Phagosome Migration et Velocity Mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le VIH-1

L’objectif général de cette analyse est de quantifier la vitesse des phagosomes dans les macrophages infectés par le VIH-1 à l’aide d’une méthode simple de suivi manuel. L’avantage de ce protocole est de fournir une méthode simple pour calculer les mouvements relatifs de groupes d’objets à l’intérieur d’une cellule qui peuvent être soit en mouvement, soit déformés. Cette méthode donne un aperçu du mouvement des phagosomes dans les macrophages infectés positifs à la GFP, mais elle pourrait être utilisée pour d’autres compartiments intercellulaires dans les cellules marquées par fluorescence.

Après avoir infecté des macrophages dérivés de monocytes humains et opsonisé des cellules sanguines élevées chez le mouton, selon le protocole textuel, mettez en place un test de phagocytose à l’aide d’un système d’imagerie confocale, tel qu’un microscope à disque rotatif, équipé d’une chambre de chauffage à 37 degrés Celsius, avec du dioxyde de carbone. Avant l’expérience, allumez la chambre de chauffe pour chauffer la platine du microscope à 37 degrés Celsius. Allumez ensuite le microscope et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie.

Optimisez les paramètres d’imagerie, tels que la vitesse de balayage, l’agrandissement, la résolution, etc., pour avoir au moins une cellule par champ et pour imager une image toutes les minutes entre 60 et 120 minutes. Placez la parabole d’imagerie sur la platine du microscope. Ajustez la mise au point et l’emplacement pour ne trouver qu’un seul macrophage entier infecté par le VIH-1 sur le terrain.

Utilisez les paramètres d’excitation et d’émission appropriés en fonction du système d’imagerie et de la sonde utilisés. Incluez un canal en fond clair. Optimisez son apparence en ajustant le temps d’exposition.

Ensuite, retirez la boîte d’imagerie et ajoutez un millilitre de cellules sanguines élevées pour moutons, ou suspension SRBC, à sept fois dixième du sixième SRBC par millilitre, dans la boîte. Centrifugez la boîte à 500 fois g pendant deux minutes à température ambiante pour synchroniser la phagocytose, puis enregistrez le temps à la fin de la centrifugation, et remettez la boîte sur la scène. Optimisez la mise au point et réglez le haut et le bas de la pile avec une distance de pas de 0,3 micromètre.

Démarrez l’acquisition des piles Z d’images GFP et BF sur toute l’épaisseur de la cellule et enregistrez la vidéo en accéléré dans le format de fichier natif du système d’imagerie. Pour effectuer le montage vidéo, dans le logiciel de montage vidéo, cliquez sur le menu déroulant Applications et sur l’onglet Examiner les données multidimensionnelles. Pour ouvrir le fichier, cliquez sur Sélectionner le fichier de base, puis sur Sélectionner le répertoire.

Dans la zone Ensembles de données, sélectionnez l’acquisition à analyser et cliquez sur Afficher. Pour représenter l’infection dans une projection Z, dans la boîte Longueurs d’onde, sélectionnez la longueur d’onde de 491 nanomètres et cliquez sur l’onglet Projection Z avec tous les plans. Ensuite, pour analyser une séquence temporelle, dans la zone Longueurs d’onde, sélectionnez Longueur d’onde BF et choisissez le plan optimal sur l’axe Z pour distinguer les SRBC externes, les SRBC internes et le noyau.

Enregistrez les montages vidéo en cliquant sur l’onglet Sélection Xs puis sur Charger les images. Enfin, enregistrez les images chargées au format tif. Après avoir téléchargé le plugin de suivi manuel Image J, ouvrez le plugin dans Image J, puis ouvrez la séquence d’images à analyser.

Entrez les paramètres, tels que l’intervalle de temps, qui représente le temps entre les images adjacentes, et l’étalonnage XY, qui représente la distance par pixel. Pour lancer le suivi, cliquez sur Ajouter une piste, et cliquez sur un centre SRBC la première fois lorsqu’il est internalisé. L’image suivante s’affiche automatiquement.

Pour plus de commodité, pour voir les SRBC sur le canal BF, utilisez la fenêtre de luminosité et de contraste pendant le suivi. Continuez à cliquer sur le centre SRBC dans toutes les images pour avoir différentes positions pendant le temps. Entre chaque suivi SRBC, cliquez sur Fin de piste, puis sur Ajouter une piste pour commencer une nouvelle piste.

Le numéro de suivi changera dans la deuxième colonne du tableau des résultats. Commencez à suivre le noyau pour avoir sa position dans toutes les images en cliquant sur son centre comme effectué précédemment. Enregistrez les données dans une feuille de calcul, puis ouvrez-la dans un tableur et créez un nouveau fichier de feuille de calcul.

Transférez dans ce nouveau fichier l’heure, les coordonnées X et Y du SRBC et du noyau. Enfin, utilisez le tableur pour calculer la distance parcourue des phagosomes contenant des SRBC vers le noyau, et la vitesse des phagosomes pendant les cinq premières minutes après l’internalisation des SRBC selon le protocole texte. L’analyse en temps réel du mouvement des phagosomes dans les macrophages vivants infectés par le VIH à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif est présentée ici.

Les paramètres du canal en champ clair sont essentiels pour voir le noyau et pour distinguer les SRBC externes des SRBC internalisés. Ce graphique représente la distance parcourue pour un phagosome dans les HMDM non infectés au cours des cinq premières minutes suivant l’internalisation d’un SRBC en fonction du temps. La vitesse du phagosome est la pente de la courbe de régression linéaire illustrée ici.

Enfin, dans cette étude, il a été observé que la vitesse du phagosome pendant les cinq premières minutes après l’internalisation chez les HMDM infectés par le VIH est plus faible que chez les HMDM non infectés. Ces méthodes ont démontré que le mouvement des phagosomes vers le centre cellulaire, et donc la maturation des phagosomes en phagolysosomes, était altéré dans les macrophages infectés par le VIH. Après son acquisition, une cellule peut être traitée pour la microscopie électronique corrélative ou la population entière peut être fixée pour la microscopie à immunofluorescence classique et l’analyse statistique.

La phagocytose est très sensible à la température et, par conséquent, la température à l’intérieur de la chambre de chauffage et du milieu de la boîte de culture doit être maintenue à une température constante de 37 degrés Celsius tout au long de la procédure. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être dangereux et que des précautions telles que le travail dans une salle de biosécurité et le port d’un équipement de protection individuelle doivent être prises conformément à la législation locale.