकों कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए और मजबूती के साथ सेल लेबल के लिए पैलेडियम केलेशन बारकोडिंग आंशिक permeabilization की आवश्यकता है।
      1. 500 μL पीबीएस के साथ धो नमूने हैं।
      2. 500 μL पीबीएस प्लस 0.02% सैपोनिन के साथ धो नमूने हैं।
      3. अवशिष्ट मात्रा में resuspend गोली।
    2. पैलेडियम बारकोडिंग लागू करें।
      1. 1 एमएल बहुत ठंडा पीबीएस प्लस 0.02% सैपोनिन में पैलेडियम बारकोडिंग अभिकर्मक के 100x शेयर पतला।
      2. तेजी से resuspended नमूना पतला बारकोडिंग अभिकर्मक जोड़ें।
      3. लगातार मिश्रण के साथ पर एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      4. धो नमूने 500 μL के साथ दो बार बफर धोने।

3. सेल सतह धुंधला

नोट: सेल सतह धुंधला निर्धारण करने से पहले जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता। इस एंटीबॉडी कि उनके व्यापार के लिए आत्मीयता खो के लिए आवश्यक हो सकता हैनिर्धारण के बाद आर एपीटोप। कुछ सेल के नमूने ऐसे ल्यूकोसाइट्स के लिए एफसी अवरुद्ध, एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले पृष्ठभूमि को कम करने के रूप में, अतिरिक्त अवरुद्ध से लाभ हो सकता। इष्टतम अवरुद्ध अनुभव विशिष्ट नमूना प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

  1. कोशिका की सतह एंटीबॉडी धुंधला पैनल तैयार करें।
    1. एक 1.5 एमएल ट्यूब में 0.5 μL, या अनुभव निर्धारित मात्रा, नमूना प्रति प्रत्येक 0.5 मिलीग्राम / एमएल कोशिका की सतह एंटीबॉडी की संयुक्त करें। यदि आवश्यक हो नमूना प्रति 10 μL करने के लिए मात्रा को लाने के लिए कपड़े धोने बफर जोड़ें। pipetting द्वारा मिक्स।
      ध्यान दें: प्रत्येक एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोग द्वारा अनुभव प्रयोग करने के लिए पूर्व के लिए काम कमजोर पड़ने का निर्धारण।
    2. समान रूप से प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में विभाजित कोशिका की सतह एंटीबॉडी पूल दाग किया जाना है।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में धोने बफर के 500 μl तैयार करें।
  2. सभी नमूनों के लिए सामान्यीकृत मात्रा में नमूने के लिए कोशिका की सतह धुंधला लागू करें।
    नोट: ENS करने के लिएकई नमूने भर में ure संगत एंटीबॉडी लेबलिंग इसे ध्यान से नमूना मात्रा और एंटीबॉडी एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। निम्न चरणों का पालन सुनिश्चित करना है कि अंतिम नमूना संस्करणों के बाद एंटीबॉडी जोड़ दिया गया है समान होती हैं, के द्वारा इस स्थिरता प्राप्त करने के लिए करना है।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    2. 50 μL करने के लिए एक 200 μL पिपेट सेट के साथ, aliquoted कोशिका की सतह एंटीबॉडी पूल के एक ट्यूब के लिए नमूना गोली और हस्तांतरण से शेष समाधान निकालें।
    3. विंदुक टिप में हवा ड्राइंग के बिना विभाज्य ट्यूब में सभी तरल विंदुक।
    4. पिपेट सवार पकड़े ड्राइंग से बचने के लिए एक ओर जहां हवा 500 μL के एक तैयार ट्यूब में टिप के लिए कदम धो बफर और सवार को छोड़ दें।
    5. नमूना विंदुक टिप की सामग्री को वापस जोड़ें और कोमल pipetting के साथ तरल में नमूना फिर से निलंबित।
    6. 1 के लिए नमूने सेतेलगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर एच।
    7. दो बार 500 μL धोने बफर के साथ धो नमूने लिए सुनिश्चित करें कि सभी नि: शुल्क एंटीबॉडी दूर धोया जाता है।
    8. 500 μL पीबीएस के साथ धो नमूने हैं।
    9. 500 μl पीबीएस में सेल गोली Resuspend।
    10. पीबीएस में 4% पीएफए ​​के बराबर मात्रा जोड़ें; पिपेट मिश्रण।
    11. एक कक्षीय शेकर पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।

4. सेल Permeabilization और intracellular धुंधला

  1. सेल permeabilization
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    2. धीरे vortexing जब तक गोली अलग है द्वारा अवशिष्ट मात्रा में कोशिकाओं Resuspend।
      नोट: जोड़ने MeOH साथ पालन कोशिकाओं में परिणाम होगा और एक पतली फिल्म है जो आंशिक नमूना नुकसान होगा उत्पादन करने से पहले कोशिकाओं को अलग करने की विफलता।
    3. इसके तत्काल बाद 1 प्रति 2 एक्स 10 6 100% MeOH के एमएल जोड़ने </ Sup> कोशिकाओं और धीरे मिश्रण करने पिपेट।
      नोट: अन्य permeabilization तरीकों MeOH के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है और कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए इष्टतम permeabilization प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। कुछ सेल स्रोतों के लिए एक 0.1% ट्राइटन X-100, permeabilization के लिए पीबीएस समाधान में 0.2% बीच 20 या 0.1% सैपोनिन बेहतर सेल अखंडता को बनाए रखने कर सकते हैं, जबकि अभी भी लगातार permeabilization प्रदान करते हैं।
    4. नमूने permeabilization के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे की एक अधिकतम करने में कम से कम 1 घंटे के लिए या ऊपर सेते हैं।
      नोट: इस चरण MeOH में नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर अप महीने के 1 के लिए भंडारित किया जा सकता पर।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    6. धोने बफर के 1 एमएल प्रत्येक मिलीलीटर MeOH नमूना permeabilize करने के लिए इस्तेमाल करें। धीरे सेल गोली resuspend।
    7. नमूना दो बार धोएं 500 μL के साथ बफर धोने।
  2. Intracellular एंटीबॉडी धुंधला पैनल तैयार करें।
    1. एक 1.5 एमएल ट्यूब में 0.5 μL, या अनुभव निर्धारित मात्रा, नमूना प्रति प्रत्येक 0.5 मिलीग्राम / एमएल intracellular एंटीबॉडी के संयुक्त करें। यदि आवश्यक हो नमूना प्रति 10 μL करने के लिए मात्रा को लाने के लिए कपड़े धोने बफर जोड़ें। pipetting द्वारा मिक्स।
    2. समान रूप से प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में intracellular एंटीबॉडी पूल विभाजित करें।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में धोने बफर के 500 μL तैयार करें।
  3. सभी नमूनों के लिए सामान्यीकृत मात्रा में नमूने के लिए intracellular धुंधला लागू करें।
    नोट: कई नमूने भर में लगातार एंटीबॉडी लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए इसे ध्यान से नमूना मात्रा और एंटीबॉडी एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    2. 200 μL पिपेट 50 μL करने के लिए सेट के साथ aliquoted कोशिका की सतह एंटीबॉडी पूल के एक ट्यूब के लिए नमूना गोली और हस्तांतरण से समाधान शेष को हटा दें।
    3. विंदुकसभी विभाज्य ट्यूब में तरल विंदुक टिप में हवा ड्राइंग के बिना।
    4. पिपेट सवार पकड़े ड्राइंग से बचने के लिए एक ओर जहां हवा 500 μL के एक तैयार ट्यूब में टिप के लिए कदम धो बफर और सवार जारी, 50 μL की कुल नमूना मात्रा के लिए धोने बफर ड्राइंग।
    5. नमूना विंदुक टिप की सामग्री को वापस जोड़ें और कोमल pipetting के साथ तरल में नमूना फिर से निलंबित।
    6. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 1 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
    7. धो नमूने 500 μL के साथ दो बार बफर धोने।
    8. 500 μL पीबीएस के साथ धो नमूने हैं।

5. इरिडियम लेबलिंग

  1. फिक्स नमूने
    1. पीबीएस के 500 μL में Resuspend नमूने हैं।
    2. 4% पीएफए ​​के 500 μL पीबीएस में जोड़ें।
    3. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं।
  2. डीएनए के इरिडियम लेबलिंग लागू करें
    1. नमूने के लिए 500 μL 62.5 एनएम इरिडियम पीएफए ​​समाधान जोड़ें।
      नोट: 2,000 overstaining से बचने के लिए: permeabilized कोशिकाओं का उपयोग कर प्रयोगों के लिए, 1 की एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए 500x Ir191 / 193 शेयर पतला।
    2. लगातार मिश्रण के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: monoisotopic सिस्प्लैटिन बारकोडिंग प्रदर्शन से अधिक समय के 15 मिनट के लिए इरिडियम साथ नमूने सेते नहीं है, तो के बाद से मजबूत Ir193 संकेतों Pt194 बड़े पैमाने पर चैनल के लिए योगदान कर सकते हैं और नकारात्मक बारकोडिंग गुणवत्ता को प्रभावित।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    4. दो बार फ़िल्टर्ड विआयनीकृत जल में 500 μL 0.1% बीएसए के साथ धो नमूने हैं।
      नोट: एक बार तैयार हम यदि संभव हो तो 24 घंटे के भीतर नमूने को चलाने का सुझाव। तैयार नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पावधि संग्रहित किया जा सकता है,लेकिन देखभाल गिरावट से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। अंतिम धोने बीएसए के बिना फ़िल्टर्ड विआयनीकृत जल में किया जाना चाहिए यदि संभव हो तो के रूप में इस मशीन जो साधन सफाई में कमी होगी की स्प्रे चैम्बर और नमूना शंकु पर बयान को कम करेगा। hESCs के लिए यह जबकि सहित बीएसए ट्यूब सतह के लिए चिपके से नमूना नुकसान से बचने के लिए इन धोने प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है।

6. अधिग्रहण के लिए नमूने तैयार

  1. कोशिकाओं गणना
    1. फ़िल्टर किया विआयनीकृत जल में 500 μL 0.1% बीएसए में Resuspend कोशिकाओं और एक 35 माइक्रोन सेल झरनी टोपी के माध्यम से एक ताजा ट्यूब में फ़िल्टर करें।
      नोट: अंतिम धोने के लिए बीएसए स्तर कम अवशेषों जन cytometry कणित्र पर छोड़ दिया घट जाती है। गैर पक्षपाती कोशिकाओं धोया और फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी में resuspended जा सकता है।
    2. एक microcentrifuge ट्यूब सेल निलंबन के 10 μL स्थानांतरित करके कोशिकाओं की गणना करें। में एक ज्ञात अनुपात करने के लिए विभाज्य पतलाtrypan नीले (सेल दृश्य के साथ सहायता करने के लिए) और एक hemocytometer या स्वचालित सेल गिनती सिस्टम में स्थानांतरित।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। छानना या ध्यान से गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  2. तैयार करें और लोड के नमूने
    1. तैयार करने के लिए अंशांकन मोती रेफ्रिजरेटर से हटा दें और सख्ती से हिला resuspend।
    2. यदि autosampler cytometry एक जन का उपयोग कर नमूने चल रहा है, नमूना थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए अंशांकन मोती के 50 μL जोड़ने तो कोशिकाओं की वांछित संख्या को जोड़ने का विश्लेषण किया जाए। अगर मैनुअल इंजेक्शन द्वारा नमूने चल नमूने के लिए अंशांकन मोती के 50 μL जोड़ने के लिए, फ़िल्टर, विआयनीकृत जल में नमूना पतला मिश्रण अच्छी तरह से और जन cytometry नमूना इंजेक्शन पोर्ट में लोड नमूना। उचित नमूना कमजोर पड़ने सेल प्रकार के आधार पर विश्लेषण किया जा रहा भिन्न हो सकते हैं, लेकिन 10 6 के एक कमजोर पड़ने आम तौर पर उचित 1 है।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मोटे तौर पर केवल मामूली संशोधनों के साथ सुसंस्कृत और प्राथमिक सेल के नमूने की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है। प्रयोग की आवश्यकताओं के आधार पर, एक मॉड्यूलर ढंग से किया जा सकता है जब इस तरह के बारकोडिंग या कोशिका की सतह धुंधला के रूप में कुछ तत्वों, आवश्यक नहीं हैं। अपनी संपूर्णता में उपयोग किया इस प्रोटोकॉल मृत सेल बहिष्कार, एस चरण आबादी की पहचान के लिए लेबल और अप करने के लिए 38 एंटीबॉडी लक्ष्यों की मात्रा के लिए दाग नमूने cytometry मल्टिप्लेक्स बड़े पैमाने पर की तैयारी सक्षम बनाता है।

तरीकों इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2) में उल्लिखित द्वारा उत्पादित अपेक्षित परिणाम 3 चित्र में चित्रित कर रहे हैं। डेटा के संग्रह पर, अंशांकन मनका तीव्रता के आधार पर संकेत तीव्रता को सामान्य जन cytometry सॉफ्टवेयर के भीतर किया जा सकता है। सामान्य के बाद, प्रारंभिक डेटा प्रक्रियाएकल कोशिकाओं पर अंशांकन मोती, गेट को हटाने और मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए किसी भी सॉफ्टवेयर ssing प्रवाह cytometry डेटा का विश्लेषण करने में सक्षम का उपयोग करते हुए मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। अंशांकन मोतियों को हटाया Ir191 + Ce140- आबादी (चित्रा 3A) पर या एक MATLAB आधारित एल्गोरिथ्म 20 के साथ gating द्वारा मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। एकल सेल घटनाओं (काला रूपरेखा, चित्रा 3 बी), जबकि, मलबे और सेल multiplets को हटाने Ir193 और घटना की लंबाई (चित्रा 3 बी) के द्विअक्षीय भूखंड पर gating के द्वारा प्रतिबंधित किया जा सकता है। मृत कोशिकाओं से Cisplatin लेबलिंग कोशिका मृत्यु की राशि यों के लिए उपयोग किया जा सकता है; पता चला कम (चित्रा 3 डी) और उच्च (चित्रा 3E) मृत कोशिकाओं की मात्रा के साथ नमूने के उदाहरण हैं। मृत कोशिकाओं Pt198 + आबादी (चित्रा 3E) बंद gating के द्वारा डेटा से हटाया जा सकता। नमूनों की बारकोडिंग, monoisotopic सिस्प्लैटिन या पैलेडियम अभिकर्मकों, सा के विशिष्ट जुदाई में परिणाम के साथ कि क्याबारकोडिंग मानकों (चित्रा -3 सी) है, जो कोशिकाओं की अनुमति दिए जाने mples उनके मूल नमूना पहचान करने के लिए आवंटित किया जाना है। ऐसे को IDU लेबलिंग के रूप में अतिरिक्त वैकल्पिक तरीकों, विशिष्ट आबादी, जैसे का पता लगाने की अनुमति, एस चरण कोशिकाओं (चित्रा 3F)। प्रारंभिक सामान्य, debarcoding और gating के बाद, उच्च आयामी डेटा और SPADE ने 17 सहित एल्गोरिदम कई अन्य डेटा विश्लेषण और दृश्य 18 cytometry जन के लिए बनाया गया है की एक किस्म का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता। इस तरह के SPADE के रूप में एल्गोरिदम उच्च आयामी डेटा है, जो व्याख्या करने के लिए है, क्योंकि यह सीधे अपने उच्च आयामी राज्य में कल्पना नहीं की जा सकती मुश्किल हो सकता है ले, और डेटा के एक कम आयामी प्रतिनिधित्व, जो दृश्य व्याख्या (चित्रा 3 जी) के लिए और अधिक उत्तरदायी है उत्पन्न करते हैं।

आकृति 1 चित्र 1: माप cytometry जन के मूल सिद्धांतों। cytometry विश्लेषण जन के लिए सेल के नमूने की तैयारी तत्वों के lanthanide श्रृंखला से धातु आइसोटोप ज्यादातर के साथ लेबल एंटीबॉडी के साथ धुंधला कोशिकाओं शामिल है। इस योजना में प्रत्येक एंटीबॉडी एक विशिष्ट एपीटोप के खिलाफ उठाए गए एक आइसोटोप एपीटोपों कि सतह, cytoplasmic, परमाणु या क्रोमेटिन स्थानीय संभावित किया जा सकता है के खिलाफ इस तरह के सैमरियम 154. एंटीबॉडी रूप में एक अद्वितीय परमाणु भार, रखने के साथ लेबल है। लेबल लगाए गए कोशिकाओं इंजेक्शन और एकल कक्ष बूंदों जहां वे एक आर्गन प्लाज्मा मशाल द्वारा आयनित कर रहे हैं के रूप में कणित्र cytometry जन के माध्यम से छिड़काव किया जाता है। परिणामी कण बादल एक quadrupole मास फिल्टर द्वारा कम द्रव्यमान परमाणुओं की छीन लिया जबकि बड़ी परमाणु भार आयनों की बहुतायत डिटेक्टर से मापा जाता है है। प्रत्येक अद्वितीय बड़े पैमाने पर आयन की मापा मात्रा उसके संबंधित एंटीबॉडी के लक्ष्य एपीटोप के सेलुलर बहुतायत से मेल खाती है। जबकि एक सैद्धांतिक एल100 से अधिक मापदंडों का imit इस पद्धति का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों सेल प्रति 40 से अधिक मापदंडों का पता लगाने की अनुमति है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: प्रयोगात्मक प्रक्रिया और वैकल्पिक कदम के कार्यप्रवाह आरेख। प्रमुख प्रोटोकॉल जन cytometry के लिए कोशिकाओं की तैयारी में शामिल चरणों का चित्रण। वैकल्पिक चरणों नारंगी बक्से से दर्शाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन: मीटर गधा cytometry विश्लेषण से उत्पन्न डेटा का उदाहरण। (ए) Biaxial कोशिकाओं (उच्च Ir191, कम Ce140), मोती की जुदाई (कम Ir191, उच्च Ce140) और मनका सेल दोहरी (उच्च Ir191, उच्च Ce140) दिखा साजिश। (बी) Biaxial साजिश बनाम घटना लंबाई Ir193 की उम्मीद उपस्थिति दिखा। एकल कक्षों की गेटिंग जो सेलुलर मलबे और सेल multiplets को हटा दिखाया गया है। (सी) Biaxial साजिश सिस्प्लैटिन बारकोडिंग से दो बड़े पैमाने पर चैनलों के उदाहरण देखने को दर्शाता है। (डी - ई) एक कम प्रतिशत (डी) और मृत कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत (ई) के साथ नमूनों के लिए सिस्प्लैटिन लाइव / मृत धुंधला से उदाहरण डेटा। (एफ) एस चरण में कोशिकाओं को अलग करने के को IDU के साथ लेबल H9 hESC कोशिकाओं के Biaxial साजिश और Cyclin बी 1 के खिलाफ एक एंटीबॉडी आगे कोशिका चक्र भेद करने के लिए। (जी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विभिन्न सुसंस्कृत सेल लाइनों (एच 1 और H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) और प्राथमिक ऊतक के नमूने (माउस अस्थि मज्जा, माउस भ्रूण जिगर, माउस वयस्क के प्रसंस्करण के लिए नियोजित किया गया है जिगर, माउस ट्यूमर)। चाहे स्रोत, किसी भी ऊतक है कि एकल कक्षों में अलग हो सकता है, जबकि सेलुलर राज्य संरक्षण cytometry जन द्वारा विश्लेषण के लिए उत्तरदायी होना चाहिए, लेकिन कुछ प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यह ध्यान रखें कि कुछ एपीटोपों उपयोग किया विशिष्ट पृथक्करण, निर्धारण और permeabilization उपचार से प्रभावित हो सकता है और इन तरीकों नमूना-विशिष्ट अनुकूलन गुजरना करने के लिए आवश्यकता हो सकती है महत्वपूर्ण है। कम संकेत एक एंटीबॉडी के लिए मनाया जाता है अगर यह, जीवित कोशिकाओं पर कोशिका की सतह लेबलिंग प्रदर्शन permeabilization तरीकों को बदलने, या निर्धारण समय को कम करके सुधार करने के लिए संभव हो सकता है।

जब संभव हो प्रयोगात्मक डिजाइन के भीतर वें में बारकोडिंग सहित,ई नमूना प्रसंस्करण कार्यप्रवाह सेल और एंटीबॉडी एकाग्रता के स्तर पर नमूने के बीच सामंजस्य सुनिश्चित करता है। बारकोडिंग के बिना, यहाँ तक कि जब बड़ी सावधानी नमूना प्रसंस्करण नियंत्रित करने के लिए लिया जाता है, यह संभावना है कि एंटीबॉडी एकाग्रता और सेल एकाग्रता में मामूली बदलाव के नमूने के बीच पेश किया जाएगा है। इसके अलावा, विशिष्ट एपीटोपों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत नमूनों के बीच होने की संभावना के रूप में अलग अलग होंगे, प्रभावी एंटीबॉडी करने वाली एपीटोप अनुपात जरूरी नमूने बीच भिन्न हो सकती है, भले ही कुल एंटीबॉडी एकाग्रता लगातार रखा जाता है, संभवतः एंटीबॉडी धुंधला में विसंगतियों के लिए अग्रणी। इन बदलावों, जबकि आम तौर पर नाबालिग जब एक चैनल को देख, बहुत जब एक उच्च पैरामीटर प्रयोग का प्रदर्शन करने और अगर ध्यान डेटा विश्लेषण के दौरान नहीं लिया जाता है जैविक रूप से सार्थक रूप में गलत समझ लिया जाएगा जटिल हो सकती है।

प्रयोग cytometry एक जन से उत्पन्न आंकड़ों का विश्लेषण कई रूपों, और computa के एक नंबर ले जा सकते हैंराष्ट्रीय दृष्टिकोण इस आवेदन के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया है। जन के लिए उपयोगी एल्गोरिदम की एक विस्तृत सर्वेक्षण प्रदान करते हुए डेटा cytometry विश्लेषण इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है, दृष्टिकोण उसके द्वारा सफलतापूर्वक उपयोग किया गया हाइलाइट किया जाता है और रुचि पाठकों इस विषय 21, 22, 23 को कवर कई संसाधनों के लिए निर्देशित कर रहे हैं। सबसे व्यापक रूप से कार्यरत, cytometry डेटा जन के विश्लेषण के लिए वर्तमान में उपलब्ध तरीकों में से दो घनत्व का पेड़ प्रगति फैले रहे घटनाक्रम (स्पेड) और viSNE सामान्य बनाते हैं। SPADE समान मार्कर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के समूहों से समूहों का निर्माण करती है और एक नोड के रूप में प्रत्येक क्लस्टर प्रतिनिधित्व करता है। इन नोड्स कुदाल पेड़ जहां समान नोड्स एक लाइन (चित्रा 3 जी) से जुड़े हुए हैं में व्यवस्थित कर रहे हैं। viSNE टी वितरित स्टोकेस्टिक एम्बेड एल्गोरिथ्म 24 के एक दो आयामी प्रतिनिधित्व उत्पन्न करने के लिए पड़ोसी का इस्तेमाल करता हैउच्च आयाम डेटा जबकि समग्र डेटा संरचना संरक्षण। दोनों SPADE और viSNE MATLAB में लिखा जाता है, स्रोत कोड स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है और MATLAB के साथ उपयोगकर्ताओं द्वारा चलाए जा सकता है। साथ ही, SPADE की एक स्टैंडअलोन संस्करण उपलब्ध है।

जबकि बड़े पैमाने पर cytometry वर्तमान मापदंडों की सबसे बड़ी संख्या के संग्रह की अनुमति देता है, फ्लोरोसेंट टैग आधारित cytometry कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक बेहतर तरीका हो सकता है। प्रतिदीप्ति फ्लो, ऊपर 5 x 10 4 जन के लिए 500-1,000 cytometry की तुलना करने के लिए प्रति सेकंड अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण कर सकते हैं, और अधिक उपलब्ध का सत्यापन कर लिया एंटीबॉडी 25। इस तरह के hyperspectral cytometry 26 और नए fluorophores सभी के लिए एक व्यवहार्य विकल्प cytometry 27 मेक प्रतिदीप्ति प्रवाह लेकिन बहुत अधिक पैरामीटर प्रयोगों के रूप में प्रतिदीप्ति प्रवाह में अतिरिक्त प्रगति, cytometry। इस तरह के पहले शाही सेना 28 की माप ही संभव के रूप में अतिरिक्त तकनीकप्रतिदीप्ति आधारित प्रवाह cytometry से हाल ही में प्रोटीन और आरएनए 29 के एक साथ पता लगाने की अनुमति cytometry बड़े पैमाने पर करने के लिए अनुकूलित किया गया है। उपलब्ध आइसोटोप और अभिकर्मकों की भावी विस्तार अधिक पूरी तरह से औसत दर्जे का आइसोटोप की बड़े पैमाने पर खिड़की का उपयोग और औसत दर्जे का सेलुलर विशेषताओं के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार cytometry जन के द्वारा ही संभव रूपरेखा की गहराई का विस्तार होगा करने के लिए।

मापदंडों कि बड़े पैमाने पर cytometry द्वारा एक साथ विश्लेषण किया जा सकता की बड़ी संख्या बहुत प्रयोगात्मक सवाल है कि जांच की जा सकती है, फैलता है। हमें उम्मीद है कि इस लेख और साथ वीडियो प्रोटोकॉल अधिक प्रभावी ढंग से बड़े पैमाने पर cytometry का उपयोग करने के अपने अनुसंधान को आगे बढ़ाने के इच्छुक शोधकर्ताओं सक्षम हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

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References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

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