Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
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Genetics

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Summary

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Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

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Abstract

Introduction

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel 1 macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet.

Zytoplasmatischen Mikroinjektions hat Vorteile gegenüber pronukleären Mikroinjektions da es einfacher ist , durchzuführen und verursacht auch weniger Schaden an den injizierten Embryos, in höheren Lebensfähigkeit resultierende 2. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine erfolgreiche Methode für die Bereitstellung von Lösungen in das Zytoplasma von landwirtschaftlichen Nutztieren Zygoten zu demonstrieren. Zu können auszuführenzytoplasmatischen Mikroinjektions mit hoher Effizienz auf Nutztieren Embryonen wird ein Laser zur Erzeugung eines Lochs in der Zona pellucida (ZP) und dann eine blunt-end Glasnadel für die Mikroinjektion verwendet. Diese Strategie zielt darauf ab, die mechanische Schäden am Embryo während der Injektion eingeprägt zu reduzieren. Dann Aspiration von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionsnadel erlaubt, effizient und sicher ein Bruch des PM zu gewährleisten, dass die Lösung in das Cytoplasma des Embryos geliefert wird.

Diese Technik wurde in Rinderembryonen zu liefern siRNA in die zygotic Zytoplasma 3,4 und erzeugen Mutationen mit Hilfe der Cluster regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR zugehörige System 9 (Cas9) System 5 bereits erfolgreich eingesetzt. Es ist auch geeignet (mit geringfügigen Modifikationen) bovine Cumulus-umschlossenen Oozyten 6 einzuspritzen. Hier haben wir unsere Injektionsprotokoll liefert einen Farbstoff beschreiben kann, dass anwendbar sein, jede des zu injizierendenired Lösung in die Zygote, und zeigen, dass diese Technik unter Verwendung minimaler Lyse verursacht und beeinflusst nicht die frühe Embryoentwicklung.

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Protocol

1. Mikropipette Produktion

  1. Injection Mikro
    1. Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln.
    2. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500).
    3. Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position.
    4. Bringen Sie die gezogen Pipette und die Mikroschmiede Heizwendel mit seiner Glasperle in den Fokus. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis die Heizwendel das Ziel erreicht Innendurchmesser (5 & mgr; m) zu messen.
    5. Stellen Sie die Hitze auf etwa 45% und vorsichtig auf die Pipette bringen, so dass es den Faden berührt. Aktivieren Sie kurz die Heizung. Dies wkrank schmelzen leicht die Pipette, so dass es auf den Faden und beim Abkühlen haftet, wird die Pipette an der Kontaktstelle brechen einen geraden Schnitt zu erzeugen.
      Hinweis: Die entsprechende Temperatureinstellung in diesem Schritt Schlüssel ist , da die Temperaturen zu hoch wird die Pipette Biegung machen und damit ein gerader Schnitt wird nicht möglich sein und die Temperaturen zu niedrig wird nicht ausreichen , um die Pipette (1A) zu schmelzen.
    6. Machen Sie einen ungefähren Winkel von 30 ° in der Nähe der Pipettenspitze durch etwa 10 & mgr; m entfernt von der Heizwendel zu positionieren. Stellen Sie die Temperatur auf 60%, und aktivieren Sie die Heizung.
      Hinweis: Dies wird die Pipette über das Filament biegen. Dieser Winkel ist erwünscht , so dass die Spitze der Nadel an der Oberfläche der Einspritzplatte ist parallel , wenn in den Injektor (1B) montiert ist .
    7. Griff Mikroinjektionspipette mit Vorsicht , da sie extrem scharf und zerbrechlich sind.
  2. Halten Mikro
    1. Legen Sie eine borosilicaß Glaskapillare (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und sperren.
    2. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es mit einem langen, selbst in einer dünnen Spitze führt verjüngen und parallele Wände (Beispiel: Wärme: 815; Ziehen: 20; Geschwindigkeit: 140; Zeit: 175; Druck: 200).
    3. die gezogener Pipette aus dem Abzieher Gerät und legen Sie es auf der Mikroschmiede Halter in horizontaler Lage vorsichtig entfernen. Stellen Sie den Fokus auf die Heizwendel und Pipette.
    4. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die Pipette Durchmesser und bewegen Sie die Pipette bis zu seinem Durchmesser über dem Glühfaden erreicht 180 & mgr; m zu messen.
    5. Bei der angegebenen Größe, markieren Sie die Glaskapillare mit einer Diamantspitze Stift und drücken Sie dann vorsichtig an der Spitze zog das Glas zu brechen. Dies sollte in einem geraden Schnitt (1C) zur Folge haben .
    6. Bewegen der Pipette in eine vertikale Position mit ihrer Spitze nahe des Filaments. Stellen Sie die Temperatur der Mikroschmiede bis 60%.
    7. Feuerpolitur der Spitze der Pipette mit Standardtechniken 7 , bis sie eine ID von 40 & mgr; m erreicht. Verwenden Sie das Okularstrichplatte die ID (1D) zu überprüfen.
    8. Stellen Sie sich einen Winkel auf der Pipette.
      1. Bringen der Pipette zurück in eine horizontale Position etwa 10 & mgr; m entfernt von dem Filament und 5 mm von seiner Spitze. Stellen Sie die Temperatur auf etwa 60% und aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen , bis ein gewünschter Winkel (von etwa 30 o) erreicht wird. Überprüfen Sie den Winkel visuell (Abbildung 1E).
        Hinweis: Die Pipette ist gewöhnlich angebracht an den Mikroinjektor bei einem ungefähren Winkel von 60 o gegenüber dem Boden des Einspritzschale. Die Spitze der Pipette gebogen ist, so dass es an den Boden der Schale parallel ist, die für die korrekte Einspritzung des Embryos in seinem mittleren Ebene notwendig ist.
le "> 2. Setup-Mikromanipulator

  1. Überprüfen Sie, ob die Mikroinjektoren voll mit Öl beladen sind und dass es keine Luftblasen im System (Blasen im Mikroinjektors verhindern feine Steuerung der Einspritzung).
  2. Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatoren in der Mittelstellung sind. Dies wird für eine breite Palette von Bewegung der Pipetten ermöglichen.
  3. Legen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulator Halter und den Injektionspipette in die richtige Mikromanipulationshalter.
  4. Lassen Sie das Öl in die Pipetten durch Kapillarität eingeben und prüfen, ob das System richtig, indem Öl nach oben und unten in der Pipette arbeitet die Mikroinjektors Kontrollen verwenden.
    Hinweis: Wenn es keine Bewegung von Öl in den Nadeln ist, könnte es eine Verstopfung sein. In diesem Fall verwenden Sie eine neue Nadel.
  5. Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Pipetten in die Mitte des Mikroskops Blickfeld zu bringen. Mit 4-fache Vergrößerung, überprüfen Sie, dass die Mikropipettenspitzen im richtigen Winkel sind (S.arallel an den Boden der Schale).
    Hinweis: Eine korrekte Einstellung der Nadeln für eine erfolgreiche Injektion Schlüssel ist, und für die Ergebnisse Konsistenz.
  6. Kalibrieren Sie das Lasersystem im Anschluss an die Kalibrierung Handbuch des Herstellers.

3. Herstellung von Injektions Dish (Abbildung 2)

  1. Ein 50 & mgr; l Tropfen erwärmt (37 ° C) SOF-HEPES (Zusammensetzung detailliert in dem Abschnitt Materialien), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) auf der Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale. Legen Sie 1 - 2 ul Tropfen der Lösung auf die Injektion Tropfen injiziert nahe zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen kühlen nicht unter RT unten.
    Hinweis: In diesem Protokoll werden wir die Dextran-Red-Farbstoff in die Injektionslösung hinzufügen zu können, die Stelle der Injektion zu visualisieren und sie verfolgen später.
  2. Decken die Tropfen in der Einspritzplatte mit etwa 10 ml Mineralöl.
  3. Setzen Sie die Injektion Schale auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die pipettes in die Injektions Tropfens. Überprüfen Sie, ob die Nadeln innerhalb des Tropfens im Fokus sind. Passen Sie ihre Höhe der Mikromanipulator Kontrollen nach Bedarf verwenden.
  4. Verwendung eines Mikrodispenser laden etwa 20 - 30 Zygoten (17-20 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) in der oberen Seite des Injektions Tropfens. Führen Injektion bei Raumtemperatur, so dass die Anzahl von Embryonen in der Injektionsabfall durch die Geschwindigkeit bestimmt, bei der die Person, die sie zu injizieren. Nicht mehr Embryonen als die Last, die in 30 Minuten injiziert werden kann.
    1. Um die Embryonen in die Mikrodispenser laden, drücken Sie den Kolben vollständig und tauchen Sie die Spitze in die Lösung, um die Embryonen enthalten. Berühren Sie die Embryonen werden mit der Spitze der Glaskapillare (einer zu der Zeit) aufgenommen und langsam loslassen der Kolben, so dass jeder Embryo in die Kapillare gelangt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen aufgenommen oder der Mikrodispenser Kapazität voll ist.
    2. Zum Lösen der geladenen Embryonen, drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis das gesamte Volumen containing die Embryonen aus der Kapillare freigesetzt.

4. Mikroinjektions

  1. Mit dem 4X Ziel, laden Sie die Lösung in die Injektionspipette injiziert werden durch Unterdruck Anwendung (Absaugen). Laden ausreichende Lösung einzuspritzen 2 - 3 Zygoten. Gehen Sie dann auf die Injektion Tropfen.
  2. Innerhalb der Injektion Tropfen, bewegen Sie die Haltepipette so die Spitze zu einer Zygote nahe kommt. Bewerben Unterdruck (absaugen) mit dem Halte Mikroinjektors so die Zygote in die Haltepipette und Wechsel zu einem 20x-Objektiv befestigt wird.
  3. Sobald der Zygote an die Haltepipette befestigt ist, überprüfen Sie die Qualität der Injektion Pipette vorsichtig auf die Embryo bewegen, ohne sie zu lösen. Eine gute Qualität Zygote sollten die beiden Polkörper (wenn auch manchmal nur einer zu sehen ist) und ein homogenes Zytoplasma. Nicht abnormal Zygoten (3A) zu injizieren.
  4. Falls notwendig, die Position des Embryos für eine korrekte EinspritzungLage. Eine gute Positionierung wäre, dass in der es etwas Platz zwischen dem ZP und dem PM, so dass die PM nicht durch den Laser beschädigt werden.
  5. Überprüfen Sie, ob die Injektionspipette auf den Embryo Mittelebene angeordnet ist, indem Sie an der Zygote an der Injektionsstelle zu berühren. Wenn es nicht auf seine Mittelebene ist, wird die Nadel dazu neigen, den Embryo zu machen, anstatt Einstich drehen. Stellen Sie die Höhe der Injektionspipette nach Bedarf.
  6. Machen Sie ein Loch in der ZP mit einem Laser (3B).
    1. Mit Hilfe der Software statt des Lasers die Laser Absehen in der ZP, wo das Loch wird (auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Embryo in die Haltepipette angebracht ist) hergestellt werden. Mit dem Laser-Steuerungsfenster klicken Sie auf den Feuerknopf. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs groß genug ist, um eine Öffnung in der ZP für die Nadel zu schaffen passieren, ohne die Uhr zu beschädigen (Beispiel: 0,662 ms Pulsbreite / 6,9 um Lochgröße).
  7. Übergeben Sie die Injektionsnadeldurch das Loch in dem ZP und kontaktieren den PM. Weiter die Pipette nach vorne schieben , bis die Nadel ¾ der Weg in den Embryo (3C) ist.
  8. Beobachten der Position des Meniskus an der lösungs Öl Interphase, wie dies konsequent verwendet wird, um Injektionsvolumens steuern.
  9. Bewerben Unterdruck (absaugen) an der Injektionspipette, die in PM und dem Zytoplasma in die Injektionsnadel abgesaugt führen wird. Fortfahren, bis die Bewegung des Zytoplasma in die Nadel beschleunigt oder wenn Zytoplasma Inhalt mit Injektionslösung vermischen gesehen werden kann. Dies zeigt an Bruch des PM (Figur 3D).
  10. Injizieren Sie die Cytoplasma-Gehalt durch die Lösung in das Zytoplasma der Zygote durch Anlegen positiver Druck (Injektion), bis der Meniskus an der Lösung Öl Interphase folgte wieder ein Durchmesser von Zygote Äquivalent hinter dem Ausgangspunkt fortgeschritten ist.
    Hinweis: Unter unseren Bedingungen, diese Vertresentiert etwa 7 pl der injizierten Lösung (Abbildung 3E).
  11. Wechseln Sie in ein 4X Ziel und bewegen Sie den injizierten Embryo / s an der unteren Seite des Injektions Tropfens. Lassen Sie den Embryo durch Anlegen positiver Druck auf die Halte Mikroinjektors. Halten Sie die nicht injizierten Embryonen auf der Oberseite und die injizierten, die auf der unteren Seite des Tropfens zu helfen, den Überblick über die injizierten / nicht injizierten Embryonen und effizienter zu arbeiten.

5. Embryo Recovery and Injection Ergebnisse

  1. Machen Sie 3 Tropfen von ca. 200 & mgr; l in einer neuen Schale mit vorgewärmten SOF-HEPES. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mit dem Mikrodispenser (wie oben beschrieben). Waschen Sie die injizierten Embryonen, indem sie durch die 3 SOF-HEPES bewegenden Tropfen.
  2. Zählen Sie die Embryonen während der Mikroinjektions lysiert und verwerfen sie.
    Hinweis: Ein lysiert Zygote von einem intakten ein leicht unterschieden werden kann, da die erste durchscheinend erscheint, die ganze ZP ausfüllen, und es hat in der Regel zytoplasmatischeGehalt an der Außenseite des Embryos undicht.
  3. Überprüfen Sie optional die Mikroinjektionseffizienz eines Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie, dass UV-Licht Exposition Embryo Schäden hervorrufen kann, die weitere Entwicklung auswirken können.
  4. Kulturgruppen von 25 injizierten Embryonen in 50 ul Tropfen Kalium simplex Optimierungsmedium (KSOM) , ergänzt mit 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) unter Mineralöl bei 38,5 ° C, 5% CO 2 in Luft und Feuchtigkeit bis zur Sättigung.
  5. Ergänzen Sie die Kulturmedien mit 5% FBS zwei Tage nach der Injektion.
  6. Prüfen Blastozyste (BL) Raten von 7 Tagen nach der Injektion. Berechnen BL Raten als Gesamtzahl der Blastozyste Embryonen / Gesamtzahl der Embryonen kultiviert in diesem Tropfen.

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Representative Results

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 veranschaulicht eine kürzlich injizierten Embryos zeigt , in dem der Farbstoff homogen im Cytoplasma verteilt. Unter Verwendung dieser Technik 100% der Embryonen in ihrem Zytoplasma injiziert werden.

Dieses Protokoll hat gezeigt, in Rinder- und Schaf Zygoten minimale Lyse Raten. Nur 15,6 ± 5 und 5,8 ± 3,9% der injizierten Embryonen wurden in Rindern und Schafen lysiert jeweils als Folge von Mikroinjektions Abbildung 6 gezeigt, gibt es keine statistisch signifikanten Unterschiede in Blastozyste Entwicklungsraten in der Kontrolle im Vergleich zu injizierten Gruppen sowohl für Rinder (32,8 ± 6,6% Kontrolle, 31,4 ± 5,9% injiziert) und Rinderembryonen (40,3 ± 7,8 Kontrolle, 30,3 ± 6,0% injiziert).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die lasergestützte intrazytoplasmatische Injektion verursacht eine minimale Schädigung während der Injektion und führt zu einer normalen Blastozyste Entwicklungsraten.

Abbildung 1
Abbildung 1: Ein allgemeines Diagramm zeigt , wie die Holding und Injection Pipettes zu machen. AB) Injektionspipette, CE) Haltepipette. A) Berühren Sie leicht den Faden mit der ausgezogenen Pipette auf den gewünschten Durchmesser (5 & mgr; m). die Heizung kurz aktivieren (gezeigt in o Angebot). Dies wird leicht die Pipette schmelzen , so dass es auf den Faden haftet und nach dem Abkühlen die Pipette an der Kontaktstelle zu erzeugen einen geraden Schnitt brechen. B) Stellen und Winkel in der Pipette etwa 0,5 cm von der Spitze weg von der Pipette zu positionieren 10 & mgr; m entfernt von der Heizwendel. Weiter Erwärmung bis der gewünschte Winkel erreicht ist. C) Mit Stift , um eine Diamantspitze zu markieren und die Haltepipette auf den gewünschten Durchmesser geschnitten (180 & mgr; m). D) in einer vertikalen Position, Feuerpolitur die Spitze der Haltepipette , bis es erreicht der gewünschten Innendurchmesser (40 um). E) auf der Pipette einen Winkel der Pipette zurück in eine horizontale Position ein paar & mgr; m entfernt von dem Glühfaden und etwa 0,5 cm von seiner Spitze zu bringen. Aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen, bis der gewünschte Winkel erreicht ist. Siehe 8,9,10 für weitere Details, wie Nadeln zu machen.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:.. General Setup von Injection Dish Anordnung von Pipetten, Tropfen und Embryonen werden in dieser Zeichnung angezeigt Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3:. Lasergestützte Intracytoplasmic Injektionsprotokoll A) Ein allgemeines Diagramm einer Zygote an der Haltepipette vor der Injektion angebracht. PB: Polkörper, ZP: Zona pellucida, Cyt: Zytoplasma, PN: Pronuklei, PM: Plasma membrane, HP: Haltepipette . IP: Injektionspipette BE) Mikroinjektions Schritte: B) Machen Sie ein Loch in der ZP einer Zygote an die Haltepipette befestigt mit Hilfe eines Lasers C) Führen Sie die Injektionspipette in Richtung der gegenüberliegenden Seite des Embryos. . Überprüfen Position des Meniskus (a). D) brechen die Plasmamembran von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionspipette abgesaugt. E) zytoplasmatischen Inhalt und Lösung in den zygotischen Zytoplasma Injizieren zurück, bis der Meniskus erreicht man Zygote Durchmesser (b) vorbei an der Ausgangspunkt . Die Entfernung ab repräsentiert ~ 7 pl der injizierten Lösung. F) ein allgemeines Diagramm einer Zygote nach der Injektion. Beachten Sie, dass die injizierte Lösung homogen in das Zytoplasma verteilt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 4:.. Repräsentative Abbildung eines injizierten Zygote mit Dextran-Rot A) Hellfeldbild des injizierten Zygote B) Fluoreszenzbild des injizierten Zygote Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5:. Anteil der Lysierte Embryonen nach Zygote Mikroinjektion in zwei verschiedenen Arten Daten repräsentieren 4 repliziert für die Rinderembryonen (insgesamt 103 injiziert Zygoten) und 3 Wiederholungen für die Rinderembryonen (insgesamt 173 injiziert Zygoten). Fehlerbalken stellen Sem Bitte hier klicken , um anzuzeigeneine größere Version dieser Figur.

Figur 6
Abbildung 6:. Blastozystenraten in Rinder- und Schaf Embry Daten repräsentieren 4 repliziert für die Rinderarten mit insgesamt 102 injiziert und 156 Steuer Embryonen und 3 repliziert für die Schafe mit insgesamt 163 injiziert und 239 Steuer Embryonen. Fehlerbalken stellen Sem Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der Injektionspipette einmal im Inneren des Embryos behindern. Auch sind ihre Plasmamembranen sehr elastisch, so dass ihr Eindringen mit einer abgeschrägten Stachel Nadel (in der Regel verwendet Zygoten von Nagetieren zu injizieren) schwer zu erreichen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Laser den Durchgang eines blunt-end Nadel durch die Zona pellucida und dem nachfolgenden Ansaugen von zytoplasmatischen Inhalten zu ermöglichen Bruch der Plasmamembran und die Freisetzung der Lösung innerhalb des Cytoplasmas des Embryos zu gewährleisten. Darüber hinaus kann durch INJEKTIERTng in der gegenüberliegenden Seite der Nadel Eingang (etwa 3/4 im Inneren des Embryos) wollen wir die PN zu verdrängen und damit ihr Streben / Injektion zu vermeiden. Darüber hinaus liefert diese mehr Ansprechpartner für die gebrochene Membran zu heilen, was zu niedrigeren Lyse Raten führt.

Die Herstellung guter Mikro (speziell die Injektionspipette) und in geeigneter Weise sie in die Mikromanipulator Einstellung ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen mit dieser Technik zu erzielen. Die Injektionsnadel kann so lange verwendet werden, wie die Injektionslösung innerhalb der Nadel bewegt sich reibungslos. Manchmal wird zytoplasmatischen Inhalt oder sogar Pronuklei Inhalt innerhalb der Spitze der Nadel stecken, so dass der Fluss ungleichmäßig laufen und Injektion zu verkomplizieren (dies erhöht auch die Lyse Raten und verzögert den Prozess). die Injektionsnadel zu ersetzen, wenn dies geschieht, ist notwendig, um optimale Ergebnisse mit diesem Protokoll zu erhalten. Die Menge an Zeit, die die Embryonen außerhalb des Inkubators sind entscheidendkonsistente Überlebensraten zu bekommen und sollte nicht mehr als 30 Minuten nicht überschreiten. Nach der Ausbildung und Praxis, Betreiber in der Regel eine Injektionsgeschwindigkeit von 1-2 injizierten Embryonen pro Minute erreichen. Ein weiterer wichtiger Punkt für den Erfolg dieses Protokolls ist es, stets die gleiche Menge an Lösungsvolumen pro Embryo injizieren. Dies wird einfach und genau durch Beobachtung der Verschiebung der lösungs Öl-Grenzfläche Meniskus gesteuert. Es ist wichtig, dass der Pipetten Durchmesser zwischen Manipulationen konsistent ist, und dass die Spitze eine regelmäßige und konstante Durchmessers. Mit 5 uM ID Pipetten an der Spitze, eine 7 bis 10 pl Injektionsvolumen wird durch Einspritzen der äquivalent zu einer Zygote Länge erreicht. Über Injektion führt oft zu Embryo-Lyse.

Unter Verwendung dieses Protokolls, 100% der Embryos richtig in das Zytoplasma injiziert wird , völlig falsch perivitellinen Raum Injektionen (Abbildung 4) vermieden wird . Dies maximiert die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays durchgeführt werden (unabhängig von der injizierten Lösung), da die Ergebnisse sind nur aufgrund der Wirkung der eingespritzten Lösung und nicht auf Injektions Inkonsistenzen. Einige der injizierten Zygoten wird in der Regel lysieren durch mechanische Beschädigung während der Injektion. Eine übliche Überlebensrate nach der Injektion beträgt 75% 11. Unter Verwendung dieses Verfahrens können wir minimal Raten lysiert Embryonen (Abbildung 5) zu erhalten. Auch Blastozyste Entwicklungsraten waren vergleichbar mit nicht-injizierten (Kontrolle) Embryonen (Abbildung 6), bezeichnet , dass die Injektionstechnik , keine nachteiligen Auswirkungen auf die frühe Embryoentwicklung hat. Die Effizienz dieses Protokolls wurde kürzlich im Vergleich zu dem herkömmlichen cytoplasmatische Mikroinjektionsprotokoll (direkte cytoplasmatische Mikroinjektions eine abgeschrägte spiked Glasnadel ohne die Verwendung des Lasers de ZP einzudringen) zum Einspritzen bovine Zygoten 5. Die Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Rate von lysierten Embryonen und niedrigere Steuersätze von Blastozysten Bildung für die direkte cytoplasmic Mikroinjektions. Wir glauben, dass diese Unterschiede zurückzuführen sind, auf weniger mechanische Beschädigung während des Eindringnadel bei der lasergestützten Cytoplasma-Mikroinjektions mit, so dass dieses Protokoll die bevorzugte für die Tierarten in unserem Labor zu injizieren.

Hier stellen wir Daten für die Rinder- und Schafembryonen , erhalten durch in-vitro - Fertilisation, sondern auch das Protokoll getestet unter Verwendung von in-vivo und in-vitro Schweineembryonen erhalten ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt). In Abhängigkeit von der injizierten Lösung kann dieses Protokoll für viele Anwendungen verwendet werden. Vor kurzem haben wir es verwendet , um ein CRISPR / Cas9 System einzuführen , bestimmte Gene zur Knock-out auf in-vitro - Rinderembryonen befruchtet und einen hohen Anteil an sequenzierten Blastozysten mit Mutationen gefunden: 50% der Embryonen (n = 6) hatte biallelic Mutationen , 33% (n = 4) hatte monoallelic Mutationen und 17% (n = 2) wurden Wildtyp - 5. Dieses Protokoll hat sich als sehr zuverlässig erwiesen und konnte in verwendet werdenmehrere Arten und unzählige Anwendungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118, (1), 163-170 (2000).
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