Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

Il protocollo sviluppato da Liz ci permette di determinare il tasso di fecondazione della mosca bianca. L’applicazione di questa tecnica migliorerà la nostra comprensione del comportamento e dell’ecologia delle mosche bianche. Le mosche bianche sono aplodiploidi, quindi il tasso di fecondazione è uguale al rapporto sessuale all’ovideposizione.

Questo protocollo è il primo descritto per mosche bianche, a nostra conoscenza, e può essere completato entro tre ore. Per iniziare, fare un foro copribile nel coperchio della piastra di Petri per inserire e rimuovere le mosche bianche adulte. Impostare una camera di umidità e modellare una sonda inserendo un perno sottile con un comodo angolo di lavoro in una punta di pipetta fusa per creare una sonda sottile.

Opzionalmente, allungare le punte delle pipette di vetro con calore per una più facile manipolazione delle uova di mosca bianca. Quindi, lascia che le mosche bianche femminili oviposit su una foglia pulita, tagliate per adattarsi all’agar in una piastra di Petri. Durante l’ovideposizione della mosca bianca, pulire uno scivolo al microscopio con acqua e sapone.

Asciugarlo bene e allungare un pezzo di pellicola di paraffina su un’estremità per consentire ai liquidi di formare gocce e uova per essere visti più facilmente. Per dechorionare le uova, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per aggiungere gocce di soluzione di candeggina di ipoclorito di sodio all’83% al film di paraffina subito prima della rimozione degli adulti e della raccolta delle uova. Candeggina e acido acetico glaciale sono entrambi corrosivi.

Devono essere maneggiati con guanti in un cappuccio o in un’area ben ventilata. DAPI è anche irritante e deve essere maneggiato con guanti. Quindi, rimuovere le mosche bianche adulte dalla foglia e posizionare la foglia al microscopio.

Sollevare con cura ogni uovo dalla sua base fino a quando il pedicello non viene rimosso dalla foglia. Esercitati su molte uova prima di eseguire questo protocollo. Solleva lentamente le uova dalla base e sollevalo completamente dalla foglia una volta che puoi vedere che il pedicello dell’uovo viene rimosso dalla foglia.

Trasferire da due a tre uova ad ogni goccia di candeggina e lasciarle per 10 minuti. Per fissare le uova, utilizzare una pipetta di vetro per scartare la candeggina. Quindi, aggiungere gocce di acido acetico glaciale e attendere tre minuti.

Quindi, rimuovere l’acido acetico glaciale e aggiungere gocce della soluzione di Clarke. Quindi, attendere 10 minuti fino a quando la maggior parte della soluzione è evaporata. Aggiungere gocce di 70% di etanolo e attendere di nuovo per 10 minuti.

Per macchiare le uova, rimuovere prima l’etanolo residuo. Quindi, aggiungi gocce di 1xPBS alle uova per ottenere il pH vicino alle sette. Mettere lo scivolo del microscopio in una camera di umidità per evitare l’essiccazione.

Dopo 30 minuti, rimuovere 1xPBS e aggiungere gocce di 1 microgrammi per millilitro DAPI. Mettere lo scivolo del microscopio in una camera di umidità scura e attendere almeno 15 minuti. Per lavare le uova, rimuovere prima la soluzione DAPI.

Quindi aggiungere gocce di 1xTBST alle uova. Dopo cinque minuti, rimuovere 1xTBST. Ripetere questo lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.

Dopo il lavaggio finale, pipettare con cura tutte le uova dal parafilm su una parte pulita dello scivolo del microscopio. Rimuovere il TBST in eccesso e aggiungere 20 microlitri di supporti di montaggio. Infine, posizionare uno scivolo di copertura pulito sopra le uova, sigillare lo scivolo di copertura con smalto chiaro per la conservazione a lungo termine e procedere all’imaging utilizzando un microscopio fluorescente.

La dechorionazione delle uova seguita dalla colorazione nucleare DAPI ha permesso l’assegnazione della fecondazione e del sesso embrionale se osservata con un microscopio fluorescente. Il pronucleo femminile è vicino al centro sia dell’uovo femminile fecondato che dell’uovo maschio non fecondato, e lo sperma è visibile come una striscia luminosa vicino all’apice dell’uovo femminile. Un’applicazione di questa tecnica è quella di determinare se gli endosimbionti batterici influenzano i rapporti sessuali primari delle mosche bianche.

Ad esempio, i rapporti sessuali primari delle uova deposte dalle mosche bianche B.tabici infettate e non infette da Rickettsia non hanno mostrato alcuna differenza significativa tra il rapporto tra i sessi nei due trattamenti. Per quanto riguarda le uova allevate fino all’età adulta, risultati simili sono stati osservati per gli adulti infetti e non infetti da Rickettsia, che non forniscono prove, almeno in questo studio, di maggiori tassi di fecondazione da parte delle femmine infettate da Rickettsia. Utilizzando questo protocollo, si può determinare se lo sperma interspecifico può fecondare le uova.

Se non si osserva alcuna fecondazione, si potrebbe eseguire il backup e cercare di vedere se lo sperma viene trasferito durante l’accoppiamento guardando nella spermateca della femmina. Se si verifica la fecondazione, si potrebbe confrontare il rapporto sessuale degli adulti con il tasso di fecondazione per determinare la vitalità dello sviluppo ibrido della prole.