फेरिक क्लोराइड प्रेरित Murine घनास्त्रता मॉडल

Medicine

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Summary

हम फेरिक क्लोराइड (FeCl 3) मन्या और mesenteric धमनी पर प्रेरित घनास्त्रता मॉडल की एक परिष्कृत प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से नस, कुशलता विशेषता intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग thrombi गठन अंतरोधी करने के लिए समय की निगरानी के लिए रिपोर्ट।

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Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).

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Abstract

Introduction

धमनी घनास्त्रता (खून का थक्का) कई प्रणालीगत जीर्ण सूजन, atherosclerosis, मधुमेह, मोटापा, कैंसर और क्रोनिक स्व-प्रतिरक्षित rheumatologic विकारों सहित के साथ जुड़े रोगों की एक आम समस्या है। Thrombi कि अनुचित प्लेटलेट सक्रियण, एकत्रीकरण और बाद coagulatory तंत्र से धमनी संचलन स्टेम में पाए जाते हैं, और दिल के दौरे, स्ट्रोक और सिरा नुकसान में फंसा रहे हैं। पोत दीवार एक जटिल प्रणाली है कि अनेक प्रकार की कोशिकाओं में शामिल हैं और कतरनी तनाव सहित बाह्य कारकों में से एक भीड़ से प्रभावित है, पोत दीवार में रक्त कोशिकाओं, हार्मोन और साइटोकिन्स, साथ ही एंटीऑक्सीडेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति घूम रहा है। इन विट्रो प्रयोगों नकल नहीं कर सकते इस जटिल पर्यावरण और पशु मॉडल का उपयोग vivo अध्ययन में इसलिए थ्रोम्बोटिक विकारों में शामिल तंत्र की बेहतर समझ के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

चूहे सिम है दिखाया गया हैघनास्त्रता, atherosclerosis, सूजन और मधुमेह 1,2 के संदर्भ में मनुष्य के लिए ilar तंत्र। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों एक जटिल शारीरिक या वैकृत वातावरण में विशिष्ट जीन उत्पादों के समारोह का परीक्षण करने के लिए बनाया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन मानव विकृति की नकल और महत्वपूर्ण यंत्रवत नए रास्ते और चिकित्सा, की खोज से संबंधित जानकारी उपलब्ध करा सकता है और साथ ही थ्रोम्बोसिस पर दवा प्रभाव निस्र्पक में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं।

रोग धमनी thrombi subendothelial मैट्रिक्स 3,4 करने के लिए परत चोट या रोग और रक्त प्रवाह का जोखिम endothelial के कारण होते हैं। विभिन्न मॉडलों थ्रोम्बोसिस ऐसी यांत्रिक चोट, photoreactive यौगिक गुलाब बंगाल के ऑक्सीडेटिव चोट और लेजर चोट 5 के रूप में इस endothelial क्षति प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया है। इस स्पेक्ट्रम में, फेरिक क्लोराइड (FeCl 3) प्रेरित संवहनी चोट घनास्त्रता की एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल है। यह अभिकर्मक जबजहाजों के बाहरी पहलू के लिए आवेदन किया नाड़ी कोशिकाओं 6-8 oxidative नुकसान लाती है, प्लेटलेट्स और जमावट झरना के घटकों घूम से endothelial सेल संरक्षण के नुकसान के साथ। FeCl 3 मॉडल सरल और दोनों थक्कारोधी और विरोधी प्लेटलेट्स दवाओं के प्रति संवेदनशील है, और मन्या और ऊरु धमनियों, कंठ नसों, और mesenteric और cremasteric धमनियों और venules चूहों, चूहों, गिनी सूअरों और खरगोशों 6-15 में प्रदर्शन किया गया है।

इस मॉडल में एक औसत दर्जे का पैरामीटर चोट से गुजरे समय पोत रोड़ा, एक डॉपलर फ्लो मीटर के साथ या intravital माइक्रोस्कोपी 6,7,9 के साथ सीधे निगरानी में रक्त के प्रवाह को बंद करने के रूप में मापा पूरा करने के लिए है। 5 से 30 मिनट के बीच समय की एक सीमा C57BL6 चूहों 7-10,16 में अलग-अलग अध्ययनों में बताया गया है, सुझाव है कि FeCl 3 सांद्रता, संज्ञाहरण, शल्य चिकित्सा तकनीक, माउस उम्र, जीनोमिक पृष्ठभूमि, ख को मापने की विधि के प्रकारlood प्रवाह, और अन्य पर्यावरण चर इस मॉडल में महत्वपूर्ण प्रभाव है। इस व्यापक परिवर्तनशीलता यह मुश्किल विभिन्न अनुसंधान समूहों से अध्ययनों की तुलना करने और सूक्ष्म अंतर का पता लगाने के लिए मुश्किल बना सकता है बनाता है।

एक दृष्टि में इस तरह के variabilities को कम करने और इन विवो मॉडल प्रणाली में एक समान रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थापित करने के साथ, हम FeCl 3 प्रेरित कैरोटिड धमनी मॉडल डेटा न्यूनतम भिन्नता 6-10,16-19 के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है कि परिष्कृत किया है। इस पत्र में हम वर्णन है और कौशल का हिस्सा है और कई प्रतिनिधि प्रयोगात्मक उदाहरण है कि इस मॉडल से लाभ उठा सकते रिपोर्ट।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं और जानवरों की जोड़तोड़ संयुक्त राज्य अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति मानवीय देखभाल पर और पशु का प्रयोग करें, और देखभाल के लिए एनआईएच गाइड और के अनुसार क्लीवलैंड क्लिनिक के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है प्रयोगशाला पशु का प्रयोग करें।

1. तैयारी:

  1. लेबल प्लेटलेट्स के लिए फ्लोरोसेंट रंजक
    1. खारा में, rhodamine 6G समाधान, 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की तैयारी और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान बाँझ।
  2. FeCl 3 समाधान
    1. 30% FeCl 3 के एक ताजा स्टॉक समाधान करें शुद्ध पानी में (निर्जल, 1.85 मीटर के बराबर होती है), और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ फिल्टर। 5 मिलीलीटर ताजा FeCl वांछित एकाग्रता में 3 समाधान [जैसे, 2.5% (0.154 एम), 5% (0.308 एम), 7.5% (0.463 एम), 10% (0.617 एम) और 12.5% ​​(0.771 एम)] द्वारा तैयार करें गिराए पानी के साथ मैं 30% FeCl 3 समाधानna 6 सेमी टिशू कल्चर पकवान और ढक्कन रखने के साथ बंद हुआ।
      नोट: संस्कृति पकवान का उपयोग करना आसान फिल्टर पेपर यह इस तरह के एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के रूप में, एक संकीर्ण कंटेनर से लेने के लिए की तुलना में FeCl 3 समाधान के साथ संतृप्त लेने के लिए बनाता है। FeCl3 बेहद खतरनाक है और इस तरह के दस्ताने और प्रयोगशाला कोट आदि, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के रूप में सावधानियों, हमेशा के लिए लिया जाना चाहिए।
  3. फ़िल्टर पत्रों
    1. 1 मिमी x 2 मिमी आकार के लिए फिल्टर पेपर कट। एक ही थाली में FeCl 3 समाधान में कटौती फिल्टर पेपर के लिए पर्याप्त टुकड़े लेना।
  4. Papaverine हाइड्रोक्लोराइड समाधान
    1. पानी में papaverine हाइड्रोक्लोराइड समाधान (25 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान बाँझ।
  5. agarose जेल
    1. , 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में पीबीएस में 2% agarose जेल या खारा तैयार ~ 1 सेमी मोटाई, और ग~ 3 सेमी व्यास के साथ आधा सर्कल के लिए यह संघ राज्य क्षेत्र।

2. FeCl 3 प्रेरित कैरोटिड धमनी चोट घनास्त्रता मॉडल

  1. घनास्त्रता मॉडल के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं
    1. 12 सप्ताह पुरानी C57BL6 चूहों (या अन्य नस्लों के रूप में आवश्यक) - 8 का प्रयोग करें। intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) / xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के साथ चूहों anesthetize। पैर की अंगुली pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
      नोट: ketamine / xylazine की यह राशि कम से कम 1 घंटे के लिए स्थिर संज्ञाहरण में पशु और कोई दर्द (पैर की अंगुली बन्द रखो के जवाब) रखने के लिए पर्याप्त है।
    2. गर्दन और एक छोटे जानवर बिजली क्लिपर के साथ ऊपरी छाती पर फर निकालें। लोमनाशक क्रीम आवश्यक नहीं है। आँखों पर तटस्थ पेट्रोलियम आंख मरहम लागू संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए।
    3. 15 सेमी टिशू कल्चर प्लेट के ढक्कन पर लापरवाह स्थिति में माउस सुरक्षित। हिन सुरक्षित करने के लिए एक लंबी टेप (~ 10 सेमी) का प्रयोग करेंडी अंग और शरीर के निचले भाग, और छोटे टेप (2 सेमी x 0.5 सेमी) forelegs को सुरक्षित करने के दो टुकड़े। कृन्तक के आसपास लपेटो करने के लिए 4-0 सीवन का प्रयोग करें, ढकने के लिए सिवनी के दोनों सिरों टेप माउस गर्दन सीधी (चित्रा 2) रखने के लिए।
    4. ऑपरेटर की ओर माउस सिर के साथ थाली एक शल्य प्रकाश स्रोत के तहत रखें।
    5. शराब पैड के साथ शल्य साइट जीवाणुरहित। त्वचा धारण करने के लिए माइक्रो-Adson संदंश का प्रयोग करें और एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए एक शल्य कैंची का उपयोग करें (2 - 3 मिमी)।
    6. संदंश के साथ चीरा की त्वचा पकड़ो और शल्य कैंची डालने के साथ जबड़े चीरा में बंद कर दिया। manubrium या ठोड़ी की ओर subcutaneously कैंची पुश, और फिर चमड़े के नीचे की परत से त्वचा को मुक्त करने की कैंची खुला।
    7. कंठिका हड्डी का स्तर (चित्रा 3 ए और 3 बी) को manubrium से एक midline चीरा बनाने के लिए शल्य कैंची के साथ त्वचा कट। दो टूक पतली प्रावरणी (बिंदीदार रेखा, में काटना (चित्रा 3 बी और 3 सी के बीच, नीले तीर)।
      नोट: manubrium (चित्रा -3 सी में काला तीर) और श्वासनली (चित्रा -3 सी में टी) इस कदम के बाद देखा जाएगा।
    8. कोमल ऊतक और त्वचा Graefe संदंश के साथ manubrium के अधिकार पर देखा पकड़ो, (चित्रा -3 सी में पीले बिंदीदार रेखा) 2 बजे की स्थिति की ओर प्रावरणी के तहत hemostat डालें, मुक्त करने के लिए hemostat के जबड़े खोलने आसपास के ऊतकों से गले नस।
    9. प्रावरणी, कोमल ऊतक और 2 बजे की स्थिति (चित्रा 3 सी) शल्य कैंची के साथ सही गले नस (चित्रा 3 डी, तीर) को बेनकाब करने की ओर त्वचा कट।
    10. 22 जी सुई, और फिर परिवर्तन के साथ 300 μl rhodamine 6G समाधान के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर - लगभग 200 ड्रायह करने के लिए 30 जी सुई।
      नोट: यह इसके ठीक टिप के नुकसान से 30 जी सुई सुरक्षा करता है। सीधे 30 जी सुई की नोक को नुकसान नहीं होगा साथ rhodamine 6G समाधान ड्राइंग; हालांकि कंटेनर दीवार को छू गलती से क्षति है, जो इंजेक्शन मुश्किल बना सकता है कारण होगा।
    11. धीरे-धीरे बाहर rhodamine 6G समाधान धक्का द्वारा 30 जी सुई फ्लश, यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले सिरिंज या सुई में रहते हैं। इंजेक्शन के लिए 100 μl rhodamine 6G समाधान रखें।
    12. Bend 2 - सुई धारक के साथ एक 90 डिग्री के कोण है, जो सुई भी गले नस को गहरी डालने को रोकने और इंजेक्शन और अधिक आसानी से नियंत्रित (चित्रा 3 डी) बनाता है जाएगा करने के लिए सुई की नोक 3 मिमी।
    13. लेबल प्लेटलेट्स के लिए सही गले नस में rhodamine 6G समाधान इंजेक्षन। सिरिंज को स्थिर और स्थिति में सुई रखने के लिए, injection.Af के दौरान एक और हाथ से Graefe संदंश के साथ एक हाथ से सिरिंज और सुई पकड़आतंकवाद इंजेक्शन, Graefe संदंश के साथ इंजेक्शन साइट दबाना खून बह रहा से बचने के लिए।
    14. hemostat के जबड़े खोलें और Graefe संदंश के तहत इसे सम्मिलित इंजेक्शन साइट के पोत दीवार शिकंजा कसने के लिए, और फिर एक 6-0 सीवन के साथ इंजेक्शन साइट ligate।
      नोट: कदम 2.1.15 के लिए एक विकल्प के रूप में, 2 मिनट रक्तस्राव को रोकने के लिए एक उंगली के साथ इंजेक्शन साइट के लिए लागू करने का दबाव; हालांकि, इस पद्धति आगे के कारण खून बह रहा है, तो इंजेक्शन स्थल पर थक्का गलती से निकाल दिया जाता है के एक जोखिम है।
    15. दो टूक नरम ऊतक और hemostat और Graefe संदंश के साथ छोड़ दिया ऊधर्व हनु के नीचे ग्रंथि के आसपास प्रावरणी काटना और 7 बजे के स्थान (चित्रा 3E) को छोड़ दिया sternocleidomastoid मांसपेशी (चित्रा 3E में नीले तीर) को बेनकाब करने की ओर ग्रंथि खींच।
    16. दो टूक छोड़ दिया sternocleidomastoid मांसपेशियों और omohyoid मांसपेशियों या sternohy के बीच प्रावरणी (चित्रा 3E, बिंदीदार रेखा) काटनाOID मांसपेशी (चित्रा 3E, हरी तीर) hemostat के साथ श्वासनली के बाईं साइट के लिए स्थित है।
    17. 6-0 रेशम सीवन (लगभग 15 सेमी लंबे) sternocleidomastoid मांसपेशी (चित्रा 3E में नीले तीर) के बीच के तहत के साथ एक सुई दर्रा, एक साथ सीवन के दोनों सिरों डाल दिया और 10 बजे की स्थिति की ओर laterally सिवनी खींच ।
      नोट: इस प्रक्रिया को ध्यान से बाईं गले नस, जो sternocleidomastoid पेशी के बाहर स्थित है चोट से बचने के लिए किया जाना चाहिए।
    18. दो टूक पतली sternohyoid मांसपेशियों और / या omohyoid पेशी sternocleidomastoid पेशी दूर खींच के बाद कैरोटिड धमनी (सीए) (चित्रा 3F तीर) को बेनकाब करने के लिए अलग। sternohyoid मांसपेशियों और / या आवश्यक के रूप में omohyoid मांसपेशियों में कटौती। सीए को छूने के बिना सीए से कोमल ऊतक को अलग करने के hemostat का प्रयोग करें
      नोट: सीए वेगस तंत्रिका के साथ है, सफेद संरचना में देखा (चित्रा 3F में पीले बिंदीदार लाइनों के बीच) के अधीन है।
    19. एक ठीक टिप संदंश का प्रयोग करें सीए के आसपास पार्श्व प्रावरणी लेने के लिए है, जबकि वेगस तंत्रिका और सीए परहेज सीए और वेगस तंत्रिका के बीच प्रावरणी पर एक छेद पंच के लिए एक और अच्छी टिप संदंश का प्रयोग करें।
    20. छेद के माध्यम से हुक पास और धीरे सीए उठा, और उसके बाद सीए के तहत ठीक टिप संदंश जगह adventitial नरम ऊतक पट्टी करने के लिए सीए के साथ विपरीत दिशाओं में हुक और संदंश ले जाएँ। आसपास के ऊतकों से सीए (चित्रा 3H, नीले तीर) के नि: शुल्क कम से कम ~ 5 मिमी लंबाई।
    21. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को ब्लॉक करने के लिए, फ्लैट के लिए एक काले रंग की प्लास्टिक कॉफी दोषी के अंत प्रेस, एक 3 मिमी टुकड़ा में कॉफी दोषी crosscut, और उसके बाद के 'यू' आकार प्लास्टिक (चित्रा 3H, हरे रंग की दो टुकड़ों को पाने के लिए गुना किनारों के साथ longitudinally कटौती तीर)।
    22. (चित्रा 3H, हरी तीर) के साथ सीए उठाने। इसके तत्काल बाद खारा की 2-3 बूँदें लागू सीए सूखने से बचने के लिए
  2. वास्तविक समय रिकॉर्डिंग वीडियो
    1. 10X पानी लेंस के तहत एक उपयुक्त स्थिति में खुर्दबीन मंच और जगह पर एक साथ माउस और थाली ढक्कन स्थानांतरण। 10x लेंस और नमक के साथ सीए के बीच अंतरिक्ष भरें।
    2. डिजिटल वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग प्रारंभ करें, और एक नई फ़ाइल शुरू करने और उसके अनुसार यह नाम है। सामान्य पोत छवियों रिकॉर्ड और फ्रेम संख्या में कमी के बारे में जब वीडियो रिकॉर्डिंग बंद कर दिया है।
      नोट: रिकॉर्डिंग के लिए कंप्यूटर में वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर संदर्भ। हम डिजिटल वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और निम्नलिखित विवरण इस आवेदन के आधार पर कर रहे हैं।
      नोट: यांत्रिक टीआरए के बादउमा endothelium घायल और thrombus गठन 20 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह पोत दीवार FeCl 3 घायल होने से पहले करने के लिए कोई शल्य चोट है कि वहाँ की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। यह भी सीए के आसपास कोई शेष ऊतक है, जो एक बाधा के रूप में और FeCl 3 प्रेरित चोट के प्रभाव को कम कर सकते हैं यह है कि वहाँ की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। रिकॉर्ड की फ्रेम संख्या नीचे लिखें यह आसान वीडियो गुजरे बार बाद में अनुसार विश्लेषण करने के लिए कर देगा।
    3. 10X लेंस से बाहर प्लेट ढक्कन के साथ माउस ले जाएँ। एक कागज तौलिया के एक कोने मोड़ो एक पतली और ठीक टिप बनाने के लिए और इसका इस्तेमाल सावधानी से सीए के आसपास खारा दाग को शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में अन्य स्थानों में (सीए छूने से बचने) के रूप में अच्छी तरह से। यह प्रयोग किया जाता FeCl 3 समाधान के कमजोर पड़ने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. एक ठीक टिप संदंश का प्रयोग करें और FeCl 3 समाधान के साथ संतृप्त फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा लेने के लिए और सीए पर सीधे डाल दिया है और 1 मिनट के लिए साइट पर रहते हैं।
      नोट: टीओ खून और फसल सटीक डाटा की सहायता दृश्य, फिल्टर पेपर उजागर सीए (चित्रा 3I) के बाहर का अंत के करीब जगह है और (चित्रा 3I में हरा तीर) देर में रक्त के प्रवाह के अवलोकन के लिए समीपस्थ स्थल पर एक छोटी खंड छोड़ चरण (नीचे देखें)।
    5. फिल्टर पेपर निकालें (इस समय बिंदु की शुरुआत के रूप में परिभाषित किया गया है "चोट के बाद") और खारा (कम से कम 2 एमएल) के साथ सीए कुल्ला।
    6. वापस 10x लेंस के लिए थाली ढक्कन के साथ माउस रखो; पोत का पालन और रिकॉर्ड वीडियो छवियों के लिए शुरू करते हैं। रिकॉर्डिंग के पहले मिनट के अंत में वीडियो फ्रेम संख्या लिख ​​लें।
      नोट: thrombus गठन फ्लोरोसेंट प्लेटलेट्स, जो कंप्यूटर स्क्रीन पर या खुर्दबीन के नीचे वास्तविक समय वीडियो छवियों में मनाया जाता है के संचय से पहचाना जाता है। रिकार्ड वीडियो चित्र तुरंत माउस माइक्रोस्कोप के तहत वापस डालने के बाद। एफ को हटाने के बाद पहले मिनट के अंत तक रिकॉर्डिंग रखेंİlter कागज। समीपस्थ साइटों के लिए बाहर से पूरे पोत निरीक्षण चोट के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, और फिर हित के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आगे इमेजिंग के लिए (आमतौर पर घायल क्षेत्र का केंद्र है)।
    7. 10 सेकंड पहले 10 मिनट (जैसे, 02:55 03:05 करने के लिए) और फिर 10 सेकंड के हर प्रयोग के अंत तक दूसरे मिनट के लिए हर मिनट के लिए रिकॉर्ड वीडियो चित्र। नीचे फ्रेम नंबर लिखें जब प्रत्येक रिकॉर्डिंग बंद कर दिया है।
      नोट: मॉडल के अंत अंक हैं: 1) जब रक्त का प्रवाह> 30 सेकंड के लिए नहीं रह गया है; या 2) यदि रोड़ा चोट के बाद 30 मिनट में नहीं देखा जाता है। इस मामले में, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 30 मिनट का उपयोग करें। सेट शुरुआत में 10 मिसे के रूप में वीडियो रिकॉर्ड का जोखिम समय, तो यह thrombi भर में रक्त के प्रवाह में निरीक्षण करने के लिए आसान हो जाएगा। thrombi बड़े हो जाते हैं और प्रतिदीप्ति कैमरे के संवेदक संतृप्त है, यह thrombi भर में रक्त के प्रवाह की पहचान करना मुश्किल हो जाता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, इमेजिंग सीई के लिए कदमसमीपस्थ रिहाई साइट (चित्रा 3I, हरी तीर) जहां रक्त के प्रवाह को अभी भी स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है के लिए nter। हम भी, जब संयुक्त राष्ट्र के समीपस्थ घायल साइट पर ध्यान केंद्रित कर 15 या 20 मिसे को बेनकाब समय में वृद्धि, ताकि रक्त का प्रवाह अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। जब रक्त का प्रवाह समाप्त हो जाएगा, कई बड़े कोशिकाओं (ल्यूकोसाइट्स) thrombus के समीपस्थ स्थल पर पोत दीवार पर रोल करने के लिए शुरू करते हैं। बड़े कोशिकाओं की उपस्थिति के बाद 3 मिनट - फ्लो आमतौर पर 2 के भीतर बंद हो जाता है। नीचे लिखें रिकॉर्डिंग शीट पर बेनकाब समय अगर यह बदल गया है। यह आमतौर पर प्रयोग के अंत करने के लिए संज्ञाहरण से लगभग 30 मिनट लगते हैं, तो सामान्य जंगली प्रकार C57BL6 चूहों का इस्तेमाल किया गया था।
      चेतावनी नोट: रक्त का प्रवाह समाप्ति, जो एक सही आंकड़ा नहीं देना होगा की निशानी के रूप में सफेद एकत्रित प्लेटलेट थक्का प्रयोग न करें और यह जोखिम समय से प्रभावित है। सफेद थक्का पोत लुमेन कवर रह गए रक्त के प्रवाह मतलब यह नहीं है (देखें वीडियो प्रतिनिधि 1)।

3. FeCl 3 प्रेरित mesenteric धमनी / शिरा घनास्त्रता मॉडल

  1. 12 सप्ताह पुरानी C57BL6 चूहों के रूप में खंड 2.1.1 में उल्लेख किया है - 8 anesthetize। आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए।
  2. Papaverine समाधान (कुल 0.4 मिलीग्राम / माउस) इंजेक्षन intraperitoneally पेट peristalsis को बाधित करने के लिए।
  3. गर्दन और एक जानवर बिजली क्लिपर के साथ पेट पर फर निकालें। लोमनाशक क्रीम आवश्यक नहीं है।
  4. 15 सेमी टिशू कल्चर प्लेट के ढक्कन पर लापरवाह स्थिति में माउस सुरक्षित। सभी पैर सुरक्षित करने के लिए छोटे टेप (2 सेमी x 0.5 सेमी) के चार टुकड़े का प्रयोग करें। कृन्तक के आसपास लपेटो करने के लिए एक 4 -0 सिवनी का प्रयोग करें, ढकने के लिए सिवनी के दोनों सिरों टेप गर्दन सीधी (चित्रा 2) रखने के लिए।
  5. प्रक्रियाओं 2.1.4 का पालन करें -2.1.15 लेबल प्लेटलेट्स के लिए rhodamine 6G के इंजेक्शन के लिए गले नस को बेनकाब करने के लिए।
  6. शल्य कैंची (चित्रा -4 ए) का उपयोग कर पेट कम करने के लिए जिफाएडा से त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा प्रदर्शन करना। बीच पेरिटोनियम उठाओ (भी बुलाया linea अल्बा, चित्रा -4 ए, तीर) Graefe संदंश के साथ है, जो स्पष्ट है और कोई रक्त वाहिकाओं है, लिफ्ट के बारे में 2 - 3 मिमी उच्च, काटने लाइन के तहत कोई आंत्र की पुष्टि करें और पेरिटोनियम खुले में कटौती longitudinally ठीक कैंची (चित्रा 4 बी) के साथ।
  7. सही पार्श्व स्थिति के लिए चूहों को पुन: सुरक्षित। आधा सर्कल agarose जेल पेट के करीब रखें, और धीरे से आंतों अमल और Graefe संदंश (चित्रा 4C) के साथ जेल के शीर्ष पर फैल गया। थ्रोम्बोसिस प्रयोग (चित्रा 4C, तीर) के लिए दूसरी शाखाओं का प्रयोग करें।
    नोट: आंतों अमल करने में मदद करने के लिए hemostat या माइक्रो-Adson संदंश का प्रयोग करें। चोट पहुँचाने से बचेंआंत्र और पोत।
  8. जगह 5 - 6 बूँदें खारा आंत्र और पोत की नमी बनाए रखने के लिए। खुर्दबीन मंच के लिए एक साथ थाली ढक्कन के साथ माउस स्थानांतरण और 10X सूखी लेंस के तहत उचित स्थिति में जगह है।
    नोट: एक शुष्क लेंस का प्रयोग करें क्योंकि jejunoileal झिल्ली खारा समाधान नहीं पकड़ सकते हैं। उन्हें नम रखने के संपर्क में ऊतकों पर खारा समाधान ड्रॉप करने के लिए सुनिश्चित करें।
  9. mesenteric धमनी और शिरा उपचार से पहले आसपास खारा दाग।
  10. 12.5% ​​FeCl 3 समाधान के साथ संतृप्त फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा लेने के लिए और mesenteric धमनी और 1 मिनट (चित्रा 4D) के लिए नस पर सीधे यह जगह ठीक एक टिप संदंश का प्रयोग करें। फिल्टर पेपर निकालें और नमक के साथ घायल mesenteric धमनी और शिरा कुल्ला (कम से कम 2 मिलीलीटर) (इस समय बिंदु "चोट के बाद 'की शुरुआत के रूप में परिभाषित किया गया है)।
  11. 10X सूखी लेंस के तहत वापस थाली ढक्कन के साथ माउस रखो; जहाजों का निरीक्षण करने और आरईसी के लिए शुरूORD वीडियो चित्र 2.2 में वर्णित के रूप में)।
    नोट: इस प्रयोग के अंत अंक हैं: 1) जब रक्त का प्रवाह> 30 सेकंड के लिए नहीं रह गया है; या 2) यदि रोड़ा 30 मिनट में चोट के बाद से नहीं देखा गया है, और इस मामले में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 30 मिनट का उपयोग करें।
  12. प्रयोग के अंत में, अधिक मात्रा ketamine / xylazine (200/20 मिलीग्राम / किग्रा), गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद उपयोग करने के बाद कोई सांस और दिल की धड़कन की पुष्टि कर रहे चूहों euthanize।

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Representative Results

कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल
C57BL6 पृष्ठभूमि के साथ चूहों में, हम 7.5% FeCl 3 का उपयोग करना चाहिये एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में 1 मिनट के लिए पोत के इलाज के लिए। 7.5% की उपचार FeCl 3 के तहत, घायल क्षेत्र और सामान्य पोत दीवार की सीमाओं को आसानी से खुर्दबीन के नीचे की पहचान कर रहे हैं (देखें ऑनलाइन वीडियो 1), सुझाव है कि endothelial परत काफी क्षतिग्रस्त हो गया था। Thrombi FeCl 3 उपचार पर तुरंत गठन किया है, और चोट के बाद सभी गुम्मट C57BL6 चूहों 1 मिनट में मनाया जाता है। शुरू में गठित thrombi अस्थिर कर रहे हैं और उनमें से भागों आमतौर पर दूर रक्त प्रवाह से धोया जाता है, ताकि गठन thrombi 2 पर छोटे हो जाते हैं - चोट के बाद 3 मिनट। फिल्टर पेपर को हटाने के बाद 4 मिनट और बाद में इन गठन thrombi स्थिर रहे हैं और आम तौर पर धुल नहीं कर रहे हैं - thrombi 3 से विस्तार करने के लिए शुरू करते हैं। औसत ओक्लूसिव समय C57BL6 चूहों में 11.3 ± 3.16 मिनट है (एन = 14) जब 7.5% एफईसीएल 3 6,7,19 (चित्रा 5 ए और ऑनलाइन वीडियो 1) किया जाता है। पिछले अध्ययनों में हम दिखा दिया है कि दोनों कमी और FeCl 3 सांद्रता की वृद्धि के एक विरोधी थ्रोम्बोटिक माउस तनाव और WT चूहों 6 के बीच का अंतर कम हो जाना; हमारे अनुभव से, 1 मिनट के लिए 7.5% FeCl 3 के साथ मन्या धमनी का इलाज हमारे उद्देश्यों के सभी को संतुष्ट करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा पीटा चूहों 7,8,16,19,21 का उपयोग कर विशिष्ट जीन के समारोह का परीक्षण करने के लिए, निम्न चार प्रतिनिधि इस मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों हैं:

ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक मध्यस्थता थ्रंबोलाइसिस की नसों में छिड़काव
ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) संयुक्त राज्य अमेरिका 22 में थ्रोम्बोलिसिस उपचार के लिए एफडीए को मंजूरी दी दवाओं में से एक है। हम इस प्रकार कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल में टीपीए की मध्यस्थता थ्रोम्बोलिसिस मनाया। घनास्त्रता थाFeCl 3 7.5% के साथ शुरू की है और टीपीए से पहले 5 मिनट के लिए फार्म की अनुमति दी (1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) एक गले नस कैथेटर (22GA) के माध्यम से भरकर रखा गया था। जैसा कि चित्र 5 ब और ऑनलाइन वीडियो 2 में दिखाया गया है, thrombus लगातार बढ़ाया और चोट के बाद लुमेन 5 मिनट के बारे में 50% पर कब्जा कर लिया। thrombi टीपीए छिड़काव सुझाव है कि टीपीए प्लेटलेट एकत्रीकरण सक्रियण और प्रभावित नहीं करता है के बाद विस्तार करने के लिए जारी रखा। थ्रंबोलाइसिस टीपीए इंजेक्शन के बाद के बारे में 4 मिनट के लिए शुरू कर दिया। का गठन thrombi 30 मिनट प्रेक्षण अवधि और कोई पोत रोड़ा इस मामले में क्या हुआ के दौरान बार बार आकार विविधताओं से गुजरना करने के लिए पाए गए। इन आंकड़ों से स्पष्ट रूप से पता चला कि टीपीए पूरी तरह से प्लेटलेट की मध्यस्थता thrombus गठन को बाधित नहीं कर सकते, तो भी यह थ्रोम्बोलिसिस की ओर जाता है। इसलिए, हम कल्पना है कि भविष्य प्रयोगों FeCl 3 प्रेरित धमनी घनास्त्रता मॉडल का उपयोग थ्रांबोलिटिक और अन्य उपचारों adjunctive एक प्रमुख आखिरी हो सकता है कि मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकताthrombus गठन पर entative प्रभाव।

चूहों को PAR4 एंटीबॉडी के छिड़काव को रोकता है घनास्त्रता
प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर 4 (PAR4) एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) प्लेटलेट्स पर जो अपनी एन टर्मिनल exodomain 23 के proteolytic दरार से सक्रिय और बाद में प्लेटलेट सक्रियण में कदम की ओर जाता है है। Nieman प्रयोगशाला एक बकरी पॉलीक्लोनल PAR4 एंटीबॉडी (CAN12) कि PAR4 की ऋणात्मक क्लस्टर लक्षित करता है, और PAR4 दरार देरी, जिससे PAR4 मध्यस्थता प्लेटलेट सक्रियण 24 के लिए एक महत्वपूर्ण कदम को प्रभावित करने उत्पन्न किया है। 1 मिलीग्राम के छिड़काव द्वारा / C57BL6 चूहों को यह एंटीबॉडी की किलोग्राम, हमने पाया कि PAR4 दरार का निषेध काफी लंबे समय तक बार 7.5% FeCl 3 प्रेरित कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल में thrombus गठन अंतरोधी (चित्रा 5C और ऑनलाइन वीडियो 3)। यह दर्शाता है कि FeCl 3 प्रेरित घनास्त्रता मॉडल सीएक विरोधी प्लेटलेट एजेंटों के प्रभाव का मूल्यांकन करने और संभावित चिकित्सीय रणनीतियों को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जा।

Nanoparticle की मध्यस्थता thrombi-विशिष्ट लक्ष्यीकरण
रैपिड थक्का हटाने के लिए रक्त के प्रवाह को फिर से स्थापित इस्कीमिक स्ट्रोक और रोधगलन सहित ओक्लूसिव संवहनी रोगों के इलाज में महत्वपूर्ण है। ऐसे टीपीए के रूप में थ्रांबोलिटिक दवाओं के प्रणालीगत प्रसव के ऊपर से पता चला है, का गठन thrombi lyse सकते हैं, लेकिन पूरी तरह से प्लेटलेट सक्रियण और फिर से एकत्रीकरण / रोड़ा नहीं रोका जा सकता। इसके अतिरिक्त, इस तरह के सेरीन प्रोटीज एजेंटों के प्रणालीगत प्रत्यक्ष वितरण, अंधाधुंध बंद लक्ष्य कार्रवाई करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं नकसीर सहित प्रमुख साइड इफेक्ट के लिए अग्रणी। सेन गुप्ता प्रयोगशाला प्लेटलेट प्रेरित nanoparticle आधारित सिंथेटिक वितरण वाहनों है कि रक्तसंचारप्रकरण कतरनी प्रवाह 25-27 के तहत थक्का जुड़े सक्रिय प्लेटलेट्स और प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते हैं इंजीनियर है। हम इस प्रकार की जांच की है कि क्या इन नैनोकणों कर सकते हैंएक धमनी में सक्रिय रूप से बनाने के लिए बाध्य thrombi।

जैसा कि टीपीए छिड़काव के लिए प्रयोग में उल्लेख किया है, एक कैथेटर गले नस में डाला और वर्दी प्रवाह दर पर nanoparticle के इंजेक्शन के लिए एक इंजेक्शन पम्प से जुड़ा था। इस प्रयोग में, कोई प्रतिदीप्ति डाई माउस में इंजेक्ट किया गया था प्लेटलेट्स लेबल करने के लिए। इसके बजाय, नैनोकणों Rohdamine बी के साथ लेबल रहे थे; इसलिए वे intravital माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा करने में सक्षम थे। जैसा कि पहले उल्लेख थ्रोम्बोसिस 1 मिनट के लिए 7.5% FeCl 3 उपचार के साथ शुरू किया गया था। चूंकि WT चूहों में, thrombi का एक महत्वपूर्ण राशि की चोट के बाद 5 मिनट के लिए फार्म मिला था, हम अगर नैनोकणों सक्रिय रूप से गठन thrombi को कुशलता से बाँध का पता लगाने के नैनोकणों के इंजेक्शन के लिए इस समय बिंदु का चयन किया। जैसा कि चित्र 5 डी और ऑनलाइन वीडियो 4 में दिखाया गया है, फ्लोरोसेंट नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद, हम एक पर्वत के आकार की पहचान करने में सक्षम थेthrombus जो उत्तरोत्तर फ्लोरोसेंट कणों से कवर किया गया। इन अध्ययनों FeCl 3 प्रेरित घनास्त्रता मॉडल थक्का-लक्षित कण दवा वितरण प्रणाली को निशाना क्षमता (और बाद में चिकित्सीय प्रभावकारिता) का मूल्यांकन करने की उपयोगिता का प्रदर्शन।

लाल रक्त thrombus गठन में प्लेटलेट्स के अलावा अन्य कोशिकाओं की भूमिका।
हाल के अध्ययनों से सुझाव दिया है कि लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) FeCl 3 प्रेरित घनास्त्रता मॉडल 28 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और वे घायल हो गए पोत दीवार 29,30 करने के लिए पहली पक्षपाती रक्त घटक हैं। इस घटना का पता लगाने के लिए, हम 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (Dil, 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) के साथ लाल रक्त कोशिकाओं लेबल। दिल लेबल लाल रक्त कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोया और 35% hematocrit साथ खारा में resuspended थे। दिल लेबल आरबीसी निलंबन (माउस प्रति 100 μl) इंजेक्षन थाthrombocytopenic चूहों की है जो घातक 5 दिनों प्रयोग 19 से पहले विकिरणित किया गया में एड। ये thrombocytopenic चूहों महत्वपूर्ण प्लेटलेट्स, जो पोत दीवार को बिता आरबीसी की संभावना में वृद्धि होगी, अगर वे करते कमी आई है। प्रतिदीप्ति लेबल प्लेटलेट्स (चित्रा 5) का उपयोग कर प्रयोगों के विपरीत, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का कोई स्पष्ट संचय पोत दीवार पर पाया गया था संवहनी चोट (चित्रा 6A, ऑनलाइन वी विचारधारा 5) के बाद। हालांकि, प्लेटलेट अमीर thrombi के गठन के साथ-साथ, लाल रक्त कोशिकाओं thrombus जो थक्का (चित्रा 6A) के आकार को दिखाता में जमा करने के लिए शुरू कर दिया। घायल कैरोटिड धमनी के immunofluorescence धुंधला प्रदर्शन किया है कि प्रमुख कोशिकाओं पोत दीवार से चिपके, प्लेटलेट्स हैं (CD41 सकारात्मक, हरा), जबकि दिल लेबल लाल रक्त कोशिकाओं को मुख्य रूप से thrombi (चित्रा 6B एंड सी) के भीतर फंस रहे हैं। इन अध्ययनों कि प्रदर्शनFeCl 3 प्रेरित घनास्त्रता मॉडल सेलुलर और आणविक घटकों और thrombus गठन के स्थानिक-सामयिक घटनाओं पर यंत्रवत समझ पाने में उपयोग किया जा सकता है।

Mesenteric घनास्त्रता मॉडल
Mesenteric घनास्त्रता मॉडल के लिए, FeCl 3 के एक उच्च एकाग्रता (10 - 12.5%) के रूप में जहाजों को आम तौर पर वसा ऊतकों से घिरे रहे हैं की सिफारिश की है, जो पोत दीवार की ओर FeCl 3 प्रसार में बाधा कर सकते हैं और इस प्रकार FeCl 3 प्रेरित से पोत को रोकता है चोट 7। यह मॉडल शिरापरक घनास्त्रता अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त है। के रूप में ऑनलाइन वीडियो 6 में दिखाया गया है, thrombus के आसपास देखा गया था ~ mesenteric नस में 15 सेकंड के topically फिल्टर पेपर 12.5% ​​FeCl 3 समाधान है, लेकिन thrombus गठन के साथ संतृप्त लगाने के बाद नाटकीय रूप से mesenteric धमनी में देरी हो रही है। ~ औसत समय thrombus गठन अंतरोधी है 17 ± 7.2 मिनट (एन = 11) मीटर में esenteric नस और के बारे में 23 ± 9.9 मिनट (एन = 10) mesenteric धमनी में जब 12.5% ​​FeCl 3 से 7 प्रयोग किया जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1. शल्य चिकित्सा उपकरण। माउस सर्जरी के लिए न्यूनतम आवश्यक उपकरण दिखाए जाते हैं। अधिक विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री सूची देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. माउस निर्धारण सर्जरी के लिए। कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के लिए या mesenteric घनास्त्रता मॉडल के लिए rhodamine 6G डाई के इंजेक्शन के लिए 15 सेमी संस्कृति डिश ढक्कन पर माउस सुरक्षित।मिल = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल। प्रक्रियाओं गले नस को बेनकाब करने के लिए, rhodamine 6G के इंजेक्शन फ्लोरोसेंट रक्त प्रणाली और छोड़ दिया मन्या धमनी के जोखिम में डाई दिखाए जाते हैं। (ए) में, लाइन कंठिका हड्डी के स्तर पर manubrium से चीरा इंगित करता है; (बी) में, नीले तीर ऊधर्व हनु के नीचे ग्रंथियों से संकेत मिलता है, और पीले बिंदीदार रेखा ऊधर्व हनु के नीचे ग्रंथियों के बीच प्रावरणी प्रतिनिधित्व करते हैं; (सी) में, नीले तीर ऊधर्व हनु के नीचे ग्रंथियों से संकेत मिलता है, काला तीर manubrium इंगित करता है, और बिंदीदार रेखा पीले रंग की स्थिति गले नस को बेनकाब करने की कटौती करने के लिए इंगित करता है; (डी) में, नीले तीर गले नस इंगित करता है; (ई) में, पीले तीर छोड़ दिया ऊधर्व हनु के नीचे ग्रंथि, नीले तीर indicat इंगित करता हैतों sternocleidomastoid पेशी छोड़ दिया, बिंदीदार रेखा पीले प्रावरणी को इंगित करता है, और हरी तीर omohyoid मांसपेशियों या sternohyoid पेशी इंगित करता है; (एफ) में, नीले तीर कैरोटिड धमनी को इंगित करता है, पीले बिंदीदार रेखा पतली sternohyoid मांसपेशियों और / या omohyoid पेशी दिखाने; (G) में, नीले तीर कैरोटिड धमनी को इंगित करता है और हरे रंग का तीर वेगस तंत्रिका इंगित करता है; (ज) में, नीले तीर कैरोटिड धमनी को इंगित करता है और हरे रंग का तीर प्लास्टिक 'यू-आकार "कॉफी दोषी इंगित करता है; और (आई) में, नीले तीर फिल्टर FeCl 3 समाधान के साथ स्थित कागज को इंगित करता है, और हरी तीर कैरोटिड धमनी इंगित करता है। टी श्वासनली इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Mesenteric धमनी और शिरा घनास्त्रता मॉडल। Mesenteric वाहिकाओं के जोखिम के रूप में अच्छी तरह से FeCl 3 उपचार दिखाया गया है। (ए) में, नीले तीर linea अल्बा, पोत के बिना सफेद रेशेदार ऊतक इंगित करता है; (बी), एक चीरा अकेले कटौती में linea अल्बा दिखाया गया था; (सी) में, नीले तीर mesenteric धमनियों और नसों के दूसरे चाप से संकेत मिलता है; (डी) में, नीले तीर फिल्टर FeCl 3 समाधान के साथ स्थित कागज इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों। (ए)। TheC57Bl / 6 माउस में thrombus गठन 7 के साथ इलाज.5% FeCl 3। (बी)। टीपीए थ्रांबोलिटिक प्रभाव मध्यस्थता। (सी)। एंटीबॉडी को निशाना माउस थ्रोम्बिन रिसेप्टर PAR4 पर थ्रोम्बोसिस दिखाया गया था इंजेक्शन। (डी)। Thrombus-साइट लक्षित nanovehicles विशेष रूप से सक्रिय रूप से गठन thrombi दिखाया गया था करने के लिए बाध्य । Inj। पी कण का इंजेक्शन इंगित करता है; और पीक बी thrombi के कणों के शिखर बैंडिंग इंगित करता है। सभी छवियों को एक ही बढ़ाई के तहत उठाए गए थे। स्केल बार = 300 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 thrombus गठन पर आरबीसी की भूमिका। (ए) Thrombocytopenic चूहों कि दिल लेबल लाल रक्त कोशिकाओं का छिड़काव प्राप्त 7.5% FeCl के बाद मन्या धमनी घनास्त्रता मॉडल और छवियों के अधीन थे (बी एंड सी) घायल मन्या धमनियों काटा गया, और जमे हुए वर्गों तैयार थे। प्लेटलेट्स CD41 (ग्रीन) और लाल रक्त कोशिकाओं के साथ दाग थे लाल (दिल) के रूप में दिखाया गया है। केन्द्रक डीऐपीआई के धब्बे वाले थे। (बी और सी) में दिखाया गया वेसल्स दो अलग चूहों से थे। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1
वीडियो 1: जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के प्रतिनिधि वीडियो। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) इस वीडियो स्थित WT चूहों की कैरोटिड धमनी topically लागू करने के लिए फिल्टर पेपर से प्रेरित में प्रतिनिधि thrombus गठन से पता चलता है7.5% FeCl 3 समाधान के साथ। प्लेटलेट्स rhodamine 6G की नसों में इंजेक्शन द्वारा लेबल थे, और वीडियो मोनोक्रोम मोड में लिया गया था। सफेद जन पका हुआ प्लेटलेट्स है।

वीडियो 2
वीडियो 2: ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) की मध्यस्थता थ्रांबोलिटिक कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के आधार पर पता लगाया प्रभाव। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) प्लेटलेट लेबलिंग और thrombus गठन के रूप में वीडियो 1 में वर्णित शुरू किए गए, और टीपीए इंजेक्ट किया गया था नसों के 5 मिनट के 7.5% के बाद FeCl 3 चोट।

वीडियो 3
वीडियो 3: एन्टीप्लेटलेट दवा, NA Mely विरोधी प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर 4 (PAR4) एंटीबॉडी, मध्यस्थता विरोधी थ्रोम्बोटिक प्रभाव कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के आधार पर पता चला। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) इस प्रयोग में, चूहों PAR4 एंटीबॉडी और rhodamine 6G इंजेक्शन 10 मिनट पहले प्राप्त thrombus गठन topically 7.5% FeCl 3 के साथ स्थित फिल्टर पेपर लगाने से शुरू किया गया था।

वीडियो 4
वीडियो 4: Nanoparticle की मध्यस्थता thrombi विशिष्ट लक्षित। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) इस प्रयोग में, मन्या धमनी thrombus गठन लेबलिंग प्लेटलेट बिना FeCl 3 7.5% के साथ शुरू किया गया था। Nanoparticle Rhodamine बी के साथ चिह्नित किया गया और नसों की चोट के बाद माउस 5 मिनट में इंजेक्शन।

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वीडियो 5: कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के आधार पर पता लगाया लाल रक्त कोशिकाओं के बंधन। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।) लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (Dil, 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता), और के 100 μl साथ लेबल रहे थे दिल लेबल लाल रक्त कोशिकाओं (35% hematocrit) thrombocytopenic चूहों में इंजेक्शन थे। कोई प्लेटलेट लेबलिंग इस प्रयोग में प्रदर्शन किया गया था। के रूप में with7.5% FeCl 3 ऊपर उल्लेख thrombus शुरू किया गया था।

वीडियो 6
वीडियो 6: WT चूहों पर mesenteric धमनी और शिरा घनास्त्रता मॉडल के प्रतिनिधि वीडियो। (राइट-सीएलआईसीके डाउनलोड करने के लिए।) प्लेटलेट्स rhodamine 6G की नसों में इंजेक्शन द्वारा लेबल किया गया, और thrombus 1 मिनट के लिए 12.5% ​​FeCl 3 समाधान के साथ फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा लगाने के बाद topically शुरू किया गया था। पोत 10X सूखी लेंस के तहत मनाया गया।

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Discussion

FeCl 3 प्रेरित मॉडल सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल घनास्त्रता मॉडल है, जो न केवल प्लेटलेट समारोह और घनास्त्रता 7,8,16,19,31-33 पर आनुवंशिक संशोधन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं में से एक है, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है चिकित्सकीय यौगिकों और उपचार और atherothrombotic रोगों 11,17,34-37 की रोकथाम के लिए रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए। यहाँ हम अपने संशोधनों और इस मॉडल की शोधन दिखाया गया है और इस तकनीक है, जो पर्याप्त थक्कारोधी (टीपीए) और विरोधी प्लेटलेट दवाओं (PAR4 एंटीबॉडी) के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए संवेदनशील है की उपयोगिता के अतिरिक्त सबूत से पता चला है। घनास्त्रता के यंत्रवत अध्ययन करने के अलावा, मॉडल भी Nanotechnologies आधारित, thrombi-लक्षित दवा वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह भी फ्लोरोसेंट आरओएस सूचक 21 के इंजेक्शन से पोत दीवार प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के गठन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सूक्ष्मतकनीक इन मॉडलों का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं। ऑपरेटर पर्याप्त शल्य कौशल के साथ ही नाड़ी और रक्त कोशिका जीव विज्ञान की एक गहरी समझ होनी चाहिए। FeCl 3 प्रेरित कैरोटिड धमनी घनास्त्रता मॉडल के कई महत्वपूर्ण बातें हैं 6: (1) कैरोटिड धमनी (~ 5 मिमी) के लिए पर्याप्त लंबाई बेनकाब फिल्टर पेपर के आवेदन की अनुमति है और एक जगह छोड़ने देर चरण में intravital माइक्रोस्कोपी के तहत रक्त के प्रवाह में निरीक्षण करने के लिए ; (2) स्पष्ट रूप से फिल्टर पेपर सीधे पोत दीवार से संपर्क करें और एक भी चोट का उत्पादन करने की अनुमति देने के लिए कैरोटिड धमनी के आसपास adventitial नरम ऊतक पट्टी; (3) पोत दीवार और FeCl 3 -saturated फिल्टर पेपर के आवेदन से पहले कोई thrombus गठन के लिए कोई यांत्रिक चोट की पुष्टि; (4) 'यू' के एक टुकड़े के आकार का काला प्लास्टिक आसपास के ऊतकों से धमनी अलग करने के लिए, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ब्लॉक करने के लिए, और FeCl 3 प्रसार को रोकने के साथ कैरोटिड धमनी कायम करना। इन रणनीतियों, हम अत्यधिक उत्पन्न किया हैजंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों, और इस माउस तनाव में 7.5% FeCl 3 प्रेरित थ्रोम्बोसिस समय 11.3 ± 3.16 मिनट (एन = 14) 6,7,19 है साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा। rhodamine 6G के गले की नस में इंजेक्शन कोशिकाओं घूम चुनौतीपूर्ण हो सकता है लेबल करने के लिए। एक विकल्प के रूप में, एक पूंछ नस इंजेक्शन 15 सेमी प्लेट ढक्कन पर माउस हासिल करने से पहले किया जा सकता है। कैरोटिड धमनी मॉडल की तुलना करने में, mesenteric धमनी और शिरा मॉडल आसान और कम शल्य चिकित्सा गहन है। हालांकि, के रूप में वसा ऊतकों द्वारा जहाजों की कवरेज की वजह से परिणाम खंड में बताया गया, mesenteric घनास्त्रता मॉडल शिरापरक घनास्त्रता के अध्ययन के लिए बेहतर है, लेकिन अलग अलग चूहों के बीच त्रुटि को कम करने के लिए एक बड़ा नमूना आकार की आवश्यकता है।

इस मॉडल की सीमा यह है कि तंत्र स्पष्ट नहीं है और अभी भी विवादास्पद है। प्रारंभ में, इस मॉडल की व्यवस्था FeCl 3 endothelial कोशिकाओं के उत्पन्न आरओएस प्रेरित अनाच्छादन, और सु की है कि माना जा रहा थाbsequently प्लेटलेट आसंजन, एकत्रीकरण और thrombus गठन 6,11 प्रस्तुत करने के लिए prothrombotic subendothelium के लिए रक्त के घटकों के जोखिम के लिए नेतृत्व किया। प्लेटलेट्स thrombocytopenic चूहों को GPVI एंटीबॉडी के साथ पूर्व इलाज के पुनर्गठन करके, हम दिखा दिया है कि FeCl 3 मॉडल प्लेटलेट GPVI पर निर्भर करता है, और अवरुद्ध प्लेटलेट GPVI नाटकीय रूप से FeCl 3 प्रेरित thrombi गठन 19 हिचकते हैं। यह निष्कर्ष पिछली रिपोर्टों 38 के साथ लाइन में है और पता चलता है कि FeCl 3 मॉडल और अधिक मध्यस्थता थ्रोम्बोसिस 6 मानव atherosclerotic पट्टिका टूटना के pathophysiology की नकल करने की संभावना हो सकती है। हालांकि, हाल ही में कई अध्ययनों से पोत दीवार के लिए लाल रक्त कोशिकाओं के आसंजन के साथ-साथ प्लाज्मा प्रोटीन और रक्त कोशिकाओं 29,30 के FeCl 3 प्रेरित एकत्रीकरण की physiochemical प्रभाव सहित नए तंत्र का प्रस्ताव किया है। इन नए अंतर्दृष्टि सुझाव है कि इस मॉडल के संभावित तंत्र को और अधिक जटिल हो सकता है।

Thrombocytopenic चूहों में दिल लेबल लाल रक्त कोशिकाओं का छिड़काव और फिर -triggered चोट 7.5% के साथ मन्या धमनी को FeCl 3 उत्प्रेरण FeCl 3 करके, हमने पाया है कि प्रमुख कोशिकाओं घायल वाहिनियों की दीवारों का पालन करने प्लेटलेट्स (चित्रा 6 और ऑनलाइन वीडियो 5 हैं )। हम स्पष्ट लाल रक्त कोशिकाओं आसंजन नहीं मिल रहा था, और thrombi में लाल रक्त कोशिकाओं का संचय सबसे फँसाने का एक परिणाम होने की संभावना लग रहा था। हमारा निष्कर्ष प्राथमिक और माध्यमिक रक्तस्तम्भन 39 की अवधारणाओं मेल खाते हैं। पिछली रिपोर्टों से हमारे अवलोकन के अंतर हाइपोक्सिया और बर्र और उनके सहयोगियों ने 30, जहां स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परीक्षा के लिए FeCl 3 घायल मन्या धमनियों चूहों कि बाएं वेंट्रिकल पहले बिना संपर्क में था में तैयार किए गए अध्ययन में के रूप में रक्तसंचारप्रकरण परिवर्तन से हो सकता है एक यांत्रिक ventillation की सहायता। रक्त में ऑक्सीजन एकाग्रता और hemodynamics नाटकीय रूप से दोनों फेफड़े के रूप में कम हो जाएगा औरहृदय समारोह तुरंत प्रभावित हो जाएगा के बाद सीने में यांत्रिक वेंटीलेशन के बिना खोला जाता है। ऑक्सीजन के अभाव में लंबे समय के प्रोकोगुलैंट मार्ग और घनास्त्रता 40 के ट्रिगर और भी आरबीसी आसंजन बढ़ाने सकता है के साथ संबद्ध किया गया है। हाल ही में एक प्रकाशन कैरोटिड धमनी की है कि इलाज के घायल पोत 29 के लुमेन में ~ 50 मिमी पर FeCl 3 के एक स्थिर राज्य एकाग्रता के लिए 5 या 10 मिनट के सुराग के लिए FeCl 3 (20%) का एक बहुत ही उच्च एकाग्रता के साथ दिखाया गया है । वे इस प्रकार सीधे 50 मिमी FeCl 3 संचार विभिन्न रक्त घटकों में और एकत्रीकरण पूर्व vivo पर FeCl 3 का प्रभाव है, जो उन्हें thrombus गठन 29 में FeCl 3 की कार्रवाई के लिए एक उपन्यास, 2-चरण तंत्र का प्रस्ताव करने के लिए नेतृत्व की जांच की। हालांकि काफी दिलचस्प है, इस अध्ययन के परिणामों से सावधानी के साथ व्याख्या के रूप में यह FeCl 3 मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल का प्रतिनिधित्व नहीं करता जरूरत है। FEC के उच्च एकाग्रता के विपरीतएल 3 (20%, 1 एम पत्र में संकेत के रूप में) और लंबी उपचार (5 या 10 मिनट), हमारे पिछले अध्ययनों के साथ ही बर्र एट अल। दिखा दिया है कि 1 मिनट के लिए 10% FeCl 3 उपचार 7 मिनट 6,30 भीतर कैरोटिड धमनी में तेजी से ओक्लूसिव thrombus गठन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, FeCl 3 मॉडल, FeCl 3 का एक और कम एकाग्रता का उपयोग कर प्रयोगों के अधिकांश में (5 - 7.5%) प्रयोग किया जाता है।

इस मॉडल की एक और सीमा endothelium को गंभीर चोट ऑक्सीडेटिव के साथ ही endothelial अनाच्छादन के बाद FeCl 3 उपचार के कारण, इस मॉडल endothelial सूजन जुड़े थ्रोम्बोसिस अध्ययन करने के लिए एक उचित उपकरण नहीं हो सकता है। हालांकि, इन तकनीकों का उपयोग fluorescently लेबल ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव के साथ संयोजन में कैरोटिड धमनी तैयार करके, हम आसंजन और ल्यूकोसाइट्स के रोलिंग भड़काऊ endothelium 41 पर परीक्षण कर सकते हैं।

summ मेंआरे, हम परिष्कृत और FeCl 3 प्रेरित संवहनी चोट मॉडल मानकीकृत कैरोटिड धमनी पर एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट का उत्पादन और intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा सही quantitate रक्त के प्रवाह को बंद करने के लिए समय है। इस मॉडल को पर्याप्त और संवेदनशील थक्कारोधी और antiplatelet दवाओं का परीक्षण करने के लिए है, और यह भी thrombi-लक्षित nanomedicine के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण, thrombocytopenic चूहों या उम्मीदवार दवाओं का सीधा intravascular इंजेक्शन में प्लेटलेट अर्क के साथ संयोजन में, हम दिखा दिया है कि इस विवो 7-10,16,19,42,43 में घनास्त्रता का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक, सरल और संवेदनशील उपकरण है ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/

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