A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano
Published 10/07/2016
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Bioengineering

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Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

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Abstract

Introduction

Os hidrogéis são redes tridimensionais formadas por polímeros reticulados hidrófilos, que são naturais ou sintéticos, e caracteriza-se por uma estrutura tridimensional diferente. Estes dispositivos são cada vez mais atraente nos domínios biomédicos da entrega da droga, engenharia de tecidos, portadores do gene e sensores inteligentes 1,2. Com efeito, o seu elevado teor de água, bem como as suas propriedades reológicas e mecânicas torná-los candidatos adequados para imitar microambientes dos tecidos moles e os tornam ferramentas eficazes para citocina solúvel em água ou entrega do factor de crescimento. Um dos usos mais promissor é como um biomaterial injectável transportando células e compostos bioactivos. Os hidrogeles podem melhorar a sobrevivência de células e o destino celular haste de comando, mantendo e entregar precisamente sinais reguladores de células estaminais de um modo fisiologicamente relevante, tal como observado in vitro e em experiências in vivo 3,4. A vantagem principal da presente é a possibilidadepara manter as células injectadas no interior da zona de inoculação (in situ), minimizando a quantidade de células que deixa a área e extravasa na corrente circulatória, a migração em todo o corpo e perder a baliza 5. A estabilidade das redes tridimensionais de hidrogel é devido aos seus sítios de ligação cruzada, formadas por ligações covalentes ou forças de coesão entre as cadeias de polímero 6.

Neste quadro, química selectiva ortogonal aplicada a cadeias poliméricas é uma ferramenta versátil capaz de melhorar o desempenho de hidrogel 7. Com efeito, a modificação de polímeros com grupos químicos adequados podem contribuir para fornecer químico apropriado, propriedades físicas e mecânicas para aumentar a viabilidade das células e a sua utilização na formação de tecido. Do mesmo modo, entre as técnicas para carregar células ou factores de crescimento no interior da matriz de gel, o uso do péptido RGD permite melhorias na adesão celular e na sobrevivência. RGD é um tripéptido compostade arginina, glicina e ácido aspártico, que é de longe o mais eficaz e, muitas vezes empregue tripéptido devido à sua capacidade para lidar com mais do que um receptor de adesão de célula e o seu impacto na ancoragem biológica de células, o comportamento e a sobrevivência 8,9. Neste trabalho, a síntese de hidrogeles funcionalizada-RGD é estudada com o objectivo de conceber redes caracterizados por propriedades bioquímicas suficientes para um microambiente celular hospitaleiro.

A utilização de radiação de microondas na síntese de hidrogel oferece um procedimento simples para minimizar as reacções laterais e obter taxas de reacção mais elevadas e rendimentos em um período de tempo mais curto em comparação com os processos térmicos convencionais 10. Este método não requer passos de purificação e rendimentos hidrogéis estéreis devido às interacções dos polímeros e na ausência de solvente orgânico no sistema reaccional 11. Por isso, ele garante altas porcentagens de RGD ligados à rede polimérica porque nenhuma modificaçãoficações são necessários para os grupos químicos de polímeros envolvidos na formação de gel. Os grupos carboxilo, a partir de PAA e carbómero, e grupos hidroxilo, a partir de PEG e de agarose, para dar origem a estrutura tridimensional de hidrogel através de uma reacção de policondensação. Os polímeros mencionados são usados para a síntese de hidrogeles na lesão medular tratamentos de reparação 12. Estes dispositivos, como relatado em trabalhos anteriores 13,14, mostram elevada biocompatibilidade, assim como propriedades mecânicas e físico-químicas que se assemelham às de muitos tecidos vivos e na natureza tixotrópica. Além disso, eles permanecem localizadas in situ, na zona de injecção.

Neste trabalho, os grupos carboxilo são PAA modificada com uma porção alcino (Figura 1), e um composto de RGD-azida é sintetizado explorar a reactividade do grupo terminal tripéptido -NH2 com um composto químico com a estrutura preparada (CH 2) n - N 3 (<forte> Figura 2). Subsequentemente, o PAA modificada reage com o derivado azida por meio de RGD CuAAC reacção clique 15-17 (Figura 3). O uso de um catalisador (I) de cobre conduz a uma significativa melhoria tanto na taxa de reacção e a regio-selectividade. A reacção CuAAC é amplamente utilizado em síntese orgânica e em ciência de polímeros. Combina elevada eficiência e elevada tolerância para os grupos funcionais, e não é influenciada pelo uso de solventes orgânicos. A alta seletividade, um tempo de reacção rápida e um procedimento de purificação simples permitem a obtenção de polímeros em estrela, copolímeros em bloco ou cadeias de enxerto fracções desejadas 18. Esta estratégia torna possível clique para modificar polímeros após a polimerização de personalizar as propriedades físico-químicas de acordo com a aplicação bioquímica final. As condições experimentais são CuAAC facilmente reprodutível (a reacção é insensível à água, enquanto que a oxidação de cobre pode ocorrer minimamente), e a natureza dotriazol formado assegura a estabilidade do produto. O uso de metal de cobre pode ser considerado um ponto crítico, devido ao seu possível efeito tóxico contra as células e no microambiente biológica, mas a diálise é utilizado como um método de purificação a fim de permitir a remoção completa dos resíduos catalíticos. Finalmente, o PAA modificada RGD é utilizado na síntese de hidrogel (Figura 4) e as propriedades físico-químicas das redes resultantes são investigados, a fim de verificar o potencial de funcionalidade desses sistemas como células transportadoras ou drogas.

figura 1
Figura 1: PAA modificado síntese alcino Um esquema de funcionalização PAA com o grupo alcino;. "n" indica os monómeros com um grupo carboxilo reagir com propargilamina. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:.. RGD-azida síntese A síntese de derivado RGD-azida Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Clique reacção Esquema de reação clique entre derivado RGD-azida e alcino-PAA.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Hidrogel Synthesis. RGD funcionalizado procedimento de síntese hidrogel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Nota: Os produtos químicos são utilizados como recebidos. Linear RGD é adquirida, mas ele pode ser preparado por síntese de péptidos em fase sólida de Fmoc padrão 16,19. Os solventes são de grau analítico. A diálise requer a utilização de membranas com um M W de corte igual a 3500 Da. Os compostos sintetizados são caracterizados por espectros de 1 H RMN registados num espectrómetro de 400 MHz utilizando clorofórmio (CDCl 3) ou óxido de deutério (D 2 O), como solventes, e os desvios químicos são reportados como valores de ô em partes por milhão. Além disso, os hidrogéis são submetidas a análise por FT-IR utilizando uma técnica grânulo de KBr e sua caracterização física envolve estudos de gelificação avaliadas usando o tubo de ensaio invertido a 37 ° C.

1. Síntese de 4-cloreto de 1 Azidobutanoyl

  1. Dissolve-se 500 mg de 4-azidobutanoic ácido (3,90 mmol) em 10 ml de diclorometano e 0,5 ml de dimetilformamida.
  2. Arrefece-se a solução a 0 ° C, Usando um banho de gelo.
  3. Adicionar 505 ul de cloreto de oxalilo (5,85 mmol) a 5 ml de diclorometano e adiciona-se lentamente gota a gota, ao sistema de reacção, enquanto se agitava.
  4. Após 1 h a 0 ° C usando um banho de gelo, de regresso à temperatura ambiente.
  5. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
  6. Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em CDCl3 16.

2. Síntese de RGD-azida derivado de 2

  1. Dissolve-se 50 mg de RGD (0,145 mmol) em 1 ml de NaOH 1M.
  2. Dissolve-se 24 mg de 1 (0,16 mmol) em 2 ml de tetra-hidrofurano.
  3. Adicionar toda a solução de RGD a solução 1 gota a gota a 0 ° C usando um banho de gelo.
  4. Regressar até à temperatura ambiente e agitar durante a noite.
  5. Adicionar 1 ml de HCl 1M.
  6. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
  7. Caracterizar a obtained produto por 1 H-NMR espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

3. PAA Alcino Modificação 3

  1. Dissolve-se 200 mg de 35% w / w solução de PAA (2,8 mmol) em 15 ml de água destilada.
  2. Adicionar 15,4 mg de cloridrato de propargilamina (0,20 mmol).
  3. Dissolve-se 42,8 mg de hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt, 0,28 mmol) em 14 ml de uma mistura 1: 1 v / v de acetonitrilo: solução de água destilada por aquecimento a 50 ° C.
  4. Adicionar toda a solução de HOBt a uma solução de PAA à temperatura ambiente.
  5. Adicionar 53,6 mg de ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) à mistura de reacção.
  6. Use HCl a 1 M para ajustar o pH a 5,5 e agita-se o sistema reaccional durante a noite à temperatura ambiente.
  7. Dializar a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa.
  8. Perfodiálise rm por três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl.
  9. Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante.
  10. Caracterizar o polímero funcionalizado por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

4. Síntese de PAA-RGD 4 Polymer

  1. Dissolve-se 78 mg de PAA modificada alcino 3 (1,083 mmol) em 10 ml de água destilada.
  2. Dissolve-se 25 mg de azida do RGD derivado 2 (0,0722 mmol) em 5 ml de tetra-hidrofurano.
  3. Adicionar toda a solução de RGD com a solução polimérica.
  4. Adicionar 2,2 mg de iodeto de cobre (0,0116 mmol) e 2,2 mg de ascorbato de sódio (0,0111 mmol).
  5. Levar ao refluxo a mistura resultante durante a noite a 60 ° C, com agitação.
  6. Arrefece-se a mistura a 25 ° C.
  7. DialyzE é a solução. Dissolve-se 11,2 g de cloreto de sódio em 2 L de água destilada e, em seguida, adicionar 0,2 ml de 37% w / w de HCl. Dializar a solução através de uma membrana com um M W de corte de 3,5 kDa.
  8. Executar a diálise durante três dias. Alterar a solução de diálise por dia com 2 L de água destilada recentemente preparada contendo 0,2 ml de 37% w / w de HCl.
  9. Armazenar a solução final à temperatura de -80 ° C. Liofilizar-lo num liofilizador de acordo com os protocolos do fabricante.
  10. Caracterizar o produto obtido por 1 H-RMN espectroscopia, dissolvendo a amostra em D 2 O 16.

5. Hidrogel-RGD funcionalizado Síntese

  1. Prepare o PBS. Dissolve-se 645 mg de sal de PBS em 50 ml de água destilada.
  2. Misturar 40 mg de carbómero e 10 mg de 4 PAA funcionalizado em 9 ml de PBS (passo 5.1), à temperatura ambiente, até à dissolução completa (30 min).
  3. Adicionar 400 mg de PEG para a solução e manter a agitação durante 45 min.
  4. Pare a agitação e permitir que o sistema se contentar com 30 min.
  5. Use NaOH 1 N para ajustar o pH para 7,4.
  6. Para 5 ml da mistura obtida, adicionar 25 mg de pó de agarose
  7. Irradiar o sistema com a radiação de microondas a 500 W até ferver, durante um tempo geralmente entre 30 segundos e 1 minuto, e electromagneticamente aquecer até 80 ° C.
  8. Deixar a mistura exposta a temperatura ambiente até a sua temperatura diminui para 50 ° C e adicionam-se 5 ml de PBS (passo 5.1), a fim de obter uma solução com uma razão de 1: 1 volumétrico.
  9. Prepare 12 placa contendo cilindros de aço com múltiplas cavidades com um diâmetro de 1,1 cm.
  10. Aqui alíquotas de 500 ul da solução e coloca-los uns aos cilindros de aço.
  11. Deixar em repouso durante 45 minutos até completa gelificação do sistema.
  12. Remover os cilindros utilizando um fórceps de aço inoxidável para se obter os hidrogeles.

6. O carregamento de ferramenta terapêutica (Drug ou células)

  1. Repita steps 5,1-5,7.
  2. Quando a mistura (já no estado sol) atinge 37 ° C, adicionam-se 5 ml da solução contendo a cultura de células ou solução de fármaco desejado, a fim de se obter um sistema final numa proporção de 1: 1 volumétrico.
  3. Repita os passos 5,9-5,12 obter redes poliméricas com biocompostos fisicamente retidas dentro do gel.

7. Hidrogel Caracterização

  1. Análise de FT-IR
    1. Após a formação do gel, embeber um dos hidrogéis sintetizados em 2,5 ml de água destilada, durante 24 h.
    2. Retire os meios aquosos, onde hidrogel é submersas e congelar-seco com líquido N 2.
    3. Laminar a amostra de hidrogel de acordo com a técnica de grânulo de KBr.
      1. Adicionar uma espátula cheia de KBr num almofariz de ágata. Aqui uma pequena quantidade da amostra de hidrogel (cerca de 0,1-2% da quantidade KBr, ou apenas o suficiente para cobrir a ponta da espátula) e misturar com o pó de KBr.
      2. Moer a mistura até que o pó é fina e homogênea. </ Li>
      3. Usar o kit grânulo de KBr para formar o pellet IR. Pressionar o pó usando uma prensa de laboratório manual: durante 3 min a capacidade de pressão igual a 5 toneladas e, em seguida, durante 3 min a capacidade de pressão de 10 toneladas.
      4. Solte a pressão para obter o sedimento final como homogênea e transparente na aparência. Insira o pellet no suporte de amostra do IR e executar o espectro 16.
  2. Estudos de gelificação
    1. Encha 2 ml tubo de microcentrífuga com 900 jil de PBS e equilibrar a 37 ° C.
    2. Adicionar 100 ul da solução de polímero preparada para formar o hidrogel e incubar a 37 ° C.
    3. Inverter o tubo e observar se o gel flui a 1, 2, 5, 10 e 20 min. Gravar o momento em que o gel não flui como o tempo de gelificação.

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Representative Results

O derivado de alcino PAA é eficientemente sintetizados a partir do ácido poliacrílico e propargilamina, como mostrado na Figura 1 em que n rotula os monómeros cujos grupos carboxilo reagem com a amina. A identidade do produto é confirmada por 1H-RMN espectroscopia. A Figura 5 mostra o 1 H-RMN espectro de PAA modificada com ligação tripla.

Figura 5
Figura 5: Espectro de 1H-NMR do PAA modificado alcino O sinal relacionado com o alcino é realçado.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os sinais da cadeia de polímero pode ser observada no intervalo de 2,75-1,50 ppm; Considerando um pico em 2,8 0 ppm, representativa de H do alcino, e um pico a 4,20 ppm, relacionada com o 2 H do -CH2-, caracterizar o radical propargilo. Isto confirma que o PAA foi adequadamente modificado. A avaliação do grau de funcionalização alcino foi levada a cabo por integração da área sob os picos de PAA (definidos a 3,00, de acordo com o número de átomos de hidrogénio por monómero) e o radical propargilo, como ilustrado na Figura 5. O grau de funcionalização F é calculada como:

Equação

Equação representa a área integrante do resíduo de propargilo, a soma da área de H do alcino (rotulado como Equação ) E a área de -CH 2 (indicado como Equação ), Enquantoião "src =" / arquivos / ftp_upload / 54445 / 54445eq5.jpg "/> refere-se à área integrante dos sinais de polímero. O grau de funcionalização é calculada como sendo de 10% e é considerar satisfatória de acordo com a síntese de hidrogel, onde PAA tem de reagir por meio dos seus grupos carboxilo residuais para formar a rede 3D. Um rendimento quantitativo é obtido para o polímero 16 modificado.

De um modo semelhante, a Figura 6 mostra o espectro de 1 H-RMN do produto após a reacção entre o clique CuAAC PAA modificada alcino e azida de RGD. O pico do triazol formado a 8,15 ppm confirma que a reacção ocorra com um rendimento quantitativo e RGD está fortemente ligada às cadeias da PAA. A Figura 6 ilustra todos os sinais característicos da cadeia PAA e RGD.

Figura 6
Figura 6:1 H-RMN espectro de RGD ligada a PAA. O sinal de triazol é indicado (identificado como "A"). Funcionalização do polímero RGD através da reacção clique CuAAC é executada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

hidrogeles RGD-funcionalizados são preparados através de reticulação química dos quatro polímeros (PAA, carbómero, agarose e PEG) por polimerização de radical livre assistida por microondas. O aquecimento a 80 ° C conduz a uma mobilidade mais elevada do macrómero, e, portanto, aumenta as interligações de curto alcance entre os grupos carboxilo e hidroxilo dos polímeros. A reacção de esterificação realiza-se entre estes grupos funcionais e produz redes locais chamados "microgéis".

Como os policondensação rendimentos, a viscosidade do sistema aumenta continuamente, wnquanto a probabilidade de interação entre sítios reativos macrómeros diminui. No entanto, os grupos funcionais mais estreita ainda interagir eficientemente devido a uma mobilidade mais lenta. O estado físico-química resultante é caracterizada por uma "soldadura" entre as superfícies de microgel que produz a macroestrutura 3D final do hidrogel. A esterificação, ligação de hidrogénio e carboxilação trazer as cadeias de polímero estatisticamente mais estreita, criando assim uma estrutura heterogénea estável. O sistema resultante apresenta um comportamento sol / gel e que ele passa para um estado de gel dentro de 5 min. Este intervalo de tempo é referida como o tempo de gelificação.

A natureza química dos hidrogéis de RGD-funcionalizados é estudada utilizando análise por FT-IV. A Figura 7 mostra a comparação entre os espectros de FT-IV do composto de RGD-azida (linha verde), o hidrogel sintetizado sem funcionalização RGD (linha preta), e o hidrogel com a modificação do péptido (linha azul). A especificação hidrogeltra são ambos caracterizados por um sinal de largura, nos 3,600-3,200 cm -1 gama, representante da vibração de alongamento de ligações OH residuais e por um pico cerca de 2.940 cm -1 do estiramento CH. A validação que a esterificação ocorre entre os grupos hidroxilo e carboxilo de polímero é dado pelos picos de cerca de 1600 cm -1 e 1400 cm-1, o que corresponde, respectivamente, ao simétrica e assimétrica alongamento do CO 2 porção. Estes picos são mais visíveis no espectro do hidrogel não-funcionalizada, ao passo que no espectro de RGD-hidrogel que são parcialmente cobertos pelos sinais indicados como bandas de amida I e II.

Figura 7
Figura 7:. Comparação de espectros FT-IR espectros FT-IR de RGD (linha verde), hidrogel sem funcionalização RGD (linha preta) e hidrogel RGD funcionalizado (linha azul). osinal relacionado com a amida RGD é indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O alongamento de C = O, rotulados como banda amida I ( "amida I" na Figura 7), apresenta um pico a 1650 cm -1 no espectro de tripéptido e é deslocado para cerca de 1670 centímetros -1 na amostra de RGD-hidrogel . A dobra de NH, relacionada com a banda de Amida II ( "Amida II" na Figura 7), pode ser gravado com o sinal em torno de 1550 cm -1 no espectro de RGD e também é reconhecível na amostra de hidrogel, em cerca de 1.600 cm - 1. Uma vez que não há componentes de amida na formulação de hidrogel padrão, a presença de picos de uma natureza peptídica sugere que o PAA é realmente funcionalizados com RGD e é capaz de formar um hidrogel com sítios peptídicos dentro da rede polimérica.

O espectro de FT-IR de hidrogel também mostra os picos relacionados com a vibração de alongamento de COC de ligação glicosídica (900-1.000 cm-1 gama) entre as unidades de monossacárido da agarose e os grupos éster.

Para obter conhecimento sobre a estrutura 3D e as propriedades físicas e mecânicas destes hidrogéis, análise SEM, a gelificação, inchaço e cinética são realizados estudos reológicas, como discutido em trabalhos anteriores 13,20. Resultados de SEM (Figura 8) mostram que os hidrogéis são caracterizados por uma estrutura microscópica complexo com alguns poros maiores que contenham pequenos poros e em algumas redes fibrilares nas paredes dos poros. Além disso, a maior parte dos poros estão interligados. A estrutura emaranhados é semelhante à rede de 3D hidrogeles preparadas da mesma maneira mas sem a funcionalização de RGD. Isto demonstra que o RGD não altera a rede de polímero. Utilizando o teste de tubo de ensaio invertido, o hidrogel samplas solidifica dentro de 5 min, como observado na amostra de hidrogel sem RGD funcionalização 21. Este tempo de gelificação curto sublinha a sua adequação para aplicações biomédicas.

Figura 8
Figura 8:.. Imagens análise SEM SEM mostram a morfologia de uma amostra funcionalizada-RGD hidrogel (A) e um hidrogel sem funcionalização (B) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O rácio de equilíbrio de inchamento indica a capacidade de absorver e reter uma grande quantidade de água e é uma das principais características de sistemas de hidrogel 20,22. As amostras analisadas exibem rápida cinética de inchaço e edema atingirem o equilíbrio durante a primeira hora. seu inchamentoing valor de equilíbrio Q é relatado no nosso trabalho anterior 16 e é semelhante ao valor obtido por análise de hidrogeles sem RGD, confirmando que o tripéptido é integrado com a rede polimérica e não cria um elevado obstáculo para o processo de gelificação.

Com os estudos reológicos, o módulo de armazenamento em gel (G') é encontrado como sendo de aproximadamente uma ordem de magnitude maior do que o módulo de perda (G''), indicando um material elástico 23, em vez do que viscosa e ambos são essencialmente independente da frequência. Valores semelhantes de G'e G'' são registrados com a amostra de gel sem uma modificação peptídeo 16. Isto demonstra que a presença de RGD dentro da rede polimérica não afectam as propriedades reológicas do material, mantendo as características peculiares que competem para sistema injectável para aplicação biomédica.

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Acknowledgements

Autores gostariam de agradecer ao Prof. Maurizio Masi para discussão frutífera e Miss Chiara Allegretti para edição idioma. pesquisa dos autores é apoiado pelo Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

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