Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Published 10/01/2016
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Genetics

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Summary

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Gabrieli, P., Scolari, F. Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata. J. Vis. Exp. (116), e54528, doi:10.3791/54528 (2016).

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Abstract

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L'avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione.

In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell'espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.

Introduction

La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti 1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti 2.

Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate 3,4. Il danno è causato da entrambi gli adulti ed i stadi larvali: femmine fecondate perforare la superficie del frutto per la deposizione delle uova, permettendo ai microrganismi di influenzare la qualità commerciale, mentre le larve si nutrono della polpa di frutta. Dopo tre stadi larvali, larve emergono dall'host e pupate nel terreno. Ceratitiscapitata mostra una distribuzione quasi tutto il mondo, tra cui l'Africa, il Medio-Oriente, Western Australia, Centro e Sud America, Europa, e le aree degli Stati Uniti 5.

Le strategie più comuni per limitare le infestazioni medfly comportano l'uso di insetticidi (ad esempio, Malathion, spinosad) e l'ecologico Sterile Insect Technique (SIT) 6. Il secondo approccio comporta il rilascio nell'ambiente naturale di centinaia di migliaia di maschi resi sterili da esposizione a radiazioni ionizzanti. L'accoppiamento di questi maschi sterilizzati alle femmine selvatiche si traduce in nessun progenie, causando una riduzione della dimensione della popolazione, portando infine alla eradicazione. Anche se SIT si è dimostrato efficace in più campagne in tutto il mondo, i suoi principali svantaggi sono gli alti costi di allevamento e sterilizzazione di milioni di insetti per essere rilasciato. Marcatura di esemplari rilasciati è necessario distinguere sterile da insetti selvatici catturati sul campo duranteattività di monitoraggio ed è attualmente realizzato con polveri fluorescenti. Queste procedure sono costose e hanno effetti collaterali indesiderati 7.

Al fine di ottimizzare e / o per sviluppare approcci più efficaci per il controllo di questo parassita, biologia e genetica medfly sono stati ampiamente esplorato da numerosi ricercatori di tutto il mondo. La disponibilità della sequenza del genoma medfly 8,9, faciliterà nuove indagini sulle funzioni dei geni. RNA interferenza è un potente strumento per tali studi e può essere raggiunto attraverso la microiniezione di dsRNA (RNA a doppio filamento) o siRNA (small interfering RNA). Questa tecnica è stata utilizzata, per esempio, per dimostrare che la determinazione del sesso cascata molecolare in C. capitata è solo parzialmente conservata rispetto a quello di Drosophila 10.

Lo sviluppo di protocolli per microinject embrioni medfly ammessi C. capitata di essere il primo nonspecie di mosca -Drosophilid da geneticamente modificati. Come le sue uova sono simili a quelli di Drosophila, sia in termini di morfologia e la resistenza all'essiccamento 11, il protocollo per fornire DNA plasmidico in embrioni pre-blastoderma primo sviluppati per D. melanogaster 12,13 inizialmente è stato adattato per l'uso in C. capitata. Questi primi esperimenti autorizzati medfly trasformazione della linea germinale in base all'elemento trasponibili Minos 11. Successivamente, il sistema originale è stato modificato 14 utilizzando altri approcci basati trasposoni. Questo è il caso del piggyBac dal Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Il protocollo è stato poi ulteriormente ottimizzato e questo ha permesso la trasformazione di altre specie tephritid 16-21 e anche di molti altri Ditteri 22-31. Tutti questi sistemi si basano sull'impiego di un tipico / helper sistema plasmidico trasformazione binaria vettoriale: artificiale, Transpo difettosofigli contenenti geni desiderati vengono assemblati in DNA plasmidico e integrato nel genoma dell'insetto fornendo l'enzima trasposasi 32. Un certo numero di linee medfly transgenici sono stati generati, con molteplici funzioni, tra cui i ceppi che trasportano un condizionale gene dominante letale che induce letalità, ceppi produttori di soli uomini prole e quindi non richiedono strategie di sessaggio aggiuntivi, e ceppi con sperma fluorescente, che può migliorare la precisione della fase di monitoraggio SIT 33-37. Anche se il rilascio in natura di organismi transgenici è verificato nei test pilota contro le zanzare solo 38,39, almeno una società sta valutando una serie di ceppi medfly transgenici per il loro utilizzo in campo 40.

Embrione microiniezione può anche favorire lo sviluppo di nuovi strumenti di genoma-editing, come la trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens), raggruppati regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR proteina associata 9 nucleasi (Cas9) e endonucleasi homing geni (HEGs), che permetteranno nuovi studi evolutivi e di sviluppo, così come l'espansione degli strumenti biotecnologico disponibile. Genome-editing approcci già permesso la generazione di sistemi gene-drive in zanzare 41, e il loro trasferimento al medfly è imminente. Qui si descrive un protocollo universale per microinjecting acidi nucleici in embrioni medfly che possono essere utili per tutte le applicazioni di cui sopra.

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Protocol

1. set-up sperimentale

  1. requisiti insectary
    1. Mantenere tutto C. vita capitata in scena a 25 ° C, 65% di umidità e 12/12 ore di luce / buio fotoperiodo.
    2. Mettere circa 1.500-2.000 pupe medfly in una gabbia 6 L. Utilizzare una gabbia con ottone maglia su un lato con fori abbastanza piccolo per stimolare ovideposizione 42. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia di fornire mosche con acqua per mezzo di azione capillare. Usare una miscela di lievito e zucchero (1,10) come fonte di cibo per gli adulti (Figura 1A). Aumentare la quantità di lievito (fino a 1: 3, lievito: zucchero) devono le femmine riescono a deporre le uova.
    3. Collocare un piatto riempito con acqua sotto la gabbia a raccogliere le uova depositate attraverso le maglie. Come femmine vergini possono oviposit, attendere fino a quando le mosche sono almeno 6-7 giorni prima di raccogliere le uova per gli esperimenti di microiniezione. Questo farà sì che le femmine sono accoppiatie che saranno state fecondate le uova.
    4. Raccogliere le uova filtrando l'acqua con un colino rete fine. Trasferire le uova dal filtro in una scatola di plastica contenente cibo larvale standard (1,5 LH 2 O, 100 ml di HCl 1%, 5 g ampio spettro antimicrobico disciolto in 50 ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzata, 1 kg crusca di grano tenero) con una pipetta Pasteur.
    5. Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente chiuso con un coperchio rete per permettere la circolazione dell'aria e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento (Figura 1B).
    6. Dopo circa 10 giorni, verificare la presenza di 3 ° larve instar che emergono dal cibo larvale e saltare giù nello strato di crusca per impupamento.
    7. 24 ore più tardi, raccogliere le pupe in una tazzina con una spazzola morbida e trasferirli ad una nuova gabbia per adulti. Adulti normalmente emergono 10 giorni dopo impupamento. La mosca emergente utilizza il ptilinum, una tasca gonfiabile situato sulla sua testa sopra esimoe di base delle antenne, per forzare l'estremità del puparium. Dopo la nascita, il ptilinum crolla definitivamente indietro all'interno della testa.
  2. Preparazione di 1 L di cibo per le larve microiniezione
    1. Sciogliere 2.5 g di agar in 300 ml di H 2 O.
    2. Warm 500 ml di H 2 O su una piastra di agitazione caldo e sciogliere 4 g di sodio benzoato, 4,5 ml di 37% di HCl, 42 g di estratto di lievito e 115 g di polvere disidratati carota.
    3. Aggiungere alla miscela una soluzione di 2,86 g ampio spettro antimicrobico sciolti in 10 ml di etanolo assoluto.
    4. Distribuire il mezzo in 15 cm rotonde piastre di Petri e lasciare raffreddare. Se necessario, conservare a 4 ° C.
  3. preparazione del vetrino
    1. Posizionare una striscia di 2 cm nastro biadesivo su un vetrino da microscopio (75 x 26 mm 2) e segnare i bordi con un pennarello la Cina, per prevenire la diffusione del petrolio e la conseguente essiccazione degli embrioni iniettati.
  4. Isolare plasmide DNA utilizzando kit disponibili in commercio 34. Precipitare il plasmide usando etanolo e risospendere in tampone di iniezione (0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5 mM KCl) alla concentrazione desiderata.
  5. Purificare in vitro sintetizzata lungo dsRNA con fenolo-cloroformio, precipitare con isopropanolo e risospendere in tampone iniezione 43.

2. Embryo Preparazione

  1. Posizionare un vassoio pieno di acqua sotto una gabbia contenente 6-7 giorni vecchi adulti.
  2. Lasciare le femmine per oviposit per 30 minuti e poi raccogliere gli embrioni filtrando l'acqua con un colino. Tenere sempre il filtro in acqua per evitare la disidratazione degli embrioni.
  3. Dechorionate gli embrioni immergendo il filtro per 5 secondi in una soluzione commerciale di candeggina al 50%.
  4. Lavare accuratamente gli embrioni ripetutamente immergendo il filtro in acqua ultrapura pulita (almeno4-5 volte). Infine, posizionare il filtro in acqua ultrapura pulita. Usare gli embrioni entro massimo 2 ore.
    NOTA: I tempi di microiniezione è legato alla necessità di iniettare in embrioni pre-blastoderma, durante una fase di divisioni nucleari prima cellularization. In questo modo il DNA iniettato da prendere-up nei nuclei, in particolare nei nuclei delle cellule germinali primordiali che provengono i gameti. In Drosophila, cellularization alle cellule polo inizia a circa 90 minuti dopo la fecondazione (a 25 ° C), con formazione blastoderma che si verificano circa 30 min più tardi 44, mentre nel cellularization medfly si svolge tra il 9 e il 12 ore 45,46.
  5. Orientamento degli embrioni in righe
    1. Utilizzando un pennello fine, raccogliere circa 50 embrioni e metterli su un disco di carta da filtro nero inzuppato d'acqua.
    2. Sotto uno stereomicroscopio dissezione, organizzare gli embrioni in fila sulla superficie superiore del nastro biadesivo suil vetrino da microscopio utilizzando un pennello fine (000) (Figura 1C).
      NOTA: allineare gli embrioni tutte con lo stesso orientamento, l'iniezione viene eseguita nel polo posteriore, dove germinali avrà origine; polo posteriore è opposta alla zona micropilo.
    3. Coprire gli embrioni con uno strato di olio clorotrifluoroetilene fare in modo che l'olio non fuoriesca la Cina confini marcatori (vedi 1.3).
      NOTA: Prima di coprire gli embrioni con olio, un ulteriore passo può essere eseguito: gli embrioni possono essere essiccate per alcuni minuti per ridurre il loro contenuto di liquido e facilitare l'ingresso della soluzione di DNA iniettato così. Questo può evitare embrione rottura durante l'iniezione o eccessiva fuoriuscita della soluzione iniettata, in conseguenza della elevata pressione del liquido.

3. Embrione microiniezione

  1. Riempire un ago (1-2 ml) con il DNA plasmide o una soluzione dsRNA (1-2 mg / mL) con una micropipetta.
  2. Eseguire microiniezione allo stereomicroscopio, utilizzando un micromanipolatore per controllare i movimenti dell'ago (Figura 1D). Utilizzare il palco microscopio per spostare la diapositiva.
    1. Posizionare il vetrino sul palco del campo di applicazione.
    2. Inserire la punta dell'ago nel polo posteriore dell'embrione (Figura 1E).
    3. Iniettare la soluzione attivando il sistema microiniezione con il pedale. Il liquido iniettato induce un aumento della pressione interna, causando un leggero movimento dell'embrione.
    4. Rilasciare il pedale e subito, ma delicatamente, rimuovere l'ago dall'embrione.
    5. Osservare un po 'di dispersione citoplasmatica al sito di iniezione.
      NOTA: per discriminare tra i potenziali effetti letali di DNA / RNA a doppio filamento / siRNA e la mortalità a causa della microiniezione proprocedura stessa, esperimenti di controllo devono essere eseguite. Questi comprendono l'iniezione di tampone soltanto, o, nel caso di esperimenti di genetica inversa, di una proteina fluorescente verde (GFP) -derived doppio filamento RNA (dsRNA-GFP), o siRNA.
  3. Dopo l'iniezione incubare gli embrioni a 25 ° C.

4. Procedure post-iniezione

  1. Due giorni dopo l'iniezione, controllare le diapositive per le larve schiuse (Figura 1F) sotto uno stereomicroscopio. Le larve può muoversi nell'olio ma devono essere trasferiti al cibo larvale appena possibile. Per questo motivo, controllare le diapositive più volte al giorno.
  2. Utilizzando un pennello fine (000), trasferire delicatamente le larve schiuse al cibo larvale carota-based. Trasferire fino a un massimo di 200 larve per ogni piatto Petri.
  3. Incubare le larve al 65% di umidità (25 ° C). Assicurarsi che il coperchio non si attacca al piatto, compromettendo ricambio d'aria.
  4. Mantenere le piastre di Petri con il coperchioper lo più chiusi in modo che ci sia ancora flusso d'aria alle larve. Per evitare l'asciugatura eccessiva, controllare i piatti tutti i giorni e, se necessario, aggiungere acqua per compensare l'evaporazione.
  5. Porre le capsule di Petri in un contenitore trasparente chiuso da un coperchio-rete e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento. Per quanto riguarda la routine di allevamento insectary, 3 ° larve instar saltare fuori del cibo larvale e pupate nella crusca.
  6. Raccogliere le pupe e metterli in una piccola gabbia per l'allevamento degli adulti e di screening (questo è Generazione 0, G0). Posteriore la progenie sul cibo larvale standard.
  7. Nel caso di esperimenti di trasformazione germ-line, verificare la presenza di eventuali individui trasformati nella prossima generazione (G1), come individui iniettati di solito sono chimere. eventi di trasposizione, infatti, potrebbe essersi verificato in uno qualsiasi dei nuclei del sincizio embrionali, che andranno a formare sia il germe-line o il soma.
    1. Poco dopo la nascita, anestetizzare gli individui G1 con CO 2 e verificare la presenza di transfeventi ormazione sotto un stereomicroscopio epifluorescenza. Per lo screening per la presenza di fluorescenza rossa, utilizzare un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mentre allo schermo per fluorescenza verde utilizzare il filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Mettere le persone trasformate in una piccola gabbia con wild-type adulti di sesso opposto e originare una nuova, inizialmente eterozigote, ceppo.

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Representative Results

Qui riportiamo due applicazioni di microiniezione dell'embrione diretto alla caratterizzazione funzionale di un gene di interesse (caso 1), e alla generazione di ceppi transgenici (caso 2), rispettivamente.

Consegna di dsRNA in embrioni di svelare la funzione del gene.

Il gene innexin-5 codifica una gap-junction che, negli insetti, si esprime in particolare nel gonadi femminili 43,47,48 maschili. Sulla base delle informazioni disponibili per le specie strettamente correlate, il silenziamento genico dsRNA indotta avrebbe dovuto provocare l'ablazione della linea germinale medfly femminile e maschile. Un totale di 2.400 embrioni sono stati iniettati con una miscela di ml 2 mg / dsRNA, da cui 548 larve schiuse e 216 adulti sopravvissuti (dati non pubblicati). In circa il 75% degli adulti, testicoli e ovaie sembrava essere o sotto-sviPED o totalmente assente (Figura 2). Quantificazione di innexin-5 trascrizione abbondanza nei abdomens di individui di entrambi i sessi confermato l'espressione significativamente inferiore del gene, rispetto ai controlli.

Generazione di ceppi transgenici con spermatozoi a fluorescenza.

Medfly ceppi transgenici con spermatozoi con l'etichetta fluorescente sono stati generati da Scolari e colleghi 34, iniettando gli embrioni con il DNA plasmide. La miscela conteneva due plasmidi mescolati in percentuali relative fisse: una, la "Helper plasmide", codificato il trasposasi piggyBac; l'altra, la "Donatore plasmide", conteneva il trasposone artificiale e portava due marcatori fluorescenti, una espressa nel soma dei maschi e femmine, l'altra specificamente nei testicoli. Il promotore del gene beta 2-tubulina, responsabile della tespressione Estes-specifico, è stata fusa al ATG con le sequenze codificanti proteine ​​fluorescenti turboGFP (costruire # 1260), o DsRedExpress (costruire # 1261), rispettivamente. Un totale di 821 embrioni sono stati iniettati, da cui 205 larve schiuse e 37 adulti sopravvissuti. 9 femmine e 8 maschi attraversamenti sono stati set-up, di cui 6 ha dato progenie fluorescente 34 (Licenza di riutilizzare tali dati ottenuti da Elsevier - Licenza Numero 3.796.240,75988 milioni). La trasformazione di successo ha portato allo sviluppo di ceppi con testicoli fluorescente verde e rosso, rispettivamente (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. apparecchiature insectary ed embrioni. (A) standard di allevamento gabbia contenente 1.500-2.000 adulti. Le femmine depongono le uova attraverso gli ottoni maglia nella parte anteriore della gabbia. Le uova sono raccolti in acqua. Sulla sinistralato della gabbia, il filtro utilizzato per filtrare le uova è visibile. (B) Due scatole di norma alimentare larvale contenente larve. Le scatole sono posti in una scatola di plastica trasparente più grande contenente crusca per facilitare impupamento; la rete che copre il testo è stato rimosso. (C) Embrioni disposte in file. I bordi del nastro a doppio rivestimento sulla diapositiva sono state contrassegnate con un pennarello porcellana bianca. Le uova allineati sul nastro saranno coperti con olio clorotrifluoroetilene. Apparecchiatura (D) Microiniezione (sinistra) collegato ad uno stereomicroscopio dotato di un micromanipolatore (a destra). (E) poli embrioni; la freccia rossa indica il polo posteriore (sito di iniezione), mentre la freccia nera indica il polo anteriore (la posizione micropilo). Barra di scala = 500 micron. (F) larva Hatched movimento nell'olio. Barra di scala = 500 micron. PleaSE Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Maschio e femmina con gonadi sviluppate sotto-. Femmina (a sinistra) e maschile (destra) sezionati tratti riproduttivi. Sopra: wild-type individui con gonadi normali. Sotto: interferito individui con gonadi sviluppate sotto-. MAG: Maschio Accessori Ghiandole; Sp: spermateche. Scala bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. transgenici maschi con testicoli fluorescenti e maschi adulti spermatozoi. Trasformate con rispettivamente costrutto # 1260 e # 1261,. Le frecce indicano il fluotesticoli fluore-. # 1260 maschi mostrano corpo e verde testicoli rossi, mentre # 1261 maschi mostrano testicoli rossi e corpi verdi. Barra di scala = 2 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l'analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche.

La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari 49 e embrione microiniezione facilita questi studi.

L'iniezione di DNA plasmide può essere utilizzato per modificare il genoma di insetti che utilizzano l'inserimento del gene trasposasi-mediata, e, più recentemente, strumenti di genome-editing (ad esempio, TALEN, CRISPR / Cas9, HEGs). Queste tecniche hanno già permesso lo sviluppo di ceppi di molteplici specie di insetti che potrebbero essere utilizzate per i programmi di controllo dei parassiti, mirando sia a eradicazione o alla sostituzione della popolazione selvatica wesimo insetti con caratteristiche biologiche modificate. In questo protocollo, si descrive un metodo ottimizzato per medfly microiniezione embrione sia con il DNA plasmide o dsRNA.

La disponibilità di ben consolidata e conveniente semi-secco medio delle larve per allevamento medfly, nonché ampie informazioni molecolari raggiunto nel corso degli anni dai ricercatori che studiano la determinazione del sesso e il processo cellularization in questa specie, facilitare notevolmente la creazione di un affidabile embrione protocollo microiniezione. In particolare, il protocollo allevamento è stato ottimizzato per garantire la massima fertilità e vitalità degli embrioni. Questo è importante per massimizzare la probabilità di ottenere adulti vitali con il minor numero di embrioni iniettati possibili. Diversi protocolli sono disponibili per allevamento medfly, come il cibo larvale carota-based che descriviamo allevare le larve iniettato. Tuttavia, questo metodo è più costoso e la sua preparazione è più tempo rispettoaltri mezzi di comunicazione utilizzato per l'allevamento di routine.

Un importante ostacolo all'utilizzo della microiniezione è il danno non specifico causato dalla manipolazione meccanica degli embrioni. Questo include più variabili che influenzano la sopravvivenza di embrioni, come la perforazione delle membrane embrionali con il pennello utilizzati per orientare gli embrioni, i volumi iniettati, il sito di iniezione e del tampone, e il tipo di ago usato 50. Alcuni di questi parametri sono stati ottimizzati, come i volumi iniettati e buffer. Nel caso degli aghi, possono anche essere prodotti internamente mediante estrattore, e questo richiede una fase di ottimizzazione per determinare il protocollo ideale.

Tra i principali svantaggi della procedura di microiniezione è anche dechorionation: anche se questo passaggio è essenziale per fare le uova più facile da gestore (ad esempio, meno scivoloso) e per facilitare l'iniezione, l'esposizione prolungata a candeggina può influenzare pesantemente embrionale vitalità. for questo motivo, il protocollo descriviamo qui riporta l'uso di un tempo molto breve dechorionation (5 sec), che è stato stabilito un buon compromesso tra la rimozione del tasso corion e la sopravvivenza.

I protocolli utilizzati per posteriore della successiva fase di vita sono anche rilevanti. Le larve nati da embrioni iniettati deve essere rimosso dall'olio appena possibile. Olio è infatti essenziale per prevenire l'essiccamento degli embrioni, ma può essere nociva per le larve. Il metodo utilizzato per rimuovere le larve, il tempo trascorso nell'olio, e il tipo di cibo usato sono tutte variabili importanti che devono essere considerati in quanto possono compromettere il tasso di sopravvivenza finale.

Quando lo screening per adulti e le larve, i metodi di immobilizzazione possono essere anche critica. Adulti medfly possono essere immobilizzati utilizzando ghiaccio o di CO 2, ma l'esposizione prolungata potrebbe essere deleterio per la sopravvivenza degli adulti. In alternativa alla embrione microiniezione, somministrazione orale ha dimostrato diessere un metodo meno invasivo e potenzialmente ad alto rendimento per eseguire saggi RNAi Può essere particolarmente efficace nelle specie che non sono suscettibili di microiniezione, nonché per il controllo dei parassiti RNAi-mediata in popolazioni di campo.

In questo lavoro, due casi sono stati segnalati come esempi delle possibili applicazioni del protocollo descritto: in primo luogo, la trasformazione di successo attraverso l'inserimento del gene trasposasi mediata del genoma medfly, che ha portato alla creazione di molteplici ceppi con testicoli fluorescenti. Utilizzando una procedura analoga microiniezione, è anche possibile iniettare dsRNA, con gli effetti del knockdown essere visibile fino allo stadio adulto.

La creazione di un protocollo microiniezione affidabile per gli embrioni medfly ha aperto la strada a prendere in considerazione i ceppi geneticamente modificati come strumento per controllare le mosche in natura, come alternative o complementari strategie per approcci classici, tra cui il Sterile InsectTecnica. Infine, i recenti progressi nella tecnologia per la microiniezione automatizzata negli embrioni di pesce zebra potrebbero potenzialmente aiutare lo sviluppo di sistemi di lancio ad alto rendimento, con importante rilevanza per la creazione di ceppi transgenici della medfly e altri parassiti rilevanti 51.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x injection Buffer 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5 mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA Phenol-Chloroform purified
Standard Larval food 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer's yeast, 1 kg soft wheat bran
Carrot Larval Food 2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L
Adult Food yeast extract and sugar (1:10)
Microscope slides Sigma-Aldrich Z692247
Injection needles  Eppendorf 5242956000
Microloaders Eppendorf 5242956003
Double slided tape
Whatman Black circle paper Sigma-Aldrich Z695505
Bleach Diluite 1:2 before use
Paintbrush (000)
Micromanipulator Narishige MN-153
Microinjector Eppendorf Femtojet
Adult cages
Chlorotrifluoroethylene oil Sigma-Aldrich H8898
Ceratitis capitata The strain used is ISPRA

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References

  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459 (2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582 (2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. e216 (2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. e219 (2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4 (2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771 (2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12 (2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11 (2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

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