Laser-assisteret Cytoplasmatisk Mikroinjektion i Livestock Zygoter

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Genetics

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Cytoplasmatisk mikroinjektion af 1-celle embryoer er en meget kraftfuld teknik. Det kan bruges til afgivelse af enhver løsning i embryonet til for eksempel at producere gen-knock-outs at studere genfunktion eller til at generere gen-redigerede dyr. Mest landbrugsmæssigt-relevante farm animal zygoter har en meget høj fedtsyresammensætning, der gør deres cytoplasma uigennemsigtig og mørke 1. De har også en forholdsvis elastisk plasmamembran (PM). Disse egenskaber gør mikroinjektion hjælp konventionel pronukleær / cytoplasmatisk injektion som anvendt hos gnavere udfordrende og ofte unøjagtige.

Cytoplasmatisk mikroinjektion har fordele i forhold pronukleær mikroinjektion, da det er lettere at udføre og forårsager også mindre skade på de injicerede embryoner, hvilket resulterer i højere 2 levedygtighed. Det overordnede mål med denne protokol er at demonstrere en succesfuld metode til at levere løsninger i cytoplasmaet af husdyrgenetiske zygoter. For at kunne udførecytoplasmatisk mikroinjektion med høj effektivitet på husdyr embryoer, er en laser anvendes til at frembringe et hul i zona pellucida (ZP) og derefter en stump-ende glas nål anvendes til mikroinjektion. Denne strategi har til formål at reducere mekanisk skade trykt på fosteret under injektion. Derefter, aspiration af cytoplasmatisk indhold inde kanylen muliggør effektiv og tillid brud på PM sikre, at opløsningen er leveret i cytoplasmaet af embryoet.

Denne teknik er allerede blevet brugt med held i kvægembryoner at levere siRNA i zygotisk cytoplasma 3,4 og skabe mutationer ved hjælp af klynger regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR tilknyttet systemet 9 (Cas9) systemet 5. Den er også egnet (med mindre modifikationer) til at injicere bovine cumulus-oocyter 6. Her beskriver vi vores injektionsprotokol levere et farvestof, der kan være anvendelig til at injicere enhver desIRED opløsningen i zygote, og vise, at bruge denne teknik forårsager minimal lyse og ikke påvirker tidlig embryo udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikropipette Production

  1. Injektion mikropipette
    1. Placer en borosilikatglas kapillarrør (ydre diameter (OD): 1,0 mm, indvendig diameter (ID): 0,75 mm) i en mikropipette aftrækker (i midten af ​​højre og venstre kapillære indehavere) og lås den.
    2. Brug et passende program til at trække glasset kapillar så det resulterer i en tynd spids med en lang snittap. (Eksempel: Varme: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tid: 200; Pressure: 500).
    3. Fjern forsigtigt løftes pipetter fra enheden og placere den på en microforge i vandret position.
    4. Bring trak pipette og microforge varmer glødetråd med sin glaskugle i fokus. Brug okularet reticle at måle den ønskede tykkelse og flytte pipetten vandret indtil glødetråden varmer når målet indre diameter (5 um).
    5. Juster varmen til ca. 45% og forsigtigt bringe pipetten ned, så den rører glødetråden. Aktiver varmeren kortvarigt. Denne wsyg lidt smelte pipetten, så det klæber til glødetråden, og efter afkøling, vil pipetten pause på kontaktpunktet generere et lige snit.
      Bemærk: Indstilling af passende temperatur er nøglen i dette trin, da temperaturer for høj vil gøre pipetten bøjes og dermed et lige snit vil ikke være muligt og temperaturer for lav, vil ikke være tilstrækkelig til at smelte pipette (figur 1A).
    6. Foretag en omtrentlig 30 ° vinkel nær pipettespids ved at placere det omkring 10 um væk fra glødetråden varmelegeme. Indstil temperaturen til 60% og aktivere varmeren.
      Bemærk: Dette vil bøje pipetten over glødetråden. Denne vinkel er ønsket, så spidsen af nålen er parallel med overfladen af injektionspladen når den er monteret i injektoren (figur 1B).
    7. Håndtag mikroinjektion pipetter med forsigtighed, da de er meget skarpe og skrøbelige.
  2. Holding mikropipette
    1. Placer en borosilicspiste glas kapillar (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) i en mikropipette aftrækker (i midten af ​​højre og venstre kapillære indehavere) og lås den.
    2. Brug et passende program til at trække glasset kapillar så det resulterer i en tynd spids med en lang endda taper og parallelle vægge (Eksempel: Varme: 815; Pull: 20; Velocity: 140; Tid: 175; Pressure: 200).
    3. Fjern forsigtigt trukket pipette fra aftrækker enhed og placere den på holderen microforge i vandret position. Juster fokus på glødetråden varmelegeme og pipette.
    4. Brug okularet reticle at måle pipette diameter og flytte pipetten indtil dens diameter over glødetråden når 180 um.
    5. På den angivne størrelse, markere glas kapillarrør med en diamant spids pen, og tryk derefter forsigtigt på den trak spidsen for at bryde glasset. Dette bør resultere i et lige snit (figur 1C).
    6. Flyt pipetten til en lodret position med sin spids tæt på filamentet. Indstil temperaturen af microforge til 60%.
    7. Brand-polish spidsen af pipetten anvendelse af standardteknikker 7, indtil den når en ID på 40 um. Brug okularet reticle at kontrollere ID (Figur 1D).
    8. Lav en vinkel på pipetten.
      1. Bringe pipetten tilbage til vandret stilling ca. 10 um væk fra glødetråden og 5 mm væk fra dens spids. Indstil temperaturen til ca. 60% og aktivere varmeren at bøje pipetten over glødetråden. Opvarmningen fortsættes, indtil en ønsket vinkel (ca. 30 o) nås. Check vinklen visuelt (figur 1E).
        Bemærk: Pipetten er normalt monteret på mikroinjektor med en omtrentlig vinkel på 60 o i forhold til bunden af injektionen skålen. Spidsen af ​​pipetten er bøjet, så det er parallelt med bunden af ​​skålen, som er nødvendig for den korrekte injektion af embryonet ved dets midterplan.
le "> 2. mikromanipulator Setup

  1. Kontroller at microinjectors er fuldt lastet med olie, og at der ikke er nogen luftbobler i systemet (bobler i mikroinjektor forhindre fin kontrol af injektion).
  2. Kontroller at mikromanipulatorer er i midterposition. Dette vil give mulighed for en bred vifte af bevægelse af pipetter.
  3. Sæt bedrift pipette i mikromanipulator holderen til venstre og injektionspipetten i mikromanipulering holderen til højre.
  4. Lad olien til at indgå i pipetterne af kapillære kræfter, og kontrollere, at systemet fungerer korrekt ved at flytte olie op og ned inde i pipetten ved hjælp af mikroinjektor kontroller.
    Bemærk: Hvis der ikke er bevægelse af olie inde i nåle, kan der være en træsko. I dette tilfælde skal du bruge en ny nål.
  5. Brug mikromanipulator kontroller for at bringe pipetterne ind til centrum af mikroskopets synsfelt. Brug 4X forstørrelse, kontrollere, at mikropipette tip er i den korrekte vinkel (parallel til bunden af ​​skålen).
    Bemærk: En korrekt opsætning af nålene er nøglen til en vellykket injektion og efter resultater konsistens.
  6. Kalibrere lasersystemet følge fabrikantens kalibrering manual.

3. Fremstilling af Injection Dish (figur 2)

  1. Placer en 50 pi dråbe opvarmet (37 ° C) SOF-HEPES (sammensætning beskrevet i afsnittet materialer) suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS) på midten af ​​låget på en 100 mm petriskål. Placer en 1 - 2 pi dråbe af opløsningen, der skal injiceres tæt ved injektion drop. Sørg for, at embryoner ikke køle ned under RT
    Bemærk: I denne protokol vil vi tilføje Dextran-Rød farvestof til intravenøse opløsning at kunne visualisere injektionsstedet og spore det senere.
  2. Dæk dråberne i injektionspladen under anvendelse af ca. 10 ml mineralolie.
  3. Placer indsprøjtning parabol på scenen af ​​den omvendt mikroskop og bringe pipettes ind injektionen dråbe. Kontroller, at nålene er i fokus inden i drop. Juster deres højde efter behov ved hjælp af mikromanipulator kontroller.
  4. Ved hjælp af en mikrodispenser, indlæse omkring 20 - 30 zygoter (17 - 20 timer post-befrugtning (HPF)) i den øvre side af injektionen dråbe. Udfør indsprøjtning ved rumtemperatur så antallet af embryoer i injektionsvæsken dråbe bestemmes af den hastighed, hvormed personen kan injicere dem. Læg ikke flere fostre, end dem, der kan injiceres i 30 min.
    1. For at indlæse embryoner ind i mikrodispenser, trykkes stemplet fuldt ud og dyppe spidsen i opløsningen indeholdende embryoner. Røre embryoner til afhentning med spidsen af ​​glasset kapillar (en dengang) og langsomt frigive stemplet så hver embryo kommer ind i kapillarrøret. Gentag dette indtil alle embryoner tages op eller den mikrodispenser kapaciteten er fuld.
    2. For at frigøre de indlæste embryoner, trykkes stemplet forsigtigt, indtil hele mængden containing embryonerne frigøres fra kapillarrøret.

4. Mikroinjektion

  1. Brug af 4X objektiv, indlæse opløsningen, der skal injiceres i injektionspipetten ved at påføre undertryk (opsugning). Indlæse tilstrækkelig opløsning til at injicere 2 - 3 zygoter. Derefter flytte til injektion drop.
  2. Inden injektion drop, flytte holde pipetten, så spidsen kommer tæt på en zygote Påfør undertryk (aspirat) med den bedrift mikroinjektor så zygote får fast til bedriften pipette og skift til en 20X mål.
  3. Når zygote er knyttet til bedriften pipette, kontrollere dens kvalitet ved hjælp af indsprøjtning pipette til forsigtigt at flytte embryo rundt uden at afmontere det. En god kvalitet zygote bør have de to polære organer (selvom nogle gange kun én ses) og en homogen cytoplasma. Injicer ikke unormale zygoter (figur 3A).
  4. Hvis det er nødvendigt, flytte embryo for en ordentlig indsprøjtningbeliggenhed. En god positionering ville være den, hvor der er en vis afstand mellem ZP og PM, så PM ikke bliver beskadiget af laseren.
  5. Kontroller at injektionspipetten er placeret på fosterets midterplan ved forsigtigt at røre zygote på injektionsstedet. Hvis det ikke er på sin midterplan vil nålen tendens til at gøre embryo rotere i stedet for punktering. Justere højden af ​​injektionspipetten efter behov.
  6. Lave et hul i ZP hjælp af en laser (figur 3B).
    1. Brug af laser software sted laser reticle i ZP hvor der vil blive gjort hullet (på den modsatte side, hvor fosteret er knyttet til bedriften pipette). Brug af vinduet klik på knappen brand laser kontrol. Sikre, at størrelsen af ​​hullet er stort nok til at skabe en åbning i ZP for nålen at passere gennem uden at beskadige PM (Eksempel: 0,662 msek Pulse bredde / 6,9 um Hulstørrelse).
  7. Passere injektionsnålengennem hullet i ZP og komme i kontakt med PM. Fortsæt skubbe pipetten fremad, indtil nålen er ¾ af vejen ind embryo (figur 3C).
  8. Observere positionen af ​​menisken på løsningen-olie interfase, da dette vil blive brugt til konsekvent at styre indsprøjtning volumen.
  9. Påfør undertryk (aspirat) på injektionspipetten, hvilket vil resultere i PM og cytoplasma bliver opsuget i kanylen. Fortsæt indtil bevægelsen af ​​cytoplasma ind i nålen accelererer eller når cytoplasma indhold sammenblanding med injektionsopløsning kan ses. Disse vil indikere brud på PM (figur 3D).
  10. Injicer tilbage den cytoplasmatiske indhold efterfulgt af opløsningen ind i cytoplasmaet af zygote ved påtrykning af positivt tryk (indsprøjtning), indtil menisken ved løsningen-olie interfase har avancerede en zygote diameter svarende forbi startpunktet.
    Bemærk: Under vores betingelser, denne repræsenterer ca. 7 pl af injiceret opløsning (figur 3E).
  11. Skift til en 4X objektiv og flytte det injicerede embryon / s til den nedre side af injektionen dråbe. Slip embryo ved at anvende positivt tryk på bedriften mikroinjektor. Opbevar de ikke-injicerede embryoner på oversiden og de injicerede dem på den nedre side af dråben til at holde styr på de injicerede / ikke-injicerede embryoner og arbejde effektivt.

5. Embryo Recovery og Injection Resultater

  1. Foretag 3 dråber ca. 200 pi i en ny skål med forvarmet SOF-HEPES. Indsamle de injicerede embryoner bruger mikrodispenser (som beskrevet ovenfor). Vask de injicerede embryoner ved at flytte dem gennem 3 SOF-HEPES dråber.
  2. Tæl embryoner lyserede under mikroinjektion og kassere dem.
    Bemærk: En lyserede zygote let kan skelnes fra en intakt en siden den første synes gennemsigtigt, udfylde hele ZP, og det som regel er cytoplasmatiskindhold lækker til ydersiden af ​​embryoet.
  3. Eventuelt kontrollere mikroinjektion effektivitet ved hjælp af en fluorescerende mikroskop. Vær opmærksom på at UV-lys eksponering kan fremkalde embryo skader, der kan påvirke efterfølgende udvikling.
  4. Kultur grupper af 25 injicerede embryoner i 50 pi dråber kalium simplex optimering medium (KSOM) suppleret med 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) under mineralolie ved 38,5 ° C, 5% CO2 i luft, og fugtighed til mætning.
  5. Supplere dyrkningsmediet med 5% FBS to dage efter injektion.
  6. Check blastocyst (BL) satser 7 dage efter injektion. Beregn BL satser som samlede antal blastocyst embryoner / samlede antal embryoner dyrket i den drop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laser-assisteret cytoplasmatisk mikroinjektion er en kraftfuld og pålidelig protokol til at levere løsninger i cytoplasmaet af husdyr zygoter. Figur 3 viser en generel oversigt over de zygoter før og efter injektion samt den samlede oversigt over teknikken. Dextran-rød anvendes som injicere opløsningen for at tillade sporing injektionsstedet og injektion effektivitet og nøjagtighed. Vellykket levering af opløsningen er vist i figur 4, der viser en nyligt indsprøjtet embryo, hvori farvestoffet er homogent fordelt i cytoplasmaet. Brug af denne teknik 100% af embryonerne injiceres i deres cytoplasma.

Denne protokol har vist at have minimal lysis satser i kvæg og får zygoter. Kun 15,6 ± 5 og 5,8 ± 3,9% af de injicerede embryoner blev lyseret i kvæg og får, henholdsvis som følge af mikroinjektion figur 6, er der ingen statistisk signifikante forskelle i blastocyst udviklings- satser i kontrol versus injicerede grupper for både bovine (32,8 ± 6,6% kontrol, 31,4 ± 5,9% injicerede) og får embryoner (40.3 ± 7.8 kontrol, 30,3 ± 6,0% injiceret).

Disse resultater indikerer, at laser-assisteret intracytoplasmatisk injektion forårsager minimal skade under injektion og resulterer i normale blastocyst udviklings- satser.

figur 1
Figur 1: En generel Diagram Viser hvordan man laver den bedrift og Injektion Pipetter. AB) Injektion pipette, CE) Holding pipette. A) røre forsigtigt glødetråd med trukket pipette på den ønskede diameter (5 um). Aktiver kortvarigt varmelegeme (viste i o rækkevidde). Dette vil lidt smelte pipetten, så det klæber til glødetråden, og efter afkøling, vil pipetten pause på kontaktpunktet generere et lige snit. B) Lav og vinkel i pipetten ca. 0,5 cm fra spidsen ved at placere pipetten omkring 10 um væk fra glødetråden varmelegeme. Opvarmningen fortsættes, indtil den ønskede vinkel er opnået. C) Brug en diamant spids pen til at markere og klippe bedriften pipette på den ønskede diameter (180 um). D) i en lodret position, brand-polish spidsen af bedriften pipette, indtil den når den ønskede indvendige diameter (40 um). E) Lav en vinkel på pipetten bringe pipetten tilbage til en vandret positionering et par um væk fra glødetråden og ca. 0,5 cm fra dens spids. Aktiver varmeren at bøje pipetten over glødetråden. Opvarmningen fortsættes, indtil den ønskede vinkel er opnået. Se 8,9,10 for yderligere oplysninger om, hvordan man laver nåle.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:.. General Setup af Injektion Dish Arrangement af pipetter, dråber, og embryoner vises i denne tegning Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Laser-assisteret Intracytoplasmatisk Injection Protokol A) En generel diagram over en zygote knyttet til bedriften pipette før injektion. PB: Polar organer, ZP: zona pellucida, Cyt: Cytoplasma, PN: pronuclei, PM: Plasma membrane, HP: holde pipette, IP:. injektion pipette BE) Mikroinjektionsteknikker trin: B) Kom et hul i ZP af en zygote knyttet til bedriften pipette hjælp af en laser C) Indføre injektionspipetten mod den modsatte side af embryo. . Kontrollere positionen af menisk (a). D) Break plasmamembranen ved sugning cytoplasmatiske indhold inde injektionspipetten. E) Injicer tilbage cytoplasmatisk indhold og opløsningen op i zygotisk cytoplasma, indtil menisken når en zygote diameter (b) forbi startpunktet . Afstand ab betegner ~ 7 pl af injiceret opløsning. F) et generelt diagram af en zygote efter injektion. Bemærk, at den injicerede løsning homogent spredes til cytoplasmaet. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 4:.. Repræsentant figur af en injiceret Zygote med Dextran-rød A) Bright felt billede af den injicerede zygote B) Fluorescerende billede af den injicerede zygote Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Andel af Lyserede embryoner efter Zygote Mikroinjektion i to forskellige arter data repræsenterer 4 replikater for kvægembryoner (i alt 103 injicerede zygoter) og 3 replikater for fåre- embryoner (i alt 173 injicerede zygoter). Fejl søjler repræsenterer sem Klik her for at seen større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6:. Blastocyst priser i kvæg og får embryoner data repræsenterer 4 replikater for kvæg med i alt 102 injiceres og 156 kontrol embryoner og 3 replikater for fåre- arter med i alt 163 injiceres og 239 kontrol embryoner. Fejl søjler repræsenterer sem Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion af zygoter er en veletableret metode til at indføre løsninger i mammale embryoer. Med visse variationer afhængige af arten og formålet med eksperimentet, kan denne teknik anvendes bredt. Vi viser, hvordan man udfører intracytoplasmatisk mikroinjektion anvendelse af en laser til at bistå indgangen af ​​en stump-ende mikropipette. Zygoter af nogle dyrearter (såsom kvæg, får og svin) har en mørk cytoplasma, hindrer visualisering af injektionspipetten gang inde embryoet. Også deres plasma membraner er meget elastisk, hvilket gør deres penetration med en skrå spiked nål (normalt bruges til at indsprøjte zygoter af gnavere) hårdt for at opnå. For at overvinde disse begrænsninger anvendte vi en laser til at muliggøre passage af en stump-ende nål gennem zona pellucida og den efterfølgende aspiration af cytoplasmatisk indhold for at sikre brud på plasmamembranen og frigivelsen af ​​opløsningen inde i cytoplasmaet af embryoet. Desuden ved injecting i den modsatte side af nålen indgangen (omkring 3/4 inde i embryo) vi sigter mod at fortrænge PN og dermed undgå deres aspiration / injektion. Desuden giver det mere kontaktpunkt for den brudte membran til at helbrede, hvilket resulterer i lavere lysis satser.

Producerer gode mikropipetter (specielt den intravenøse pipette) og passende indstille dem ind i mikromanipulator er nøglen til at opnå gode resultater med denne teknik. Injektionsnålen kan anvendes, så længe injektionsopløsningen bevæger sig jævnt inde i nålen. Nogle gange bliver cytoplasmatisk indhold eller endda pronuclei indhold fast inde i spidsen af ​​nålen, hvilket får strømmen til at løbe ujævnt og komplicerende injektion (dette øger også lyse- satser og forsinker processen). Udskiftning af kanylen, når det sker, er nødvendig for at opnå optimale resultater med denne protokol. Den tid, at embryonerne er uden for inkubatoren er afgørendeat få konsistente overlevelsesrater og bør ikke overstige 30 min. Efter uddannelse og praksis, operatører normalt opnå en injektion hastighed på 1-2 injicerede embryoner i minuttet. Et andet centralt punkt for succes i denne protokol er at konsekvent injicere den samme mængde volumen opløsning pr embryo. Dette kan let og nøjagtigt styret ved at observere forskydningen af ​​opløsningen-olie grænsefladen menisken. Det er vigtigt, at pipetten diameter er konsistent mellem manipulationer og at spidsen har en regelmæssig og konstant diameter. Med 5 uM ID pipetter på spidsen, en 7 - er 10 pl injektion volumen opnås ved at indsprøjte svarer til en zygote længde. Over-injektion resulterer ofte i embryo lyse.

Ved hjælp af denne protokol, er 100% af embryonerne injiceres korrekt i cytoplasmaet, helt at undgå falsk perivitelline plads injektioner (figur 4). Dette maksimerer pålidelighed og reproducerbarhed af assayet bliver gjort (uanset den injicerede opløsning) da resultaterne udelukkende skyldes virkningen af ​​den injicerede opløsning og ikke til injektion uoverensstemmelser. Nogle af de injicerede zygoter vil normalt lysere på grund af mekaniske skader under injektion. En sædvanlig overlevelsesraten efter injektion er 75% 11. Under anvendelse af denne metode, er vi i stand til at få minimale satser af lyserede embryoner (figur 5). Også blastocyst udviklings- var sammenlignelig med ikke-injiceret (kontrol) embryoner (figur 6), der angiver, at injektionen teknik har nogen skadelige virkninger på tidlig embryo udvikling. Effektiviteten af denne protokol blev for nylig sammenlignet med den konventionelle cytoplasmatiske mikroinjektion protokol (direkte cytoplasmatisk mikroinjektion ved anvendelse af en skrå spiked glas nål uden anvendelse af laseren til at trænge de ZP) til injektion af bovine zygoter 5. Resultaterne viste signifikant højere lyserede embryoner og lavere blastocyster dannelse for direkte cytoplasmic mikroinjektion. Vi mener, at disse forskelle skyldes mindre mekanisk beskadigelse under nål penetration, når du bruger laser-assisteret cytoplasmatisk mikroinjektion, hvilket gør denne protokol den foretrukne til indsprøjtning husdyrarter i vores laboratorium.

Her præsenteres data for kvæg og får embryoner fremstillet ved in vitro-befrugtning, men har også testet protokollen hjælp i-vivo og in-vitro svin embryoner opnå lignende resultater (data ikke vist). Afhængigt af den injicerede opløsning, kan denne protokol anvendes til mange anvendelser. For nylig har vi brugt det til at indføre en CRISPR / Cas9 system til at knock-out specifikke gener på in vitro-befrugtede kvægembryoner og fundet en høj andel af sekventerede blastocyster med mutationer: 50% af embryonerne (n = 6) havde biallele mutationer , 33% (n = 4) havde monoallelisk mutationer, og 17% (n = 2) var vild-type 5. Denne protokol har været meget pålidelig og kan anvendes iflere arter og et væld af anvendelsesmuligheder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8, (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27, (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9, (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10, (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60, (4), 433-438 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats