Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (122), e54394, doi:10.3791/54394 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mass cytometri benytter antistoffer konjugeret med tungmetal etiketter, en tilgang, der i høj grad har øget antallet af parametre og muligheder for dyb analyse langt ud over hvad der er muligt med konventionelle fluorescens-baserede flowcytometri. Som med enhver ny teknologi, der er kritiske trin, der hjælper sikre en pålidelig generation af data af høj kvalitet. Præsenteres her, er en optimeret protokol, der inkorporerer flere teknikker til forarbejdning af celleprøver til masse-cytometri-analyse. De her beskrevne metoder vil hjælpe brugeren undgå almindelige faldgruber og opnå ensartede resultater ved at minimere variabilitet, hvilket kan føre til ukorrekte oplysninger. At informere forsøgsdesign, er rationalet bag valgfrie eller alternative trin i protokollen og deres effektivitet i at afdække nye resultater i biologi af systemet blive undersøgt dækket. Endelig er repræsentativ data for at illustrere forventede resultater fra teknikker presented her.

Introduction

Cytometri muliggør samtidig måling af flere antistofmål på en enkelt celle niveau i store populationer af celler. I traditionel fluorescens-baserede flowcytometri, er antallet af parametre, som kan kvantificeres begrænset af spektral overlapning mellem emissionsspektret af flere fluoroforer, som kræver mere komplekse kompensationsberegninger som antallet af parametre stiger. Disse begrænsninger er rettet efter masse cytometri, når der konstateres tungmetalfrie konjugerede antistoffer og kvantificeres ved flyvetid (TOF) massespektrometri i høj grad at udvide antallet af parametre, der er indsamlet samtidigt og give en høj dimensionel protein-overflod profil for hver individuel celle.

En grundlæggende forståelse af arbejdet i massen cytometri instrument er til gavn for brugeren og kan være afgørende for fejlfinding. For en mere grundig beskrivelse af tuning og kører en masse cytometri maskine,under det relaterede manuskript 1. Kort beskrevet en celleprøve mærket med et panel af metal konjugerede antistoffer rettet celleoverflademarkører, cytoplasmatiske proteiner, kerneproteiner, kromatin-bundne proteiner eller andre epitoper af interesse (Figur 1i). De mærkede celler fyldt på maskinen, enten en ad gangen ved manuel injektion eller ved hjælp af en autosampler at prøver fra en 96-brønds plade. De fyldte celler injiceres gennem en forstøver, som frembringer en spray af små væskedråber, der indkapsler cellerne (Figur 1ii). Denne spray er anbragt således, at cellerne ioniseres af en argon plasmabrænderen. Denne ionisering frembringer en partikel sky består af alle de indgående atomer i hver celle (figur 1iii). Da denne partikel sky bevæger til detektoren, er lave atommasse- atomer adskilt fra de høje masse ioner ved en kvadrupol filter. De resterende høje masse ioner fortsætter til detektoren, hvor abundstemmelse af hver isotop kvantificeres (fig 1iv). De rå data indsamlet af detektoren, analyseres ved massen cytometri instrument software til at identificere celle begivenheder. For hver identificeret celle omstændigheder er detekteret i hver kanal signal kvantificeres og gemmes til en udgang .fcs fil. Massen kanaler, der anvendes til detektering af de tungmetal konjugerede antistoffer udviser minimal spektral overlapning, der spænder fra 0-4% med de fleste bidrag under 1%. På grund af denne lave krydstale mellem kanalerne, er det generelt unødvendigt at transformere dataene med en kompensation matrix før analyse 2. Imidlertid bør man være omhyggelig under udformningen af ​​den eksperimentelle panel af antistoffer for at sikre, at et antistof med en høj forekomst epitop ikke er tildelt en masse kanal, der bidrager signal til en kanal tildelt til en lav overflod antistof, da dette kan skabe et kunstigt højt befolkning i kanalen modtager signalet bidrag.

3, 4. Udførelse celleoverfladen antistoffarvning på levende celler kan være nødvendigt for nogle antistoffer, men dette udelukker muligheden for barcoding før antistofmærkning som de fleste Stregkodeprodukter metoder udføres efter fiksering 5 selvom antistofbaseret stregkoder 6, 7 er en undtagelse.

Ved bestemmelse af antallet af celler, der skal fremstilles til analyse, er det vigtigt at vide, at vil blive opdaget kun en brøkdel af cellerne læsset på maskinen og producerer data. Dette tab skyldes primært ineffektivitet når forstøveren sprøjter prøven ved brænderen. Den nøjagtige procent tab afhænger af massen cytometri setup maskine og celletype, men kan variere fra 50-85% og bør væreovervejes ved udformningen af ​​forsøget. Denne protokol er blevet optimeret til 2x10 6 celler per prøve, men kan tilpasses til forarbejdning mindre eller større prøvestørrelser. Denne protokol kan anvendes med minimale modifikationer til prøvestørrelser fra 1 x 10 6 til 4 x 10 6, men det er kritisk, at prøvens størrelse holdes konsistente inden et eksperiment. Ændringer i celleantal kan påvirke intensiteten af ​​stregkoder og antistoffarvning og bør holdes nogenlunde konsistent mellem prøver, der skal sammenlignes direkte.

Nogle procedurer, såsom døde celle mærkning og DNA-mærkning, skal udføres i langt de fleste, hvis ikke alle eksperimentelle design. Mærkningen af ​​døde celler i eksperimenter analyse kun overflademarkører kan opnås ved anvendelse Rh103, men Rh103 bør undgås i eksperimenter, hvor permeabilisering er påkrævet da det resulterer i farvning tab. For eksperimenter, der involverer permeabilisering, er det tilrådeligt at udnytte cisplatin

Stregkodning prøver kan reducere antistof forbrug, mindske erhvervelse tid og fjerne prøve-til-prøve variabilitet 9. Processen med barcoding involverer påføring af en unik prøve-specifik kode til alle celler, som anvendes til at tildele hver celle til sin prøve af oprindelse. Efter stregkodning prøverne kan samles forud for antistoffarvning, en proces, der sikrer alle prøver er plettet ligeligt. For at minimere eksperimentelle fejl, er det klogt at stregkode og samle eventuelle prøver, der skal direkte i forhold til hinanden. Øjeblikket findes der flere metoder til stregkodning prøver til massen cytometrianalyse 5, 6, 7, hvoraf to er vist her (se nedenfor).

Med i øjeblikket tilgængelig reagents er det muligt at kvantificere den overflod af 38 antistofmål, identificere celler i S-fase 10, skelne levende og døde celler 8 og måle cellulære niveauer af hypoxi 11 i en multiplekset eksperiment af multiple prøver. Denne evne til at indsamle høj parameter enkelt celle data for store cellepopulationer giver bedre profilering af meget heterogene cellepopulationer og har allerede givet en række hidtil ukendte biologiske indsigter 12, 13, 14, 15, 16. Destillation af den resulterende kompleks data til fortolkelige oplysninger har krævet anvendelse af beregningsmæssige algoritmer herunder Spanning Tree Progression af Density Normaliseret Events (SPADE) 17 og visne 18.

Denne artikel præsenterer en tilgængeligoverblik over, hvordan man designer og gennemfører en masse cytometri eksperiment og introducerer grundlæggende analyse af masse-cytometri data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celle Høst

  1. Høst celler fra primært væv
    BEMÆRK: Den for høst af celler fra primært væv proces er specielt anvendelig til muse brysttumorvæv og kan ikke være anvendelige som er til primære væv fra andre kilder.
    1. Forberede digestionspuffer ved at opløse 5 mg hyaluronidase og 30 mg collagenase i 10 ml DMEM / F12-medium per gram væv, der skal behandles. Filter sterilisere digestionspuffer.
    2. Isoler primær mælkekirtel tumor fra mus og optage tumorvægt.
    3. Hakkekød væv med # 10 skalpel i mindst 5 min.
    4. Tilføj hakket væv til passende volumen af ​​spaltningsbuffer (10 ml buffer per gram væv).
    5. Ryst hakket væv i spaltningsbuffer ved 100 rpm i 1-3 timer ved 37 ° C.
    6. Opnå enkelt cellesuspension ved at passere cellerne gennem 0,4 um filter i et 50 ml rør.
    7. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 10 minutter ved 4 °; C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    8. Resuspender pellet i 4 ml DMEM / F12 og overførsel til 5 ml rundbundet rør.
  2. Høst celler fra vævskultur
    1. Vask plade eller kolbe af adhærente celler med calcium- og magnesiumfri phosphatpufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Den for høst af celler teknik er specielt anvendelig til klæbrig human embryonisk stamcelle (hESC) kulturceller. Imidlertid kan resten af ​​den beskrevne protokol er bredt anvendelig til andre dyrkede cellelinier, ikke-adhærerende linjer og primære celler.
    2. Tilføje varmet (37 ° C) trypsin eller andre enzymatiske oplukningsreagens optimeret for at opnå en enkelt cellesuspension fra de adhærerende celler. Følg producentens protokol.
      BEMÆRK: Trypsin og andre enzymatiske dissociation reagenser har potentiale til at påvirke cellulære markører.
    3. Inkubér pladen ved 37° C i 2-5 min for at frigøre celler. Ved høje konfluens kulturer, bankes let på pladen for at hjælpe løsne cellerne.
    4. Overføre fuldt løsrevne celler fra pladen i en 5 ml rundbundet rør og forsigtigt pipetteres anvendelse af en 1 ml pipette at dissociere celler.
      BEMÆRK: behandling af store antal prøver kan alternativt udføres alle trin i en 96 brønd rundbundet plade. Til behandling af prøver i et format med 96 brønde alle vaske kan udføres ved et volumen på 250 pi. De i andre trin mængder kan justeres, så det samlede volumen ikke overstiger 300 pi.
    5. Standse den enzymatiske fordøjelse reagens med et lige volumen vaskebuffer (0,5% BSA og 0,02% natriumazid i PBS).
      BEMÆRK: Natriumazid er et farligt kemikalie. Korrekte sikkerhedsforanstaltninger skal overholdes for sin forberedelse og håndtering.
    6. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 37 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    7. Gensuspendérceller i 1 ml serumfrie medier.
    8. Tæl celler ved at overføre 10 pi af cellesuspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fortynd alikvot til en kendt forhold i trypanblåt og overførsel til et hæmocytometer eller automatiseret celletælling system.
  3. Mærkning af S-fasen befolkning
    BEMÆRK: Hvis S-fasen mærkning ikke skal udføres fortsætte at dæmme 1.4.
    1. Forberede 1 ml 10 uM 5-iod-2'-deoxyuridin (IDU) i serumfrit DMEM F12 eller andet egnet medie for hver 2 x 10 6 celler, der skal analyseres.
    2. Tilsæt 500 pi 10 pM IDU i serumfrit medium for hver 2 x 10 6 celler.
      BEMÆRK: Når IDU mærkning kan udføres i medier, der indeholder serum, vil frit protein reagere med cisplatin, forhindrer korrekt mærkning af døde celler. Hvis der anvendes medier indeholdende serum under IDU mærkning af et yderligere vasketrin er serumfrie medier er nødvendigt at fjerne serumproteiner før cisplatin levende / dead staining.
    3. Forsigtigt resuspender pellets med 1 ml pipette.
    4. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C med forsigtig omrystning.
  4. Levende / Dead mærkning
    1. For hver prøve forberede 500 pi 50 pM cisplatin i serumfrit DMEM-F12 eller celletype egnet medie.
      BEMÆRK: Hvis mærkning af S-fasen befolkningen med IDU ikke skal udføres, resuspender prøver ved en koncentration på 4 x 10 6 celler / ml. Resuspension af cellerne, før du tilføjer cisplatin muliggør hurtigere blanding af løsninger til ensartet levende / død mærkning.
    2. Tilsæt 500 pi af 50 pM cisplatin pr 2 x 10 6 celler til prøver.
    3. Inkubere ved stuetemperatur (RT) i 1 min på en orbitalryster med konstant blanding.
    4. Stands cisplatin med et tilsvarende volumen vaskebuffer.
    5. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    6. Vask prøverne to gangemed 500 pi vaskebuffer for at fjerne overskydende cisplatin.
    7. Vask prøverne to gange med 500 pi PBS for at fjerne overskydende protein.
  5. prøve fiksering
    1. Resuspender prøve i 500 pi PBS.
    2. Tilføje tilsvarende volumen 4% PFA i PBS i en slutkoncentration på 2%; pipette til at blande.
      BEMÆRK: Forbered 4% PFA frisk fra pulver, indstille pH til 6,9 og passere gennem et 0,44 um filter. 4% PFA i PBS kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger. Undgå premade formalin leveres i ampuller, medmindre specifikt testet, da det ofte indeholder metalforureninger, der kan interferere med de målte masse kanaler. Lavere koncentration af PFA kan være tilstrækkelig og bidrage til at minimere virkningen af ​​fiksering på antistofbinding men bør testes empirisk.
    3. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur på en orbitalryster med konstant blanding.
    4. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller forsigtigt sug supernatanten without forstyrre pelleten.
    5. Vask prøver med PBS til fjernelse af PFA opløsning.
      BEMÆRK: I dette trin prøver kan opbevares kortvarigt ved 4 ° C. Langvarig opbevaring ved 4 ° C kan resultere i nedbrydning af prøven og reduceret farvning.

2. Barcoding

BEMÆRK: Under metode til at udnytte monoisotopiske cisplatin stregkodesystem og palladium barcoding præsenteres samtidig, kan enten anvendes uafhængigt eller undgås helt, hvis ikke kræves af eksperimentet.

  1. Monoisotopisk Cisplatin Stregkode
    BEMÆRK: Da skal tages cisplatin stregkodesystem og cisplatin Levende / Dead farvning stole på overlappende kanaler omhu for at sikre, at baggrunden cisplatin Levende / Dead farvning i de levende celler minimeres, da det kan forstyrre nøjagtigheden af ​​cisplatin stregkode.
    1. Fortynd 1 mM monoisotopiske cisplatin stamopløsninger til 200 uM i PBS.
    2. Til ever unik cisplatin stregkode forberede et 1,5 ml rør med 500 pi PBS i hver 2 x 10 6 celler, der modtager denne stregkode.
    3. Til fremstilling hver unik stregkode tilføje hver anvendelig monoisotopiske cisplatin til en endelig koncentration på 200 nM.
    4. Resuspender cellerne i 500 pi PBS pr 2 x 10 6 celler.
    5. Tilsættes samme mængde af den tilsvarende stregkode opløsning til hver prøve.
    6. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 5 minutter på en orbitalryster med konstant blanding.
    7. Stands cisplatin med et tilsvarende volumen vaskebuffer.
    8. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    9. Vask prøverne to gange med 500 pi vaskebuffer for at fjerne overskydende cisplatin.
  2. palladium Barcoding
    BEMÆRK: Palladium Stregkodeprodukter reagenser kan enten være forberedt 5 eller købes kommercielt.
    1. Forbigående delvispermeabilisering 19
      BEMÆRK: Palladium chelatering barcoding kræver delvis permeabilisering for reagenserne til at passere gennem cellemembranen og robust mærke cellen.
      1. Vask prøver med 500 pi PBS.
      2. Vask prøver med 500 pi PBS plus 0,02% saponin.
      3. Resuspender pellet i restvolumen.
    2. Anvende palladium stregkodesystem.
      1. Fortynd 100x lager af palladium stregkodesystem reagens i 1 ml iskold PBS plus 0,02% saponin.
      2. Hurtigt tilføje fortyndet barcoding reagens til genopslæmmede prøve.
      3. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur på en orbitalryster ved under konstant blanding.
      4. Vask prøverne to gange med 500 pi vaskebuffer.

3. Celleoverfladefarvning

BEMÆRK: Celleoverfladefarvning kan udføres på levende celler forud for fiksering. Dette kan være nødvendigt for antistoffer, der mister affinitet for their epitop efter fiksering. Nogle celleprøver kan opnå yderligere blokering, såsom Fc blokering for leukocytter, før antistofmærkning at reducere baggrund. Optimal blokering bør bestemmes empirisk for specifik prøvetype.

  1. Forbered celleoverflade antistoffarvning panel.
    1. Kombiner 0,5 pi, eller empirisk bestemt mængde af hver 0,5 mg / ml celleoverfladen antistof pr prøve i et 1,5 ml rør. Tilføj vaskepuffer hvis nødvendigt for at bringe volumenet op til 10 pi per prøve. Bland ved pipettering.
      BEMÆRK: Bestem arbejdsfortynding for hvert antistof inden eksperimentet empirisk ved titrering eksperiment.
    2. Split celleoverflade antistofpool ligeligt i en 1,5 ml rør for hver prøve, der skal farves.
    3. Forbered 500 pi vaskebuffer i et 1,5 ml rør for hver prøve.
  2. Anvende celleoverfladefarvning til prøver i normaliseret volumen for alle prøver.
    BEMÆRK: For at ENSure konsekvent antistofmærkning tværs af flere prøver er det afgørende omhyggeligt at styre prøvevolumenet og antistofkoncentration. Følgende trin sigter mod at opnå denne overensstemmelse ved at sikre, at de endelige prøvevolumener efter antistoffet er tilsat er ensartede.
    1. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    2. Med en 200 pi pipette sæt til 50 pi, resterende opløsning fra prøve pellet og overførsel fjern til et rør af den alikvoteret celleoverflade antistofpuljen.
    3. Pipette op al væske i den alikvote røret uden at trække luft ind i pipettespidsen.
    4. Hold pipetten stemplet for at undgå at trække luft bevæge spidsen til en forberedt rør på 500 pi vaskebuffer og frigive stemplet.
    5. Tilføje tilbage indholdet af pipettespidsen til prøven og resuspender prøven i væsken med forsigtig pipettering.
    6. Inkuber prøverne i 1h ved stuetemperatur på en orbital omryster med konstant blanding.
    7. Vask prøverne to gange med 500 pi vaskebuffer for at sikre, at alle frit antistof vaskes væk.
    8. Vask prøver med 500 pi PBS.
    9. Resuspender cellepelleten i 500 pi PBS.
    10. Tilføje tilsvarende volumen 4% PFA i PBS; pipette til at blande.
    11. Inkuber i 10 minutter på en orbitalryster.

4. Cell Permeabilisering og Intracellulær farvning

  1. Cell permeabilisering
    1. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    2. Resuspender celler i restvolumen ved forsigtigt hvirvelbehandling indtil pelleten dissocieres.
      BEMÆRK: Manglende dissociere celler før tilsætning MeOH vil resultere i celler klæber sammen og fremstilling af en tynd film, som vil resultere i delprøve tab.
    3. Straks tilsættes 1 ml 100% MeOH per 2 x 10 6 </ Sup> celler og blidt pipette for at blande.
      BEMÆRK: Andre permeabilisering metoder kan erstatte MeOH og kan være nødvendig for at opnå optimal permeabilisering for nogle celletyper. For nogle cellekilder en 0,1% Triton X-100, kan 0,2% Tween-20 eller 0,1% saponin i PBS-opløsning til permeabilisering opretholde celleintegriteten bedre mens det stadig giver konsekvent permeabilisering.
    4. Inkuber prøver i mindst 1 time eller op til maksimalt 24 timer ved 4 ° C i permeabilisering.
      BEMÆRK: I dette trin prøver i MeOH kan opbevares i op til 1 måned ved -80 ° C.
    5. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    6. Tilsæt 1 ml af vaskebuffer for hver ml MeOH anvendes til at permeabilisere prøven. Forsigtigt resuspendere cellepelleten.
    7. Vask prøven to gange med 500 pi vaskebuffer.
  2. Forberede intracellulær antistoffarvning panel.
    1. Kombiner 0,5 pi, eller empirisk bestemt mængde af hver 0,5 mg / ml intracellulært antistof pr prøve i et 1,5 ml rør. Tilføj vaskepuffer hvis nødvendigt for at bringe volumenet op til 10 pi per prøve. Bland ved pipettering.
    2. Split intracellulær antistofpuljen ligeligt i en 1,5 ml rør for hver prøve.
    3. Forbered 500 pi vaskebuffer i et 1,5 ml rør for hver prøve.
  3. Anvende intracellulær farvning til prøver i normaliseret volumen for alle prøver.
    BEMÆRK: For at sikre ensartet antistofmærkning tværs af flere prøver er det afgørende omhyggeligt at styre prøvevolumenet og antistofkoncentration.
    1. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    2. Med 200 pi pipette sat til 50 pi fjern resterende opløsning fra prøve pellet og overførsel til et rør af den alikvoteret celleoverflade antistofpuljen.
    3. pipetteop al væske i den alikvote røret uden at trække luft ind i pipettespidsen.
    4. Hold pipetten stemplet for at undgå at trække luft bevæge spidsen til en forberedt rør på 500 pi vaskebuffer og frigive stemplet, udarbejdelse vaskebuffer til et samlet prøvevolumen på 50 pi.
    5. Tilføje tilbage indholdet af pipettespidsen til prøven og resuspender prøven i væsken med forsigtig pipettering.
    6. Inkuber prøverne i 1 time ved stuetemperatur på en orbitalryster med konstant blanding.
    7. Vask prøverne to gange med 500 pi vaskebuffer.
    8. Vask prøver med 500 pi PBS.

5. Iridium Mærkning

  1. fix prøver
    1. Resuspender prøver i 500 pi PBS.
    2. Tilsæt 500 pi af 4% PFA i PBS.
    3. Inkuber i mindst 15 minutter ved stuetemperatur på en orbitalryster med konstant blanding.
  2. Påfør Iridium mærkning af DNA
    1. Tilsæt 500 pi 62,5 nM iridium PFA løsning på prøver.
      BEMÆRK: forsøg under anvendelse permeabiliserede celler fortyndes 500x Ir191 / 193 lager til en slutfortynding på 1: 2.000 til undgå overstaining.
    2. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur på en orbitalryster med konstant blanding.
      BEMÆRK: Hvis der udføres monoisotopiske cisplatin stregkodesystem ikke inkubere prøver med iridium længere end 15 min siden stærke Ir193 signaler kan bidrage til Pt194 masse kanal og negativ indflydelse stregkodesystem kvalitet.
    3. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    4. Vask prøverne to gange med 500 pi 0,1% BSA i filtreret deioniseret vand.
      BEMÆRK: Når forberedt anbefaler vi kører prøver inden 24 timer, hvis muligt. Fremstillede prøver kan opbevares kort sigt ved 4 ° C,men der skal sørges for at undgå nedbrydning. Hvis det er muligt bør udføres de endelige vaske i filtreret deioniseret vand uden BSA da dette vil mindske aflejringen på kammeret og sampler spray kogler af maskinen som vil falde instrument rengøring. For hESCs er det nødvendigt at udføre disse vaske mens herunder BSA at undgå prøvetab klistrer til røroverfladen.

6. Forbered Prøver for Acquisition

  1. Tæl celler
    1. Resuspender cellerne i 500 pi 0,1% BSA i filtreret deioniseret vand og filtreres over i en frisk rør gennem en 35 um cellefilter cap.
      BEMÆRK: Sænkning af BSA niveau for de endelige vaske nedsætter efterlader på Mass cytometri forstøver. Ikke-adhærente celler kan vaskes og resuspenderes i filtreret deioniseret vand.
    2. Tæl celler ved at overføre 10 pi af cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør. Fortynd alikvot til en kendt forhold itrypanblåt (for at hjælpe med celle visualisering), som overføres til et hæmocytometer eller automatiseret celletælling system.
    3. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Dekanteres eller omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  2. Forberede og belastning prøver
    1. For at forberede kalibrering perler fjerne fra køleskabet og ryst kraftigt for at opblande.
    2. Hvis der kører prøver under anvendelse af en masse cytometri autosampler, tilsættes 50 pi kalibrering perler til hver brønd i prøveplade derefter tilføje det ønskede antal celler, der skal analyseres. Hvis der kører prøver ved manuel injektion tilsættes 50 pi kalibrering perler til prøve, fortynde prøven i filtreret deioniseret vand, bland godt og belastning prøven i Mass cytometri prøveinjektionsåbning. Den passende prøvefortynding kan variere afhængigt af den celletype, der analyseres, men en fortynding på 10 6 er generelt passende 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen præsenteres her kan bredt anvendes til en bred vifte af dyrkede og primære celleprøver med kun mindre modifikationer. Afhængig af kravene til forsøget, kan den udføres i en modulær måde, når visse elementer, såsom stregkoder eller celleoverfladefarvning, er ikke nødvendige. Anvendes i sin helhed denne protokol muliggør fremstillingen af ​​multiplekserede masse cytometri prøver mærket til døde udelukkelse celle, S-fase population identifikation og farvet til kvantificering af op til 38 antistofmål.

Forventede resultater fremstillet ved metoderne i denne protokol (figur 2) er afbildet i figur 3. Ved afhentning af data, kan udføres normalisering af signalintensiteten baseret på kalibrering perle intensitet i massen cytometri software. Efter normalisering, indledende proce datassing at fjerne kalibrering perler, gate på enkelte celler og fjerne døde celler kan udføres manuelt ved hjælp af software, der kan analysere flowcytometri data. Fjernelse af kalibrering perler kan udføres manuelt ved gating på Ir191 + Ce140- population (figur 3A) eller med en MATLAB baseret algoritme 20. Encellede begivenheder (sort kontur, figur 3B) kan gated under fjernelse debris og celle multipletter, ved gating på den biaksiale plot af Ir193 og Event Længde (figur 3B). Cisplatin mærkning af døde celler kan anvendes til at kvantificere mængden af ​​celledød; vist er eksempler på prøver med lav (figur 3D) og højere (figur 3E) mængder af døde celler. Døde celler kan fjernes fra dataene ved gating off Pt198 + population (figur 3E). Stregkoder af prøver, også med monoisotope cisplatin eller palladium reagenser, resulterer i tydelig adskillelse af samples inden for Stregkodeprodukter parametre (figur 3C), som tillader celler at tildeles til deres oprindelige prøve identitet. Yderligere valgfri metoder, såsom IDU mærkning, at detektion af specifikke populationer, f.eks S-fase celler (Figur 3F). Efter indledende normalisering, debarcoding og gating, kan de høje dimensionelle data analyseres anvendelse af en række af algoritmer herunder SPADE 17 og flere andre er beregnet til masse-cytometri analyse og visualisering 18 data. Algoritmer, som SPADE tage de høje dimensionelle data, som kan være vanskelige at fortolke, da det ikke kan visualiseres direkte i sin høje dimensionelle tilstand, og generere en lavere dimensionel gengivelse af de data, der er mere egnede til visuel fortolkning (figur 3G).

figur 1 Figur 1: Grundlæggende principper for masse cytometri måling. Fremstilling af celleprøver til masse cytometrianalyse involverer farvende celler med antistoffer mærket med metal isotoper hovedsagelig fra lanthanidrækken af ​​grundstoffer. I dette skema hvert antistof dannet mod en specifik epitop, mærkes med en isotop besidder en unik atommasse, såsom samarium 154. Antistoffer mod epitoper, som er overflade, cytoplasmisk, kan potentielt anvendes nukleare eller chromatin lokaliseret. Mærkede celler injiceres og sprøjtes gennem massen cytometri forstøveren som enkeltcelle-dråber, hvor de er ioniserede ved en argon plasmabrænderen. Skyen resulterende partikel er strippet for lav masse atomer med en kvadrupol filter mens den overflod af større atommasse- ioner måles af detektoren. Den målte mængde af hver unik masseion svarer til den cellulære overflod af dens tilhørende antistoffets målepitop. Mens en teoretisk lIMIT af over 100 parametre kunne kvantificeres udnytte denne metode, de nuværende kommercielt tilgængelige reagenser muliggøre påvisning af over 40 parametre for hver celle. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Arbejdsgang diagram af forsøget og valgfri trin. Afbildning af de vigtigste trin, der er involveret i protokollen forberede celler til masse-cytometri. Valgfri trin er angivet med appelsin bokse. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
figur 3: Eksempel på data genereret fra m røv cytometri analyse. (A) Biaksial plot, der viser adskillelse af celler (høj Ir191, lav Ce140), perler (lav Ir191, høj Ce140) og perle-celle-dubletter (høj Ir191, høj Ce140). (B) Biaksial plot, der viser forventede udseende Ir193 vs event længde. Gating af enkeltceller, der fjerner cellerester og celle multipletter er vist. (C) Biaksial plot, der viser eksempel af to mass kanaler fra cisplatin stregkodesystem. (D - E) Eksempel data fra cisplatin Levende / Dead farvning for prøver med en lav procentdel (D) og en høj procentdel (E) af døde celler. (F) Biaksial plot af H9 hESC celler mærket med IDU at skelne celler i S-fase og et antistof mod cyclin B1 til yderligere at skelne cellecyklussen. (G Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her er med held blevet anvendt til behandling af forskellige dyrkede cellelinier (H1 og H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) og vævsprøver primære (mus knoglemarv, muse embryonale lever, muse voksen lever, musetumor). Uanset kilden, ethvert væv, der kan dissocieres i enkeltceller samtidig bevare den cellulære tilstand bør være modtagelige for analyse efter masse cytometri, men kan kræve nogen protokol optimering. Det er vigtigt at bemærke, at nogle epitoper kan blive påvirket af de særlige dissociations-, fixation og permeabilisering behandlinger anvendes og disse fremgangsmåder kan være nødvendigt at gennemgå prøve-specifik optimering. Hvis der konstateres lav signal for et antistof, kan det være muligt at forbedre ved at udføre celleoverfladen mærkning på levende celler, skiftende permeabilisering metoder eller faldende fiksering tid.

Når det er muligt inden for den eksperimentelle design, herunder barcoding i the prøve behandling workflow sikrer konsistens mellem prøver på niveauet for celle og antistofkoncentration. Uden stregkodning, selv når stor omhu for at kontrollere prøve behandling, er det sandsynligt, at små variationer i antistofkoncentration og cellekoncentrationen vil blive indført mellem prøverne. Som procentdelene af celler positive for specifikke epitoper vil sandsynligvis variere mellem prøverne, den effektive antistof-til-epitop forhold kan nødvendigvis variere mellem prøver, selv om den totale koncentration antistoffet holdes konsekvent, hvilket potentielt kan føre til uoverensstemmelser i antistoffarvning. Disse variationer, mens generelt mindre, når observere en enkelt kanal, kan blive stærkt forværret når der udføres en høj-parameter eksperiment og kan misfortolkes som biologisk mening, hvis man ikke passer under dataanalyse.

Analyse af de resulterende data fra en masse cytometri eksperiment kan antage mange former, og en række computanelle tilgange er blevet tilpasset specielt til denne ansøgning. Men samtidig give en udtømmende undersøgelse af nyttige algoritmer til masse-cytometri dataanalyse ligger uden for rammerne af dette manuskript, er tilgange, der med succes er blevet udnyttet fremhævet og interesserede læsere er rettet til flere ressourcer, der dækker dette emne 21, 22, 23. To af de mest udbredte ansat, som i øjeblikket tilgængelige metoder til analyse af masse-cytometri data Spanning Tree Progression af Density normalisere Events (Spade) og visne. SPADE danner klynger fra grupper af celler med lignende markør udtryk og betegner hver klynge som et knudepunkt. Disse knudepunkter er anbragt i en spade træ, hvor lignende knudepunkter er forbundet af en ledning (figur 3G). visne udnytter t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding algoritme 24 for at generere en todimensional repræsentation afde høje dimension data og samtidig bevare den overordnede datastruktur. Både SPADE og visne er skrevet i Matlab, kildekoden er frit tilgængelig og kan køres af brugere med MATLAB. Derudover en enkeltstående version af SPADE er tilgængelig.

Mens masse cytometri øjeblikket tillader opsamling af det højeste antal af parametre, kan fluorescerende mærke baseret cytometri være en bedre tilgang til nogle programmer. Fluorescens-flow-cytometri kan analysere flere celler per sekund, op til 5 x 10 4 sammenlignet med 500-1.000 for masse-cytometri, og har mere tilgængelig valideret antistoffer 25. Yderligere fremskridt i fluorescens-flow-cytometri, såsom hyperspektral cytometri 26 og nye fluorophorer 27 make fluorescens flow cytometri et rentabelt alternativ for alle, men meget høje parameter forsøg. Yderligere teknikker såsom måling af RNA 28 hidtil kun har kunnetved fluorescens baseret flowcytometri er for nylig blevet tilpasset til masse cytometri tillader samtidig detektering af protein og RNA 29. Fremtidig udvidelse af tilgængelige isotoper og reagenser til mere fuldstændigt at udnytte massen vindue af målelige isotoper og udvide repertoiret af målbare cellulære egenskaber vil udvide dybden af ​​profilering muligt efter masse cytometri.

Det store antal parametre, der kan analyseres samtidigt ved masse-cytometri høj grad udvider de eksperimentelle spørgsmål, der kan undersøges. Vi håber, at denne artikel og tilhørende video protokol vil gøre det muligt for interesserede forskere til mere effektivt at udnytte masse cytometri for at fremme deres forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 medium kit Stem Cell technologies 05850 Warm at room temperature before use
DMEM F-12 ThermoFisher 11330-032 Warm at 37 °C before use
Accutase Stem Cell technologies 07920 Warm at 37 °C before use
Bovine serum albumin Equitech BAH62
phosphate buffered saline Hyclone SH30256.01
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Cell ID Pt194 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt195 Fluidigm Provided at 1 mM
Cell ID Pt196 Fluidigm Provided at 1 mM
Cisplatin Enzo Life Sciences ALX-400-040-M250 Soluble to 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit Fluidigm 201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich I7125 Soluble to 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent Fluidigm 201103A
Methanol Fisher BP1105-4 Chill at -20 °C before use
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
5 mL round bottom tubes Falcon 352058
5 mL 35 μm filter cap tubes Falcon 352235
EQ four element calibration beads Fluidigm 201078
Hyaluronidase Type I-S Sigma-Aldrich H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Disposable Scalpel #10 Sigma-Aldrich Z69239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics