De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

Biology

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Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

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Abstract

Introduction

La investigación biológica requiere a menudo fenotipificación eficiente, lo que con frecuencia se asocia con algún tipo de análisis histológico 1-3. Esta necesidad es aún más evidente con los ambiciosos proyectos para interrumpir cada gen en el genoma del ratón 4. Estos análisis histológicos pueden variar desde la evaluación de la morfología celular y / o características anatómicas a la expresión de mapeo de genes específicos o proteínas a las células individuales. De hecho, una de las contribuciones fundamentales de la histología en el campo de la genómica es la posibilidad de asociar una señal molecular específica a una región o célula tipo específico.

Los métodos tradicionales de la histología, especialmente para los tejidos musculoesqueléticos, son a menudo mucho tiempo y laborioso, que requiere a veces semanas para arreglar, descalcificación, sección, mancha, e imagen de la muestra a continuación, analizar las imágenes a través de la interpretación humana. El análisis de señales moleculares múltiples, ya sea a través de inmunohistoquímica, en hybridizat situiones, o tinciones especiales, requiere múltiples secciones e incluso múltiples muestras para llevar a cabo adecuadamente. Además, estas respuestas múltiples no pueden ser co-localizan en la misma célula y a veces puede no ser co-localizada a una región específica dentro de una determinada muestra. Como el campo de la genómica y la epigenomics mueve a la era digital, el campo histológico también debe seguir el juego para proporcionar eficiente, de alto rendimiento, y el análisis automatizado de una variedad de señales moleculares dentro de una sola sección histológica.

De hecho, existe una demanda de mejora de las técnicas histológicas que se pueden asociar múltiples señales moleculares a células específicas dentro de una determinada muestra. Recientemente, se ha publicado un nuevo método cryohistological de alto rendimiento para la evaluación de varias medidas de respuesta dentro de una sección dada de tejido mineralizado 5-14. El proceso consiste en la estabilización de la sección criogénica con cryotape congelado, adherir la sección de cinta adhesiva de forma rígida a un portaobjetos de microscopio, yla realización de varias rondas de tinción y de imagen en cada sección. Estas rondas de imágenes son entonces alineados manualmente o por medio de la automatización de equipo antes de análisis de imagen (Figura 1). A continuación, presentamos los protocolos detallados de este proceso y proporcionar ejemplos en los que estas técnicas han mejorado nuestra comprensión de los diferentes procesos biológicos.

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Protocol

La Universidad de Cuidado de Animales institucional y el uso Connecticut Health Center aprobó todos los procedimientos con animales.

1. fijación e inclusión

  1. La eutanasia a los animales a través de asfixia con CO2 u otros métodos aprobados.
  2. Cosechar el tejido de interés (por ejemplo, las extremidades, vértebras, etc.) y el lugar en el 10% de formalina tamponada neutra a 4 ° C hasta que estén sujetas correctamente. Tenga especial cuidado de mantener la ubicación anatómica consistente antes de la fijación. Por ejemplo, fijar las extremidades con articulaciones en flexión constante, rotación interna, rotación externa y ángulos de 11. Por lo general, fijar las extremidades completas de ratón por 1 - 3 días.
    Precaución: La formalina es tóxico y debe ser manejado en una campana de humos, mientras que use el equipo de protección personal adecuado.
    Nota: El marco de tiempo de la fijación depende del tamaño de la muestra. Si el experimento permite, cortar y abrir el hueso va a mejorar la fijación del compartimiento ósea.Algunos especímenes pueden requerir la fijación de perfusión 15 para minimizar el fondo fluorescente (por ejemplo, señales fluorescentes débiles dentro de la médula ósea).
  3. Transferencia de especímenes de formalina al 30% de sacarosa hecho en 1x PBS y se incuba durante 12-24 horas a 4 ° C.
    Nota: Una vez se incubaron durante 12-24 horas, las muestras se pueden colocar a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Se recomienda este método de almacenamiento para los experimentos en los que los investigadores tienen la intención de integrar múltiples muestras en el mismo bloque, pero no pueden cosechar todas estas muestras al mismo tiempo (por ejemplo, los experimentos con múltiples puntos de tiempo).
  4. Retire las muestras de la sacarosa y diseccionar el exceso de tejido.
  5. Llenar un criomolde (tamaño del molde depende del tamaño de la muestra) una parte del camino con la crio medio de inclusión. Coloque la muestra en el molde de tal manera que el plano de corte de la región de interés es paralelo con la parte inferior del molde.
    Nota: Un ejemplo de la colocación de un tejido específico y la orientaciónse pueden encontrar en la Figura 2A - B.
  6. Coloque el criomolde en un pedazo de hielo seco hasta que una fina capa de crio incrustación se congela a medio y posteriormente se fija la pieza en su lugar. Llenar el volumen restante de la criomolde con crio medio de inclusión, mientras que el mantenimiento de la criomolde en la de gránulos de hielo seco.
  7. Coloque el criomolde en un recipiente que contiene 2-metil-butano previamente enfriado por hielo seco. Una vez que las muestras se congelaron por completo, retire criomoldes y sacuda el exceso de 2-metil-butano. Envolver criomoldes en celofán y colocar en un -20 ° C o -80 ° C congelador para su almacenamiento.
    Nota: Las muestras se pueden secar con el tiempo cuando se almacena en un medio de crio incrustación, especialmente a -20 ° C. Recomendamos el almacenamiento de las muestras durante más de 1 - 2 meses en medio de inclusión crio a -80 ° C o en sacarosa al 30% a -80 ° C (véase el paso 1.3).

2. seccionar los tejidos de la cinta estabilizada

  1. Eliminar los bloques de muestras del congelador y poner en cryostat con la temperatura ajustada entre -20 y -25 ° C.
  2. Retire el bloque de la criomolde y recortar el exceso de crio medio de inclusión con una hoja de afeitar.
  3. Coloque un poco de medio de crio incrustar en el disco de muestra y luego alinear el bloque de tal manera que la superficie de la platina es paralela a la superficie inferior del bloque de lo que se establece el plano de corte adecuada para la región de interés.
  4. Coloque el disco de espécimen en el criostato y permitir la crio medio de congelación de la incrustación.
  5. Coloque el disco de espécimen sobre la cabeza de muestra y ajuste la cabeza de tal manera que la hoja corte paralelos a la superficie del bloque de muestras.
  6. Recortar el bloque a un nivel dentro de la región de interés y cepille cualquier virutas de la superficie del bloque.
  7. Corte un pedazo de la cryotape lo suficientemente grande como para cubrir la región de interés y pre-enfriamiento en el criostato.
    Nota: Las piezas múltiples se pueden cortar de tamaños consistentes y se almacenan dentro de la cryosta durante el corte.
  8. Retire la cubierta no adherente de la cryotape agarrando la cinta por las lengüetas no pegajoso plata / oro con unas pinzas a continuación, colocar la cinta en el lado pegajoso-manzana más abajo.
  9. Aplicar presión a la cryotape usando el rodillo (Figura 2C).
  10. Hacer una sección (5 - 8 micras) utilizando el control automático del motor o de la rueda de corte manual de la criostato.
    Nota: Es una buena práctica para mantener el borde de la cryotape, ya que viene en el escenario de tal manera que la sección no cae fuera del escenario durante el corte (Figura 2D).
  11. Coloque el lado de la sección de tejido sobre un portaobjetos de microscopio de plástico dentro del criostato.
  12. Retire la corredera de plástico de la criostato y permitir que el medio de crio incrustación para fundir de manera que la sección se adhiere a la superficie del portaobjetos.
  13. Repetir el corte de secciones en serie o en otras regiones de interés.
  14. Una vez terminado, almacenar las secciones en una caja de portaobjetos unat 4, -20 o -80 ° C dependiendo de la longitud de almacenamiento requerido y las medidas de respuesta de aguas abajo. Por ejemplo, utilizar las diapositivas que van a ser teñidas para la actividad enzimática (véase 5.2 a 5.3) dentro de un mes si se almacena a 4 ° C.

3. La adhesión de las secciones para los portaobjetos del microscopio

  1. UV-curable método adhesivo.
    1. Etiquetar el portaobjetos de un microscopio.
      Nota: Para una mayor automatización, las muestras y las diapositivas se pueden marcar con códigos de barras.
    2. Aplicar una gota de adhesivo óptico activado UV-a dos portaobjetos de vidrio y utilizar el borde de un portaobjetos de plástico para extender una capa delgada de adhesivo sobre la superficie de los portaobjetos de vidrio.
    3. Cortar la pestaña plata / oro y sentar el lado sección de tejido fijado con cinta adhesiva en la de la primera diapositiva. Aplicar la sección en un movimiento de rodadura desde un borde al otro con el fin de minimizar la formación de burbujas atrapadas debajo de la cinta.
      NOTA: La primera diapositiva se utiliza para humedecer previamente la parte inferior de la camisetaque la cinta antes de colocarla en el segundo carro (permanente) (paso 3.1.4).
    4. Retirar la parte grabada desde la primera diapositiva y colocarla sobre la capa adhesiva de la segunda corredera (Figura 3A). Una vez más, tenga cuidado para evitar el atrapamiento de burbujas.
      NOTA: Este paso requiere práctica para dominar.
    5. Una vez que el número apropiado de secciones para el experimento dado se coloca en cada diapositiva, limpie el exceso de adhesivo de las áreas circundantes.
    6. Inspeccionar cada sección de cerca de burbujas o fibras por debajo de la cinta. Realizar esta inspección bajo un cristal de microscopio o lupa. Si hay obstrucciones, eliminar la sección individual, eliminar las obstrucciones y vuelva a aplicar a la lámina de vidrio.
    7. Una vez que se determina que no hay obstrucciones en las secciones grabadas, colocar los portaobjetos de microscopio bajo la luz UV negro durante 5 - 10 minutos a para reticular el adhesivo.
  2. método adhesivo Chitosan.
    1. preparar THe 1% adhesivo quitosano. Preparar la solución de ácido acético mediante la disolución de 0,25 ml de ácido acético concentrado en 100 ml de agua DI (0,25% v / v). Disolver 1 g de polvo de quitosano en 100 ml de solución de ácido acético y se agita la solución de O / N o hasta que se disuelva todo el polvo de quitosano.
      NOTA: La solución es estable a RT.
    2. Depositar una gota de solución de quitosano para cada sección que se colocará en la diapositiva.
    3. Cortar la pestaña plata / oro de la cinta y colocar a cada lado del tejido sección cerradas con cinta adhesiva sobre el adhesivo (Figura 3A). Tenga mucho cuidado para evitar el atrapamiento de burbujas.
    4. Una vez que todas las secciones se colocan en la diapositiva, incline la corredera arriba en uno de sus bordes largos y arrastre quitosano excesiva al borde inferior con unas pinzas.
    5. Colocar los portaobjetos en esta orientación en la parte superior de una toalla de papel en una caja de portaobjetos. La gravedad hará entonces que el exceso de quitosano a caer hacia abajo sobre la toalla, produciendo una capa plana y uniforme de quitosano.
    6. Place la caja de diapositivas con su tapa un poco abierta en el refrigerador O / N para permitir que el quitosano se seque.
      NOTA: Véase la Tabla 1 para una comparación entre los dos métodos adhesivos.

4. Aplicación de las marcas de referencia a las diapositivas

  1. Preparar la solución de marcador de referencia mediante la disolución de 50 l de verde y 50 l de microesferas rojas en 100 l de agua. Guardar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
  2. Coloque una punta de pipeta 10 l ó 20 l en la solución de microesferas. Añadir una pequeña gota de la solución de microesferas a cada sección adyacente a la región de interés (Figura 3C). Tenga cuidado de no obtener las microesferas dentro de la región de interés.
  3. Se secan los portaobjetos a TA (protegido de la luz) durante 30 minutos, si el procesamiento de las diapositivas en ese día. Si no es así, colocar los portaobjetos en una caja de portaobjetos a 4 ° C.
    Nota: Mientras la solución de microesferas se seca antes de hidratar los portaobjetos, el microspheres permanecerá adherido a las diapositivas durante varias rondas de manchas / formación de imágenes.

5. múltiples rondas de tinción

NOTA: Al elegir una secuencia de imágenes compatibles de, tinción y medidas de creación de imágenes, es posible detectar y co-localizar muchas señales biológicas en la misma sección de tejido. Cada ronda de imágenes / tinción / creación de las imágenes tiene que ser desarrollada por la pregunta histológico particular. La secuencia de imágenes / tinción / reimaging implica típicamente la adquisición de las señales fluorescentes endógenos (por ejemplo, GFP celular, colorantes de mineralización, in vivo sondas de imagen) en la primera ronda de imagen seguido de inmunotinción multiplexada fluorescente y múltiples rondas de manchas de la actividad enzimática. Por último, la sección se puede teñir con tintes cromogénicos (por ejemplo, H & E, azul de toluidina, safranina O, etc.) para resaltar la arquitectura del tejido. Que se presentan en esta sección son métodos personalizados adaptados deprotocolos disponibles comercialmente.

  1. Calceína tinción con azul de mineral acumulado
    NOTA: La calceína tinción con azul produce una superficie mineral consistente que es susceptible de análisis automatizado de imágenes a diferencia de las imágenes de campo oscuro o de contraste de interferencia diferencial (DIC). El problema con tinción de azul de calceína es que el espectro de fluorescencia se solapa con tetraciclina y etiquetado demeclociclina. Por lo tanto, si la muestra contiene estos minerales, las etiquetas de imagen en las etiquetas de la primera ronda de las imágenes antes de la tinción con azul de calceína.
    1. Si las señales endógenas dentro del tejido se crean imágenes de antes de esta etapa de tinción, sumergir las diapositivas de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1 x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
    2. Prepare 30 mg / ml de solución de azul de calceína en 2% de NaHCO3 (hecha por disolución de 2 g de NaHCO 3 en 100 ml de H2O y ajustaring a pH de 7,4 con HCl). Alícuota y almacenar la solución a -20 ° C.
    3. Sumergir los portaobjetos en una jarra Coplin con 1x PBS durante 15 minutos para hidratar las secciones, si no se ha hidratado de la ronda anterior.
    4. Retire los portaobjetos y secar la parte posterior y los bordes con una toalla de papel.
    5. Aplicar 100 - 500 l de solución de azul de calceína por portaobjetos y se incuba durante 10 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
    6. Lavar los portaobjetos en 1x PBS durante 10 min con 3 cambios.
    7. Aplicar ~ 200 l de glicerol al 50% en 1x PBS a cada diapositiva y montar la hoja de la cubierta.
    8. Eliminar el exceso de glicerol y secar el fondo de las diapositivas.
  2. Tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) tinción actividad enzimática
    NOTA: TRAP se expresa por múltiples tipos de células en el linaje hematopoyético, incluyendo los osteoclastos. La tinción TRAP presentado aquí utiliza un sustrato de la fosfatasa ácida de color amarillo fluorescente. Ciertas señales fluorescentes se OVERLAP con el conjunto de filtro personalizado amarilla incluyendo etiquetas de tetraciclina / demeclociclina mineralización, calceína tinte azul, y el contraste DAPI.
    1. Sumergir los portaobjetos de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
    2. Preparar Buffer 1 mediante la disolución de 9,2 g de acetato de sodio anhidro y 11,4 g de tartrato de sodio dibásico dihidratado en agua y llevando el volumen final a 1.000 ml. Ajustar el pH a 4,2 con ácido concentrado acético glacial (~ 1,5 - 2 ml). Almacenar la solución a 4 ° C durante un máximo de 12 meses.
    3. Preparar tampón 2 disolviendo 40 mg de nitrito de sodio en agua y llevando el volumen final a 1 ml. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por 1 semana.
    4. En el día de la tinción, preparar el tampón de reacción mediante la mezcla de 7,5 ml de tampón de 1 y 150 l de tampón de 2.
    5. Aplicar el tampón de reacción sin el sustrato a la diapositivas durante 10 - 15 min para equilibrar el tejido en el pH más bajo.
      Nota: El volumen típico es de ~ 200 l pero debe ser lo suficientemente grande como para cubrir todas las secciones.
    6. Diluir el sustrato de la fosfatasa ácida de color amarillo fluorescente entre 1:50 y 1: 100 en el tampón de reacción.
      NOTA: La dilución será dictada por la actividad de TRAP en la muestra.
    7. Verter el tampón de reacción fuera de las diapositivas y aplicar el tampón de reacción con el sustrato fluorescente de color amarillo a las diapositivas.
    8. Colocar los portaobjetos bajo la luz UV negro de ~ 5 min para activar el sustrato.
      NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo de la actividad TRAP en la muestra.
    9. Lavar los portaobjetos en 1x PBS durante 10 min con 3 cambios.
    10. Aplicar ~ 200 l de glicerol al 50% en 1x PBS a cada diapositiva y montar la hoja de la cubierta.
    11. Eliminar el exceso de glicerol y secar el fondo de las diapositivas.
      NOTA: El tampón TRAP ácida se decalcify las secciones. El beneficio añadido de la decalcificación es que ciertos colores estarán disponibles de nuevo para la tinción de aguas abajo (por ejemplo, etiquetas de mineralización). Por ejemplo, la tinción con azul de calceína se eliminará durante la tinción TRAP. Por lo tanto, DAPI de contraste se pueden obtener imágenes en este canal durante una ronda subsiguiente.
  3. La fosfatasa alcalina (AP) tinción actividad enzimática
    NOTA: Múltiples tipos de células que participan en la mineralización incluyendo los osteoblastos y condrocitos mineralizantes expresar AP. El sustrato Fast Red utilizada en este protocolo provoca tanto una señal roja y roja cromogénico fluorescente. Debido a esto, el sustrato cromogénico apagará señales fluorescentes en las regiones donde el sustrato precipita. Por lo tanto, lo mejor es hacer esta mancha tras explorar las señales fluorescentes que pueden ser apagado por el sustrato AP.
    1. Sumergir los portaobjetos de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Remove y secar las hojas de la cubierta.
    2. Preparar 1 M Tris disolviendo 12,1 g de Tris en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 9,5 con NaOH 1 M.
    3. Preparar 1 M MgCl 2 hexahidrato disolviendo 20,33 g de MgCl 2 en 100 ml de agua desionizada.
    4. Preparar 2 M NaCl disolviendo 11,68 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada.
    5. Preparar 100x (20 mg / ml) solución madre de Fast Red TR sal por disolución de 1 g de polvo en 50 ml de agua desionizada. Hacer 100 ml de alícuotas y almacenar a -20 ° C.
    6. Preparar 100x (10 mg / ml) de solución de naftol AS-MX stock de fosfato disolviendo 500 mg de polvo en 50 ml de N, N dimetilformamida. Hacer 100 ml de alícuotas y almacenar a -20 ° C.
    7. En el día de la tinción, preparar el tampón de AP mediante la adición de 1 ml de 1 M Tris, 0,5 ml de 1 M MgCl 2, 0,5 ml de 2 M NaCl y llevar el volumen final a 10 ml con agua desionizada (concentraciones finales: 100 mM Tris, 50 mM MgCl 2, NaCl 100 mM).
    8. Coloque AP bUffer en cada portaobjetos y se incuba en una cámara húmeda durante 10 minutos a RT.
    9. Preparar tampón de sustrato AP diluyendo 100x existencias de Fast Red TR Sal y naftol AS-MX a 1x en el tampón de AP.
    10. Verter tampón AP fuera de diapositivas y reemplazar con tampón sustrato AP. Incubar los portaobjetos durante 5 - 10 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
      NOTA: El tiempo de incubación será dictada por la actividad de AP de la muestra.
    11. Lavar los portaobjetos 3x en PBS 1x durante 5 minutos cada uno.
    12. cubierta de montaje se desliza con una solución de DAPI contratinción (dilución 1: 1000 de DAPI en 50% de glicerol en 1x PBS).
  4. Azul de toluidina O (TB) tinción cromogénica
    NOTA: Debido a que todos los pasos anteriores se crean imágenes de bajo montaje acuosa temporal en glicerol al 50% / solución de PBS, el paso cromogénico también se forma la imagen en condiciones acuosas. Sin embargo, la solución de tinción puede tender a filtrarse con el tiempo. Por lo tanto, se sugiere a la imagen del azul de toluidina tan pronto como sea posible después de la tinción.
    1. Sumergir los portaobjetos de ronda previa de imágenes en una jarra Coplin llena de agua desionizada hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
    2. Después de retirar la cubierta se desliza, reemplazar con agua fresca y se incuban los portaobjetos durante al menos 10 minutos para que las sales de PBS están suficientemente separados de los tejidos.
    3. Preparar la solución TB 0,025% en agua desionizada.
    4. Colocar los portaobjetos en la solución TB durante 1 - 5 min.
      NOTA: El tiempo de incubación depende de las preferencias del usuario, pero debe mantenerse constante en todas las muestras.
    5. Colocar los portaobjetos en la jarra de Coplin con toboganes de agua y lavado desionizada 3 veces durante 5 minutos cada uno.
    6. Hoja de la cubierta del montaje con un 30% de glicerol disuelto en agua desionizada (NO PBS 1X ya que esto hará que la mancha que se filtre hacia fuera del tejido). NOTA: Glicerol medio de montaje puede ser sustituido con jarabe de fructosa, que ayuda a prevenir la difusión de la mancha del tejido. Apreparar el jarabe de fructosa, se disuelven 30 g de fructosa en 10 ml de agua desionizada y se calienta a 60 ° C hasta que se disuelva.

6. múltiples rondas de Imaging

  1. Cargar las diapositivas en las bandejas de microscopio (Figura 3D).
    Nota: Las bandejas son resorte.
  2. Introduzca las bandejas en la pila de la bandeja del microscopio de barrido deslizable (Figura 3E).
  3. Haga clic en la lista de perfiles para cargar un perfil para cada diapositiva con tiempos de exposición apropiados para cada fluoróforo. Haga clic en el nombre de la diapositiva para nombrar cada diapositiva manualmente o dejar que el software lee el código de barras en la etiqueta de diapositivas. Haga clic en el botón de inicio de escaneado de vista previa para tomar una imagen de vista previa de la diapositiva.
  4. Establecer las regiones de interés en el asistente de detección de tejidos y guardarlos para posteriores rondas de formación de imágenes. Una vez que cada diapositiva es de configuración, inicie el proceso de análisis haciendo clic en el botón de inicio de escaneado.
    Nota: El sistema puede almacenar hasta 100 SLIdes a la vez.
  5. Una vez que la imagen ha terminado, exportar las imágenes de cada canal y la imagen redonda individuo como .tif o archivos .jpg para el montaje y análisis de imágenes.

7. Imagen de la Asamblea

  1. Método manual usando Photoshop (o software de edición de imágenes similar capaz de producir imágenes con capas).
    1. Abrir cada imagen canal individual de cada ronda de imágenes.
    2. Montar las imágenes individuales como capas dentro de una imagen compuesta. Para ello, haga clic en la capa en la paleta de capas de una imagen. A continuación, arrastre la capa en otra imagen. Esta operación de arrastrar y soltar creará una nueva capa en la imagen. Hacer esto para todas las demás imágenes. Como alternativa, utilice una secuencia de comandos (Archivo> Secuencias de comandos> Archivos de carga en la pila ...) para automatizar este proceso mediante la carga de múltiples archivos de imágenes como capas en una pila de imágenes.
    3. Una vez que cada imagen aparece como una capa individual en la imagen compuesta, haga doble clic en el nombre de capa para cambiar el nombre de layers como sea necesario para discernir los diferentes canales.
    4. Con el fin de ver a través de cada capa y crear una imagen verdaderamente compuesto, cambiar el modo de mezcla para cada capa de "Normal" a "de la pantalla" en la paleta de capas.
      Nota: Para acelerar este paso, cambiar una sola capa a la pantalla, a continuación, haga clic derecho en la capa, seleccione "estilo de capa copia", a continuación, resalte todas las demás capas y seleccione "estilo capa de pasta" para aplicar el estilo pantalla a la otra capas.
    5. Si se desea, disminuir la opacidad (valor de cambio a 10-40%) de la capa de cromógeno (es decir, azul de toluidina) para visualizar mejor las señales fluorescentes a través de la capa de cromógeno.
      Nota: El microscopio de exploración de azulejos utilizado en este protocolo tiene los portaobjetos en 3 bordes, lo que minimiza la cantidad de rotación que puede ocurrir a la diapositiva durante cada ronda de formación de imágenes. Por lo tanto, es mucho más fácil para el usuario para alinear manualmente las imágenes sin tener que girar imágenes derivadasde diferentes rondas de formación de imágenes.

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Representative Results

Un flujo de trabajo general para el de alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology

La figura 1 representa el flujo de trabajo general usado para esta técnica. Incluye varios pasos de fijación a través de varias rondas de formación de imágenes y, finalmente, la imagen de alineación / análisis. El proceso puede tomar tan poco como una semana para ir de la fijación de la muestra a través de 4 rondas de formación de imágenes, que es menos tiempo del que se tarda en decalcify este tipo de muestras. El orden de la formación de imágenes típicamente comienza con las señales endógenas que ya se encuentran en la muestra (por ejemplo, GFP, etiquetas de mineralización, etc.), entonces la inmunotinción fluorescente multiplexado seguido por ensayos de actividad enzimática fluorescentes (por ejemplo., TRAP, AP, etc.) y los ensayos de análisis del ciclo celular (por ejemplo, EDU) y finalmente termina con una mancha cromogénico (por ejemplo, azul de toluidina O, el dobladilloatoxylin, safranina O, etc.).

Ejemplo representativo de un juvenil articulación del tobillo 6

El propósito de este estudio en particular fue demostrar la correlación entre la expresión de los diferentes tipos de colágeno (es decir, COL1A1, Col2a1, y Col10a1) con mineralización de la fibrocartílago del sitio de inserción-tendón a hueso de Aquiles (es decir, entesis). Por lo tanto, se utilizó un triple de ratón transgénico reportero fluorescente incluyendo COL1A1-GFPTpz, Col2a1-PPC, y Col10a1-mCherry para identificar células que expresan cada transgén. La primera ronda de formación de imágenes era de la expresión del transgén endógeno de un ratón de dos semanas de edad, que corresponde a cuando los mineraliza entesis en el tendón de Aquiles (Figura 4B). A continuación, la segunda ronda de formación de imágenes se llevó a cabo en elmultifotónica microscopio para adquirir imágenes de la arquitectura de colágeno a través de dos fotones generación de segundo armónico (SHG, Figura 4C). Esta etapa se utiliza para identificar las células en la base de las fibras de colágeno dentro de la entesis. La tercera ronda de las imágenes fue un paso inmunotinción para Indian hedgehog (IHH), que es uno de los principales ligandos de señalización que promueve la mineralización de la entesis (Figura 4D). La cuarta ronda de las imágenes era tinción AP utilizando un kit de sustrato de fosfatasa alcalina azul, que provoca tanto la fluorescencia Cy5 y señales cromogénicos azul, para visualizar áreas de deposición mineral activa (Figura 4E). Por último, la quinta ronda de la imagen era tinción TB para visualizar las características anatómicas, incluyendo el contenido de proteoglicanos en el fibrocartílago (Figura 4F). Todas las imágenes fueron alineadas manualmente dentro del software de edición de imágenes. Los cinco rondas de formación de imágenes se llevaron a cabo durante un período de 4 días, que siguió a 3días de procesamiento de la muestra y seccionamiento (7 días en total).

Ejemplo representativo de una rodilla adulto Joint 11

El propósito de este experimento fue determinar los cambios de mineralización que ocurren en la entesis del ligamento colateral medial (LCM) de la rodilla después de la desestabilización conjunta a través de la sección transversal del ligamento cruzado anterior (ACL). cambios de mineralización se pueden ver en el MCL entesis tan pronto como dos semanas después de la cirugía en estos 3 meses de edad, los ratones. Para supervisar la aposición mineral del fibrocartílago dentro de la entesis, se le dio una etiqueta de minerales a los ratones en el día de la cirugía (demeclociclina) y el día antes del sacrificio (calceína) a las 2 semanas posteriores a la cirugía. Los ratones también incluyen los reporteros fluorescentes COL1A1-PPC y Col10a1-mCherry para controlar la expresión de colágeno de fibrochondrocyt no mineralizada y desmineralizadaes, respectivamente. La primera ronda de formación de imágenes era de las señales endógenas, que en este caso se correspondían con las proteínas fluorescentes y etiquetas de mineralización fluorescentes (Figura 5A). La segunda ronda incluido tinción TRAP para demostrar la expresión de esta enzima en fibrocondrocitos mineralizantes en el entesis, así como los osteoclastos en la médula ósea subyacente (Figura 5B). La tercera ronda fue AP tinción para demostrar regiones de mineralización activa de fibrocondrocitos así como osteoblastos del hueso subyacente (Figura 5C). Por último, se llevó a cabo la tinción de TB para la cuarta ronda (Figura 5D). Todas las imágenes fueron alineadas manualmente dentro del software de edición de imágenes. Una vez más, el tiempo total de la cosecha de tejidos de alineación de la imagen fue de 7 días.

Ejemplo representativo de hueso trabecular del fémur distal

(Figura 3B). Este proceso se llevó a cabo en 8 mujeres y 8 ratones macho a los 3 niveles diferentes dentro de la médula ósea, dando un número total de 12 diapositivas. Los marcadores de referencia (microesferas) se aplicaron dentro de la epífisis y la media de la diáfisis en los tramos secos (Figura 3C). Todas las 12 diapositivas fueron teñidas for calceína azul y la imagen de mineral acumulado (azul calceína) y las etiquetas de mineralización (calceína y alizarina complexone) durante la primera ronda de la imagen (Figura 6A). Las diapositivas fueron incluidas en la imagen para la actividad TRAP (Figura 6B) en la segunda ronda y la actividad de FA (Figura 6C) en la tercera ronda de la imagen. Por último, los portaobjetos se tiñeron con azul de toluidina en la cuarta ronda (Figura 6D). Los marcadores de referencia se obtuvieron imágenes durante cada ronda de imágenes, incluyendo la ronda cromogénico, y fueron alineados utilizando el software personalizado. Para dar una idea del rendimiento para este procedimiento, 32 huesos (16 fémures y 16 vértebras) fueron incorporados en 8 bloques, se tomaron 3 secciones de cada bloque, las secciones se distribuyen a través de 12 diapositivas, y las 12 diapositivas fueron imágenes 4 veces la producción de 96 pilas de imágenes compuestas. El tiempo total para llevar a cabo este experimento fue de 8 días.


Figura 1. Flujo de trabajo típico para el Protocolo. Los pasos generales incluyen: 1) la fijación del tejido, 2) la cinta estabilizada cryosectioning, 3) la adherencia de las secciones grabadas a portaobjetos de vidrio, 4) la aplicación de marcas de referencia, 5) de múltiples rondas de tinción y 6) proyección de imagen, y 7) el montaje de imagen, la alineación y el análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Incorporación de alto rendimiento y la cinta estabilizada cryosectioning. Debido a la estabilidad del cryotape ofrece, múltiples huesos se pueden incrustar adyacentes entre sí (AB) y seccionado de forma simultánea (CD). Un pedazo de hielo seco se utiliza durante elproceso de incrustación para fijar rígidamente los huesos en su lugar antes de la congelación de la totalidad de la crio-bloque (B). El cryotape se enrolla sobre el bloque (C) y la sección permanece pegado a la cinta durante el corte (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La adhesión de las secciones pegadas en Diapositivas de vidrio, Aplicación de Referencia Marcadores, y carga de diapositivas en la bandeja de Portaobjetos de microscopio de barrido. Secciones grabadas se pegan a la superficie del portaobjetos de vidrio con cualquiera de curado UV o adhesivo a base de quitosano (A ). Tras el curado o secado, sólo una fina capa plana de adhesivo permanece entre la superficie cryotape y vidrio (B). referencia markers se aplican a portaobjetos secos (C, flecha apunta a gota de la solución de microesferas). Portaobjetos se montan en bandejas de microscopio (D) y se cargan en el microscopio (E). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. cinco rondas de formación de imágenes del tendón de Aquiles de una de dos semanas de edad ratón. La pila de material compuesto (A) se creó a partir de cinco rondas de formación de imágenes. Ronda 1 (B): COL1A1 endógeno-GFPTpz, Col2a1-PPC, y la expresión del transgen Col10a1-mCherry. Ronda 2 (C): segunda generación de armónicos de colágeno (SHG) en el microscopio de dos fotones. Ronda 3 (D): inmunotinción para IHH. ronda 4(E): la actividad enzimática AP. Ronda 5: O azul de toluidina (F). Esta cifra ha sido modificado a partir de Dyment et al., 2015 6. La barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. cuatro rondas de Imaging de MCL entesis Siguiendo desestabilización Común. Las rodillas se desestabilizan en ratones de tres meses de edad, lo que lleva a un aumento de la mineralización de la entesis MCL. Una etiqueta mineral demeclociclina se le dio el día de la cirugía y una etiqueta de minerales calceína fue dado el día antes del sacrificio. Ronda 1 (A): COL1A1 endógeno-PPC, la expresión del transgen Col10a1-mCherry con etiquetas minerales demeclociclina y calceína. Ronda 2 (B) </ Strong>: la actividad enzimática TRAP. Ronda 3 (C): la actividad enzimática AP. Ronda 4 (D): O. azul de toluidina la trampa y la señal de AP que se revistió en la parte superior de la señal de la tuberculosis en los paneles antes de Cristo. El canal de amarillo puede ser utilizado de nuevo para TRAP porque el búfer de TRAP descalcifica el tejido, la eliminación de la etiqueta demeclociclina. Esta cifra ha sido modificado a partir de Dyment et al., 2015 11. La barra de escala = 200 micras. Dem: demeclociclina, TRAP: tartrato resistente a la fosfatasa ácida, AP: fosfatasa alcalina, MCL: ligamento colateral medial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. cuatro rondas de Imaging dentro de fémur distal que contienen microesferas marcadores de referencia. Tres meses micrófonoe se les dio etiquetas minerales calceína y complexone alizarina Ronda 1 (AA '):. calceína y complexone alizarain etiquetas endógenos, además de calceína tinción con azul de mineral acumulado Ronda 2 (BB.'): la actividad enzimática TRAP Ronda 3 (CC '). :. actividad enzimática AP ronda 4 (DD '): azul de toluidina O. las microesferas en bruto se obtuvieron imágenes en cada ronda (A'-D', la flecha indica la misma microesfera en todas las imágenes). Barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

adhesiva quitosano UV-curado del adhesivo
mecanismo adhesivo Evaporación UVPolimerización
Hora de curar > 24 hr <20 min
Pueden ser retirados después de secciones adhesivo se cura? No
Se cura soluble adhesivo? Sí, en soluciones ácidas con un pH bajo No
No soportar adhesiva recuperación de antígenos de calor? No
Es auto-adhesiva fluorescente? No Mínimas en el rango UV

Tabla 1. Comparación entre el quitosano adhesivo y adhesivo de curado UV

Cryotape Sistema de cinta de transferencia
Posible a la sección ósea mineralizada utilizando este sistema? Sí, pero los trozos de hueso mineralizadono podrá transferir por completo a la diapositiva
Posible sección articulaciones mineralizadas que utilizan este sistema?
Posible a la sección del cerebro usando este sistema? Sí, pero el tejido puede caerse de la cinta después de varias rondas de formación de imágenes
Posible cortar múltiples muestras incluidas en el mismo bloque?
Posible llevar a cabo múltiples rondas de formación de imágenes en la misma sección?

Tabla 2. Comparación entre el sistema y el sistema Cryotape cinta de transferencia

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Discussion

Aquí hemos presentado un protocolo detallado cryohistology co-localizar y cuantificar varias medidas biológicas mediante la alineación de imágenes de varias rondas de manchas / formación de imágenes en una sola sección. El método descrito mediante el cryotape es especialmente útil, ya que mantiene la morfología de difícil sección de tejido (por ejemplo, hueso mineralizado y el cartílago). Además, el tejido seccionado se adhiere firmemente a la lámina de vidrio, lo que permite múltiples rondas de tinción / formación de imágenes de la misma sección; a diferencia de los métodos tradicionales, donde las secciones de serie son cada tiñeron con un protocolo diferente. El uso de secciones seriadas puede plantear un problema cuando se trata de co-localizar señales entre las secciones, algo que no es un problema con las secciones individuales que han sido manchados y la imagen con múltiples rondas.

El primer producto de seccionamiento de tejido de cintas estabilizada en el mercado era un sistema de transferencia de cinta 16, 17. Utiliza cinta de plástico recubiertocon un adhesivo de temperatura fría que se coloca en la superficie de la cryoblock tejido. Cuando la cuchilla corta criostato debajo de la cinta, la sección se elimina intacto y adherente a la cinta. Posteriormente, la cinta se coloca cara de muestra hacia abajo en portaobjetos que están recubiertas con pegamento UV-curado de tal manera que el tejido se instala firmemente en la diapositiva. Una vez que la cinta se pealed lejos de la sección, la corredera puede ser procesada, ya sea para la fluorescencia o la histología cromogénico. La fluorescencia de fondo de los adhesivos es baja, y múltiples rondas de tinción y formación de imágenes funciona bien con la mayoría de los tejidos blandos. Sin embargo, con secciones mineralizadas, no puede haber pérdida de fragmentos minerales cuando se transfiere el tejido de la cinta adhesiva a los portaobjetos de vidrio. Además, es un sistema relativamente caro de instalar en el criostato (> $ 8000) y los costes de consumo son altos (> $ 2 / diapositiva).

Otra estrategia de estabilización de cinta desarrollada por el Dr. Kawamoto utiliza un Tadafumiadhesivo recubierto con película de cloruro de polivinilideno para capturar la sección de tejido. En su protocolo, un tejido fresco congelado se seccionó en la cinta e inmediatamente se fija en PFA o etanol 18. Posteriormente, la cinta se tiñe y después se monta en un portaobjetos de vidrio con el lado de la muestra hacia abajo para el examen microscópico. Así, cada protocolo de tinción se lleva a cabo en una sección grabada diferente.

Hemos modificado y se añade al protocolo Kawamoto en un número de maneras, incluyendo la fijación de la muestra en formalina antes de la incrustación. Este paso es crítico para fijar la GFP citoplasmática soluble de animales transgénicos en los límites de la célula. Hemos utilizado la cryotape para una amplia gama de tipos de tejidos 5-13. El personal de laboratorio con experiencia limitada histológico pueden producir secciones de alta calidad con este método. Las principales ventajas de este protocolo son el bajo costo relativo (sin instrumentos especiales, <$ 1,00 por diapositiva), sin pérdida de fragmentos minerales,y la capacidad para llevar a cabo múltiples rondas de tinción y formación de imágenes en la misma sección.

Debido imágenes de las mismas regiones de un portaobjetos varias veces en la repetición sería razonable para un gran número de diapositivas, incluso utilizando una plataforma motorizada, un paso más crítico de este protocolo es la utilización de un microscopio de barrido deslizable para aumentar la consistencia y el rendimiento. El microscopio es un escáner de diapositivas digital que funciona tanto en virtud de epifluorescencia y luz transmitida. Está equipado con una torreta motorizada de 10 posiciones y ambas cámaras B & N y color. La verdadera novedad del sistema, en nuestras manos, es que las regiones específicas de interés pueden ser rápida y fácilmente definidos por el usuario o detectarse automáticamente por el software de imágenes. Estas regiones de interés pueden ser salvados de la primera ronda de la imagen y luego vuelven a cargar rápidamente durante las rondas posteriores. Por lo tanto, las mismas regiones de interés se crean imágenes durante cada ronda de imágenes. Basado en el usuarioparámetros definidos en el software, el microscopio se enfoque automático y digitalizar imágenes en mosaico que se cosen durante la adquisición dentro de las regiones de interés.

El orden por el que el usuario realiza las múltiples rondas de tinción es importante. El orden general se describe en la Figura 1. El número de fluoróforos que pueden ser suficientemente separados a través de microscopía fluorescente es el factor limitante principal para el número de las medidas de respuesta que pueden ser adquiridos en una sección dada. Sin embargo, los canales fluorescentes pueden ser reutilizados en ciertos casos. Por ejemplo, calceína azul y demeclociclina tanto emiten una fuerte señal en el canal amarillo utilizado para medir la actividad TRAP. Este derrame se evita sin embargo porque el tampón TRAP descalcifica la sección, eliminando de este modo el mineral antes de la imagen de la actividad TRAP. Además, DAPI contratinción emitirá en el canal de color amarillo también. Sin embargo, el usuario puede sustituir con otro DAPI contratinción en THe gama de color rojo o rojo lejano. Además, los anticuerpos pueden separarse y volver a tiñeron con anticuerpos diferentes que utilizan los mismos canales fluorescentes. Por lo tanto, este método es muy adaptable a aumentar el número de medidas de respuesta que se pueden grabar en una sección dada.

Hay ciertas limitaciones con el protocolo presentado. 1) El cryotape puede no adherirse suficientemente a ciertos tejidos. Por ejemplo, el cerebro secciones fijadas en formalina tienden a caerse de la cinta después de varias rondas de tinción. Para tejidos como este, el sistema de transferencia de la cinta puede ser más apropiado que el tejido se adhiere a la superficie de vidrio por medio de adhesivo activado por UV-(véase la Tabla 2 para la comparación entre estos dos métodos). 2) El adhesivo quitosano, mientras que proporciona propiedades ópticas transparentes, no sobrevivirá a duras etapas de procesamiento que incluyen altas temperaturas o ácidos fuertes. Por lo tanto, el adhesivo activado por UV-es más adecuado para estas aplicaciones (véase la Tabla 1 fo comparación entre estos dos adhesivos).

Los protocolos cryohistological presentados aquí también se prestan a un mayor rendimiento y la automatización. Por ejemplo, la estabilización de la cinta proporcionada por el cryotape permite a los usuarios relativamente noveles para cortar varios huesos o articulaciones a la vez en el mismo bloque, lo que aumenta significativamente el rendimiento. El uso de un escáner automatizado reduce significativamente el tiempo y el coste técnico relacionado con la formación de imágenes, que típicamente ha sido la etapa limitante de la velocidad en nuestra experiencia. Ser capaz de manera consistente y fiable la imagen de la misma región de interés varias veces en un corto periodo de tiempo proporciona una plataforma para análisis automatizado, el objetivo de los tejidos. De hecho, nuestro grupo ha desarrollado una plataforma para la alineación y la histología del hueso automatizado por computadora. En primer lugar, el software alinea las múltiples rondas de imágenes basadas en los marcadores de referencia fluorescentes. A continuación, las imágenes alineadas se alimentan a una tubería histomorfometría donde el Computer software define la región de interés y mide objetivamente varias mediciones estáticas y dinámicas (ver más en www.bonebase.org) 13. Esta plataforma fue posible debido a la mayor rendimiento y consistencia proporcionada por el seccionamiento cryotape, portaobjetos de microscopio de exploración digital, y el software de análisis personalizado. Este protocolo representa un avance significativo en alta cryohistology rendimiento y debería ser de utilidad para las imágenes difíciles de tejidos de sección, como los huesos, así como aquellos sin experiencia con seccionamiento de tejido.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

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References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5, (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7, (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2, (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23, (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405, (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33, (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33, (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28, (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29, (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23, (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33, (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53, (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53, (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).

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