Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University
Published 12/14/2016
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Immunology and Infection

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Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

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Abstract

Das Kennzeichen der humoralen Immunität ist funktional ASCs zu erzeugen, das zu synthetisieren und ABS spezifisch für ein Antigen (Ag), beispielsweise einem Pathogen sekretieren, und sind für Wirtsabwehr eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung des funktionellen Status der humoralen Immunantwort eines Individuums, sowohl Serum Abs und Zirkulieren ASCs als funktionelle Auslesungen üblicherweise gemessen. Beim Menschen ist peripherem Blut die bequemste und leicht zugänglich Probe, die zur Bestimmung der humoralen Immunantwort durch den Host B-Zellen hervorgerufen werden können. Distinct B-Zell-Untergruppen, einschließlich ASCS, kann über die Auswahl mit linienspezifischen Ab-konjugierte Mikrobeads oder über Zellsortierung mit Durchflusszytometrie direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden. Darüber hinaus kann gereinigtes naiven und Gedächtnis-B-Zellen in Kultur in ASCs aktiviert und differenziert werden. Die funktionellen Aktivitäten von ASCs zu Ab Sekretion beitragen kann durch ELISpot quantifiziert werden, was ein Assay, Enzym konvergiert ist-linked immunoabsorbance-Assay (ELISA) und Western-Blot-Technologien, um die Aufzählung einzelner ASCS auf Einzelzellebene zu ermöglichen. In der Praxis hat sich die ELISPOT-Tests zunehmend verwendet Impfstoffwirksamkeit zu bewerten, wegen der Leichtigkeit der Handhabung einer großen Anzahl von Blutproben. Die Verfahren zur Isolierung von humanen B - Zellen aus dem peripheren Blut, die Differenzierung von B - Zellen in ASCs in vitro und die Verwendung von ELISpot für die Quantifizierung von Gesamt - IgM- und IgG-ASCs wird hier beschrieben.

Introduction

B-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der humoralen Immunität. Sie entwickeln sich zunächst im Knochenmark und geben Sie den Blutstrom als naive B-Zellen, die in die lymphatischen Geweben, wie der Milz wandern können, Lymphknoten und Mandeln, für die weitere Entwicklung. Bei Ag Begegnung einige naive B-Zellen wandern in Lymphfollikeln, wo Keimzentrum-B-Zellen in den Speicher B-Zellen und Plasmablasten unterscheiden können (PBS) / Plasmazellen (PCs). Während die meisten PBs / PCs in den Blutstrom Egress, liegen einige schließlich im Knochenmark terminale Differenzierung in langlebigen PCs 1 zu unterziehen. B - Zellen im Umlauf sind heterogen, und in einem stabilen Zustand, PBs / PCs sind selten im peripheren Blut 2. Als Folge der Verfügbarkeit von Lineage-spezifische Oberflächenmarker hat Durchflusszytometrie eine beliebte Methode zur Identifizierung und Charakterisierung der B-Zell-Untergruppen in peripherem Blut werden. Eine erweiterte Anwendung von Fluss cytometry ist die Zugabe eines Zellsortierer-Funktion, die die Trennung und Isolation der einzelnen Untergruppen von B-Zellen mit hoher Reinheit ermöglicht. Basierend auf der Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Entwicklungsstadien werden menschliche zirkulierende B - Zellen allgemein in drei Haupt Subpopulationen: naive B - Zellen (CD19 + CD27 - CD38 -), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 + CD27 + CD38 -) und PBs / PCs (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Abbildung 1). Naive B-Zellen von Natur haben Ags nicht auf. Jedoch können sie differenziert IgM + CD27 + Gedächtnis - B - Zellen sein. Obwohl naive B - Zellen sind homogene B-Zell - Antigenrezeptor (BCR) -assoziierten Moleküle (zB CD19, CD20 und CD22) sie heterogen in ihrer Immunoglobulin Repertoire in 5 ausdrückt. Die Mehrheit der CD27 + Gedächtnis - B - Zellen können in CD27 unterschieden werden+ / hallo CD38 + PBs / PCs 6. Darüber hinaus Gedächtnis - B - Zellen und PBs / PCs sind polyklonalen und zeigen Entwicklungs und funktionelle Heterogenität 4-7. PBs / PCs im Umlauf sind in der Regel von kurzer Dauer und nicht CD138 Ausdruck bringen, sondern solche aus im Knochenmark zu beruhigen wird terminal differenzieren und werden langlebig. Ausdifferenzierten PCs exprimieren CD138 und CD27 - Moleküle auf ihren Oberflächen 8 herunterregulieren. Da sowohl PBs und PCs geeignet sind, sezer Abs, in vielen Fällen sind sie gemeinsam als ASCS bezeichnet. Im Gegensatz dazu weder naive B - Zellen noch Gedächtnis - B - Zellen können erhebliche Mengen an Abs 9-10 produzieren. Dennoch, als isoliert, sowohl naiven und Gedächtnis - B - Zellen können in 3 in ASCS differenziert - 10 Tage , an denen 6 in der richtigen Kulturbedingungen gelegt, 15.11. In der Tat, abgeleitet ASCS von in vitro Differenzierung teilen ähnliche Oberfläche Ausdrücke von CD27 und CD38 mit denen direkt isoliert from peripheren Blut 6. Darüber hinaus unterscheiden sich die ASCs in vitro eine geringe Oberflächen CD20, ähnlich dem von zirkulierendem PBs / PCs 6 auszudrücken. Obwohl die Kultur stamm ASCs alle kurzlebigen sind, können sie Abs sezernieren, was anzeigt, dass sie funktionell kompetent sind und in der Lage der humoralen Immunität beitragen.

Beide ELISA und ELISpot sind bei weitem die am häufigsten angewandten Methoden, mit denen auf die humorale Immunantwort funktionelle Informationen zu erhalten. ELISA ist ein 96-Well - Platte-basierten Assays, und es ist häufig der Titer des Serums Ag-spezifischen Abs und anderen Analyten (zB Cytokine) zu messen. Es ist bequem und skalierbar. ELISA ist ein Festphasen Enzym - Assay zu verwenden , 16 das Vorhandensein von Abs oder anderen Substanzen, wie Serum, in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Die Auslesungen aus Serum ELISAs wurden, um die Immunantwort des Körpers darzustellen weit verbreitet. Ein Werkzeug erforderlich für den Erwerb von Readouts von ELISA-Assays ist ein spektrophotometrische Mikrotiterplatten-Lesegerät. Der Leser kann die optische Dichte (OD) der Endprodukte typischerweise bestimmen , aus der Reaktion von Meerrettich - Peroxidase (HRP) -konjugierte Detektions Abs und ihre spezifischen Substrate resultierenden 17. Hinsichtlich der humoralen Immunantwort auf die Berichterstattung, Serum Ab Ebenen durch ELISA bestimmt bezeichnen die kollektive, nicht aber einzelne, Leistung von ASCS im Körper. Außerdem versagt ELISA berücksichtigt die Beteiligung von Gedächtnis-B-Zellen, die sekretieren Abs nicht.

Wie ELISA ist ELISpot ein weit verbreitetes Verfahren zum Nachweis und der Überwachung der Immunantwort in peripheren Blutproben 17-18. ELISpot ist eine Technik, um einen Sandwich-ELISA bezogen. Darin werden die Zellen in das Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membran-backed Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten gegeben für eine Kurzzeitkultur. Der ELISPOT-Assay ist analog zur Durchführung Western-Blotting auf einer Mikrotiterplatte und developing die Flecken auf der PVDF-Membran in jeder Vertiefung. Ein automatisiertes ELISpot Lesesystem oder ein Stereomikroskop für die manuelle Zählung ist nicht erforderlich. Der Hauptvorteil der ELISpot in einer Immunantwort Erfassungs ist seine hervorragende Empfindlichkeit in der Quantifizierung von ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen. Er berichtet ihre funktionellen Aktivitäten in humoralen und zellulären Immunität sind. Bei der Messung der humoralen Immunfunktion, Serum Ab durch ELISA und der Anzahl von ASCs bestimmt Ebenen durch ELISpot aufgezählt werden oft korreliert, aber die Daten Ablesungen aus diesen beiden Assays haben einige Unterschiede in der funktionellen Auswirkungen 19-20. Der Hauptvorteil der ELISpot ist die Empfindlichkeit der Methode. Die Höhe des Serum-Ab-Titer, wie durch ELISA berichtet wird, semi-quantitativ als OD Ablesungen dargestellt, um die relative Ab Ebene bezeichnet, oder mehr quantitativ, als Konzentration Ablesungen, wenn eine bekannte Menge an den richtigen Isoformen der ABS ist als Referenz enthalten. Im Gegensatz dazu sind die Ergebnisse der ELISpot presented als die absolute Zahl der Anbeterinnen in einem Zellpool von Interesse (zB unfraktioniertem einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) und gereinigte B - Zellen aus PBMCs). ELISpot können einen einzelnen ASC erkennen, aber ELISA erfordert Ab Mengen von ASCS optimierten Assay abhängigen Konzentrationen vor der Messung zu erreichen. Daher ELISpot ist offensichtlich überlegen ELISA in Empfindlichkeit der Quantifizierung. Außerdem ist ELISpot auch für die in vitro differenzierte ASCs von aktivierten Gedächtnis - B - Zellen zu quantifizieren. Gedächtnis-B-Zellen sezernieren Abs nicht aber in ASCS bei Aktivierung unterscheiden kann; Sie haben daher keinen Beitrag zum Serum durch ELISA nachgewiesen Abs. Somit ist ELISpot die Methode der Wahl bei der Messung der Immunantwort des Speichers B-Zellen nach der Aktivierung in Kultur zirkuliert. Es ermöglicht die Überwachung der Aufrechterhaltung der Langzeit humorale Immunität.

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Protocol

Menschliche periphere Blut muss von gesunden Spendern unter informierte Einwilligung eingeholt werden, und die Verwendung von Blutproben müssen den genehmigten Leitlinien, die einzelnen Institutional Review Boards entsprechen. In dieser Studie auf das Protokoll menschlichem Blut an einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISPOT - Tests verwenden (Abbildung 3) wurde durch den Internal Review Board der National Taiwan University Hospital (Protokollnummer 201307019RINB) zugelassen.

1. Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

  1. Zeichnen ~ 10 ml Blut aus dem Median Cubitalvene (in der Ellenbeuge anterior zum Ellenbogen) in einen 15-ml - Röhrchen mit K 2 EDTA (1,5 bis 2,0 mg / ml Blut) und sofort wird das Röhrchen mehrere Male Gerinnsel zu verhindern Bildung.
  2. 35 ml autoklavierten (121 ° C, 15 min) von roten Blutzellen (RBC) Lyse - Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, und 1 mM EDTA; pH 7,4) an dem Rohr die frische Blutprobe (≥ 3: 1 enthält, vol / vol) und Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für nicht mehr als 5 min.
    HINWEIS: Das Aussehen der Lichtdurchlässigkeit durch das Rohr zeigt die Beendigung der RBC-Lyse.
  3. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet in der Farbe weiß ist.
  4. Das Pellet mit 10 ml autoklavierten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4 und 1,47 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) und zentrifugiert wie in Schritt 1.3.
  5. Überstand verwerfen, das Pellet mit 10 ml RPMI 1640-Medium (ergänzt: 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 0,25 ug / ml Amphotericin B, und 2 mM L-Glutamin), und die dann die Platte Zellen in einer 10 cm Kulturschale (10 ml Blut pro Schale). Die Schale in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 30 min.
  6. wirbeln Sie leicht die Kulturschale ein paar Mal und legen Sie dieKulturmedium (Suspensionszellen) in 15-ml-Kunststoff konische Röhrchen. Entsorgen Sie die anhaftenden Zellen (meist Makrophagen) auf den Kulturschalen.
  7. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen.
  8. Das Pellet mit 1 ml RPMI-1640-Medium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der isolierten Leukozyten beträgt normalerweise mehr als 90% durch Trypanblau-Ausschluss.
  9. Zentrifuge wie in Schritt 1.7 und Resuspendieren der Zellen in ~ 200 & mgr; l kaltem PBS - Puffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von von 5 bis 10 x 10 6 Zellen / mL.
  10. Werden 5 & mgr; l von biotinyliertem anti-humanem AB - Cocktail spezifischen Blutzellen (für die negative Selektion von B - Zellen) pro 10 6 Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min 21.
    HINWEIS: Die Anti-Human-Ab-Cocktail sollte zumindest Abs spezifisch für CD2 (oder CD3), CD14 und CD16 umfassen.
  11. Fügen Sie einen 10-fachen Überschuss Volumensteriler PBS zu den Zellen, Zentrifuge bei 600 × g für 5 min und der Überstand verworfen.
  12. In gleichen Mengen an Streptavidin-konjugierten Microbeads (5 & mgr; l pro 10 6 Zellen) zu dem Pellet und gründlich mischen.
  13. Inkubieren auf Eis für 30 min in einem 15 ml konischen Kunststoffrohr.
  14. 2 mL PBS-Puffer in das Rohr.
  15. Das Röhrchen wird in einem Magnetfuß und Inkubation bei RT für 8 min. Die braunen Microbeads allmählich neben dem Magneten 22 an der Rohrwand befestigen.
  16. Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer verbleiben, übertragen sorgfältig den Überstand in ein neues steriles 15-ml - Röhrchen 22.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 1,14-1,16, und verbinden die beiden Überstände, die die unberührte B-Zellen enthalten. Entsorgen Sie die Mikrokügelchen.
  18. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Überstand verwerfen.
  19. Das Pellet in RPMI 1640-Medium für Downstream-Experimenten.
    HINWEIS: In der Regel, 1 - 5 x 10 5 B - Zellen witha Reinheit von mehr als 95% von 10 ml peripherem Blut 23 isoliert werden.

2. Reinigung und Trennung von Speicher- und Naïve B-Zellen aus B-Zellen isoliert

  1. Verwenden gereinigten Zellen aus Schritt 1 und bestimmen die Zellzahl einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler verwendet wird.
  2. Resuspendieren der Zellen in 100 & mgr; l kaltem PBS-Puffer nach der Zentrifugation bei 600 xg und RT für 5 min.
  3. Hinzufügen von 1 bis 2 & mgr; g biotinyliertem CD27 mAb pro 10 6 Zellen und Inkubieren auf Eis für 30 min.
  4. 10 ml PBS-Puffer in das Röhrchen und Zentrifugieren bei 600 xg für 5 min.
  5. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 50 & mgr; l PBS-Puffer.
  6. Hinzufügen gleiche Mengen von Streptavidin magnetische Microbeads (1 - 2 & mgr; g / 10 6 Zellen) zu den Zellen in einem 15-ml - Kunststoff - konisches Rohr.
  7. Vorsichtig mischen gut und Inkubation auf Eis für 30 min.
  8. Hinzufügen von 2 bis 3 ml PBS-Puffer in das Röhrchen.
  9. Setze dasRohr in einen magnetischen Ständer und für 8 Minuten bei RT inkubieren, die braunen Microbeads zu ermöglichen an der Seite am nächsten zu dem Magneten zu befestigen.
  10. Mit dem Rohr in dem magnetischen Ständer übertragen sorgfältig den Überstand-Fraktion in ein neues steriles Röhrchen. Diese Fraktion enthält die angereicherten CD27 - naiven B - Zellen.
  11. Wird in 5 ml der Röhre die Mikrokügelchen enthält , und resuspendieren sanft die Mikrokügelchen (dh der angereicherten Fraktion von CD27 + Gedächtnis - B - Zellen) , 24-25.
  12. Zentrifuge bei 600 × g bei RT für 5 min. Resuspendieren der Pellets mit RPMI 1640-Medium für die Downstream-Experimenten.
    HINWEIS: In der Regel ~ 30 - gereinigt werden können , 60% der B - Zellen als CD27 + Speicherzellen von den PBMCs eines gesunden Spenders 7, 25-26.

3. Zellsortierung für die Sammlung von Naïve B Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und PBs / PCs

  1. Unter Verwendung der aus Schritt gereinigten Zellen 1, bestimmen die Zellzahl eine hemocytome mitter oder eine automatische Zellzähler.
  2. Resuspendieren der Zellen in kaltem PBS - Puffer bei einer Konzentration von 10 7 pro ml in einem 5 ml - Polystyrolröhrchen.
  3. Merken 1 - 2 ug Human - IgG pro 10 6 Zellen und Inkubation auf Eis für 10 min für den Block Fc.
  4. 1 & mgr; g jedes der Anti-CD19-APC (Klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (Klon: O323) und Anti-CD38-PE (Klon: HIT2) pro 10 6 Zellen; gut mischen und Inkubation auf Eis für 30 min 4, 27.
  5. In den letzten 5 Minuten in Schritt 3.4, fügen Sie 5 ul der kommerziellen 7-Aminoactinomycin D (7-AAD).
  6. 2 mL PBS zu dem Rohr, vortex und Zentrifuge bei 600 × g für 5 min.
  7. Resuspendieren der Zellen in Sortierpuffer (steriles PBS mit 2% BSA und 2 mM EDTA) bei einer Konzentration von 1 bis 5 x 10 7 Zellen pro ml in einem Rohr 15 mL.
  8. Filtern Sie die Zellen durch eine Nylon-Mesh-Zelle Sieb (40 & mgr; m Porengröße) Zellklumpen zu beseitigen.
  9. Trennen der Zellen mit einer durchflusszytometrischen sorter ausgestattet mit drei Laser: violett (405 nm), Blau (488 nm) und Rot (640 nm).
    HINWEIS: Der blaue Laser allein reicht für 3-Farben - 27-28 Durchflusszytometrie.
  10. Sortieren Sie die Zellen in drei 15-ml - Röhrchen für die gleichzeitige Sammlung von naiven B - Zellen (CD19 + CD27 -) (5 ml RPMI - Medium enthält), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 + CD27 +) und PBs / PCs (CD19 + CD27 + / hallo CD38 +) 3-4, 28.
    HINWEIS: Sortieren naiven und Gedächtnis-B-Zellen können kultiviert werden, wie in Schritt 4 beschrieben.

4. In vitro Differenzierung von isolierten humanen CD19 + B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen CD19 + CD27 + und CD19 + CD27 - Naïve B - Zellen

  1. Unter Verwendung der gereinigten Zellen in den Schritten 1.19, 2.10, 2.11 und 3.10, bestimmen die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder eine automatische Zellzähler.
  2. Resuspendieren der Zellen mit RPMI 1640-Medium,bei einer Konzentration von 1 - 10 x 10 5 pro mL und sie in die Vertiefungen einer 12-Well - Platte aliquotiert.
  3. Hinzufügen CpG (ODN 2006) bei 5 & mgr; g / 10 6 Zellen / mL 18, 29.
  4. Kultur der Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 5 Tage.
  5. Ernten Sie die Zellen aus jeder Vertiefung, legen Sie sie getrennt in 15-ml-Röhrchen, 5 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren bei 600 xg und RT für 5 min.
  6. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eine automatische Zellzähler. Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1 - 10 x 10 5 pro ml mit RPMI - 1640 - Medium.

5. ELISPOT-Assay

  1. Zugabe von 30 & mgr; l 35% Ethanol in destilliertem Wasser zu jeder Vertiefung der ELISpot-Platten für 30 s.
    HINWEIS: Beim Pipettieren vermeiden jederzeit in den Vertiefungen der Membran zu berühren.
  2. Invert ELISPOT Platten um das Ethanol zu entfernen.
  3. Setzen Sie 150 ul autoklaviert ddH 2 O in jede Vertiefung und inkubierensie bei RT für 5 min zu spülen Sie das restliche Ethanol aus; 3 min mit einer Wasch von sterilem PBS bei RT folgen.
    HINWEIS: Die Schritte 5.1 bis 5.3 optional sein können, abhängig von der Herstellung der Platten.
  4. Stellen 50 ul von 5 ug / ml polyklonalen F (ab ') 2 - Fragment von anti-human - Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in jede Vertiefung der ELISpot Platten und Inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder 37 & deg ; C für 2 h 11.
    HINWEIS: Seal die Ränder der Platten mit Parafilm bis zur Verwendung.
  5. Kehren Sie die Platten nicht gebundenen Abs zu entfernen, 200 & mgr; l PBS in jede Vertiefung und inkubieren sie zweimal bei RT für 3 Minuten jedes Mal.
  6. Mit 200 ul PBS mit 5% BSA (oder RPMI 1640-Medium) zu jeder Vertiefung für die Blockierung und inkubieren bei RT für 2 h.
  7. Kehren Sie die Platten, die die Blockierungspuffer zu entfernen. Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5.
  8. Füge 100 & mgr; l RPMI 1640-Medium in jede Vertiefung und Inkubieren sie bei 37 ° C.
  9. Wenn Sie bereit sind, die Zellen auf Seed-, invertieren die Platten das RPMI 1640-Medium zu entfernen.
  10. Seed 100 ul (5 · 10 & sup4 ; ), 50 & mgr; l (2,5 x 10 & sup4 ; ) und 25 ul (1,25 x 10 4) der Zellen (von den Schritten 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 und 4,6) in die Vertiefungen einer ELISpot Platte. Mit RPMI 1640-Medium, bringen das Volumen auf 150 & mgr; l / Vertiefung.
    HINWEIS: Ein Minimum von einer oder zwei 2-fache serielle Verdünnungen für die Zellen Plattieren wird empfohlen.
  11. Inkubiere die Platten in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 8-14 h 18. Vermeiden Sie die Platten während der Inkubation zu bewegen.
  12. Kehren Sie die Platten, die die Zellen und RPMI-1640-Medium zu entfernen.
  13. Mit 200 & mgr; l / Vertiefung PBS-T (PBS mit 0,05% Tween 20) und inkubieren sie 5 mal bei RT, jeweils für 3 min. Die Platte umdrehen den Waschpuffer zwischen jedem der 5 Wäschen zu entfernen.
  14. Fügen entweder Ziege-anti-human-IgG-alkalische Phosphatase (AP), Fcy-spezifischen Abs (für IgG-Nachweis, 1: 5.000 in PBS-T) Oder Ziege-anti-human IgM-AP, Fcμ fragmentspezifische Abs (für IgM-Erkennung, 1: 5.000 in PBS-T) in die vorgesehenen Vertiefungen und für 2 h im Dunkeln bei RT inkubieren.
  15. Waschen jede Vertiefung zweimal mit 200 ul PBS, wie in Schritt 5.5.
  16. In 50 ul / Vertiefung Bromchlorindolylphosphat-Nitro-Blau-Tetrazolium (BCIP / NBT) Substratlösung. Lilafarbener Flecken erscheinen normalerweise in 5 bis 15 min.
  17. Füge 100 & mgr; l / Vertiefung von ddH 2 O , um die übermäßige Entwicklung von Flecken zu verhindern.
  18. Spülen Sie die Platten mit fließendem Leitungswasser nach der vollständigen Entwicklung aller Flecken.
  19. Entfernen Sie die unterirdische Entwässerungs der Platten und lassen sie in der Dunkelheit an der Luft trocknen.
  20. Zählen Sie die Flecken mit einem automatischen Plattenlesegerät mit einer Bildaufnahme / Analyseeinheit (zB ein automatischer Scanner oder manuell über ein Binokular).
    HINWEIS: Die Platten können später bei RT im Dunkeln und analysiert gespeichert werden.

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Representative Results

PBMCs wurden von roten Blutkörperchen und anhaftenden Zellen verarmt (Schritte 1,2 bis 1,7). Ein Aliquot (2 x 10 6) Zellen wurden zu einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen , um die Populationen von naiven B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen und PBS / PCs in dem peripheren Blut (Abbildung 1) veranschaulichen. In diesem PBMCs des Spenders, etwa 10% der Lymphozyten waren CD19 + B - Zellen. In der B-Zellenraum ist der Anteil der CD19 + CD27 - war naiv B - Zellen um 50%. Auf der anderen Seite, etwa 50% der CD19 + B - Zellen waren CD27 + Gedächtnis - B - Zellen , 7, 25-26. Bemerkenswerterweise kann CD27 + Gedächtnis - B - Zellen weiter mit der Aufnahme von IgD 4 getrennt werden. 2, 30-31 - Der Phänotyp PBs zirkulierender besser werden kann , keine oder nur geringe Oberflächenexpression von CD20 (CD19 + CD27 + / hallo CD38 + CD20 lo /) definiert. Um auszuschließen, die toten Zellen, die 7-AADkann in Zellfärbung (Schritt 3.5) und einem Grundstück für FSC gegen 7-AAD aufgenommen werden können , die Bevölkerung von lebenden Zellen zur Torsteuerung (7-AAD -).

Die wichtigsten Schritte des ELISPOT - Assay sind in Abbildung 2 dargestellt. Beide gereinigten humanen B - Zellen und CD19 + CD27 + Gedächtnis - B - Zellen wurden in Gegenwart von CpG mit RPMI 1640 - Medium für 5 Tage. Die Zellen wurden die neu entstandenen ASCS zur Quantifizierung des ELISPOT-Assay geerntet. Falls vorhanden, isoliert die bereits bestehenden PBs aus dem peripheren Blut wird 11 in 48 h aussterben. Der ELISPOT - Assay wurde durchgeführt, und die Punktbilder durch einen automatischen Plattenscanner erfasst werden in Abbildung 3 gezeigt. Die Ergebnisse der ELISpot zeigen typischerweise 50-200 IgM-ASCS 10 4 B mit CpG behandelten Zellen für 5 Tage, während die Zahl der IgG-ASC 10 - 50 in 10 4 Zellen 11.


Abbildung 1. Abbildung der Gating - Strategie Trennen Sie die Naïve B - Zellen, Gedächtnis - B - Zellen und PBs in der PBMCs. (A) Die Zellen (2 × 10 6) wurden mit 2 & mgr; g jedes der CD19-APC, CD27-eFluor450 gefärbt und CD38-PE mAbs (Schritt 3.4). Das Fach-Lymphozyten wurde gated (G1) auf dem Punktdiagramm für Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC). (B) Cell Dubletten, die von zwei Zellen zusammengeklebt gebildet werden, ausgeschlossen wurden (die außerhalb G2) auf dem Grundstück für FSC-W (Breite) im Vergleich zu FSC-H (Höhe). (C) CD19 + B - Zellen wurden als G3 auf dem Grundstück für SSC-A (Bereich) und CD19-APC gated. (D) der CD19 + Zellen, die Punktdiagramm von CD27 und CD38 Parameter zeigten naive B - Zellen (CD19 + CD27 -; Q1 und Q4), Gedächtnis - B - Zellen (CD19 + CD27 +;Q2 und Q3) und PBS (CD19 + CD27 + / hallo CD38 +, G4, 0,6% des Q2). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
2. Abbildungen der wichtigsten Schritte des ELISPOT - Assay Abbildung. (A) Legen 50 & mgr; l / Vertiefung (5 & mgr; g / ml) von F (ab ') 2 - Fragment von anti-human - Ig (IgG + IgM + IgA) in einem ELISPOT - Platte für 2 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 & deg ; C (bevorzugt) (Schritt 5.4). Seed die Zellen in die Vertiefungen der ELISpot Platte. Lassen Sie die ASCS auf die (PVDF) - Membran zu befestigen und zu sezernieren Abs 8 - 14 Uhr (Schritt 5.11). (B) , um die Zellen mit PBS abwaschen (mit 0,05% Tween 20). (C) Fügen Sie die AP- oder HRP-Konjugated Erkennung Abs entweder IgG oder IgM-spezifisch. (D) Waschen Sie die Erkennung Abs , die ungebunden sind. (E) Entwickeln Sie die Flecken mit einer Substratlösung von AP oder HRP den Nachweis Abs übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. ELISpot Ergebnisse einer repräsentativen Platte. (A) gereinigtes CD19 + B - Zellen wurden in drei benachbarten Vertiefungen gegeben (50.000 Zellen in gut # 1, 25.000 Zellen in gut # 2 und 12.500 Zellen in gut # 3, bzw.) der ELISpot Platte. Zellen wurden dann in RPMI-1640-Medium über Nacht (~ 14 h). Der ELISPOT-Assay wurde nach Beendigung der Kultur durchgeführt (Schritte 5,12-5,18). Um Analyze die Ergebnisse wurde die ELISpot Platte Bilder über einen automatischen Analysator mit dem Scanner und Software ausgestattet erwerben gescannt. (B) Gereinigtes CD19 + CD27 + Speicherzellen (10 6 / ml) wurden in Gegenwart von 5 & mgr; g / ml CpG für 5 Tage. Die Zellen wurden wie in (A) für den ELISPOT - Assay behandelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Isolierung und Reinigung von humanen peripheren Blut-B-Zellen

Normalerweise können RBCs effizient durch Lysepuffer (Schritt 1.2) gebrochen und gelöscht werden. Es ist wichtig, nicht die PBMCs mit dem RBC-Lyse-Puffer länger als 5 min inkubieren, da die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch das Ammoniumchlorid beeinflußt werden. Alternativ kann RBCs und Blutplättchen gleichzeitig durch das folgende Protokoll entfernt werden.

Mischen frisches Vollblut mit Säure-Citrat-Dextrose (ACD) -Puffer (39 mM Citronensäure, 75 mM Natriumcitrat und 135 mM Dextrose, pH 7,4) in einem Volumenverhältnis von 9: 1, Blut-zu-Puffer. Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei RT. Achten Sie auf die Bildung von Schichten, indikativ für Trennung. Absaugen und entsorgen Sie die obere Schicht, die Blutplättchen und plättchenreiches Plasma (gelbe Farbe) enthält. Entfernen Sie die dünne Mittelschicht an der Grenzfläche, die PBMCs enthält (d .h., Die Buffy - Coat). Vermeiden Sie die Kontamination von roten Blutkörperchen in der unteren Schicht (dark rote Farbe). In Lysepuffers zum PBMCs die restlichen roten Blutkörperchen zu entfernen, und dann die Schritte 1,2-1,19 folgen.

Zwei Ansätze können verwendet werden , um B - Zellen aus PBMCs isolieren: positive und negative Selektion 21. Das Verfahren der negativen Selektion (Schritte 1,1-1,19) verwendet wird, unberührt, funktionellen B-Zellen zu erhalten, ohne gebundenen Abs oder Mikrokügelchen, für nachgeschaltete Experimente. Es ist wichtig, dies zu berücksichtigen, wenn die Aktivierung und / oder Differenzierung von gereinigten B-Zellen in Kultur auftritt. Die Sorge ist, dass durch positive Selektion gereinigten Zellen könnten versehentlich durch die mAb-konjugierten Microbeads (0,2 bis 5 & mgr; m im Durchmesser) beeinflusst werden. mAbs können auf B-Zellen an spezifische Rezeptoren binden und daher könnte Rezeptoren zur Aktivierung vernetzen. Außerdem können Mikrokügelchen durch B-Zellen durch Endozytose gebundenen Rezeptoren werden. Obwohl biologisch abbaubar, können die Mikrokügelchen innerhalb der Zellen länger bleiben als eine Woche. Ob die Beibehaltung der Mikroperlen Erfah beeinflussenmental Ergebnisse muss empirisch ermittelt werden. Bei der Reinigung von humanen B - Zellen durch positive Selektion, anti-CD19 (Klone: 4G7 oder HIB19) Mikrokügelchen werden häufig verwendet , weil CD19 überall in den Entwicklungsstadien der B - Zellen exprimiert wird. (: SJ25C1 oder LT19 Klone), die von anti-CD19-Microbeads verschiedene Epitope erkennen, die Reinheit der B-Zellen nach der Trennung kann Cytometrie mit Anti-CD19 mAbs durch Strömungs bestimmt werden.

Reinigung und Trennung von Speicher- und Naïve B-Zellen aus B-Zellen isoliert

CD27 ist ein weithin akzeptiertes Oberflächenmarker für das menschliche Gedächtnis und naive B - Zell - Differenzierung 24. Das CD27-Molekül gehört zur Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR) -Familie. Naive B - Zellen - da CD27 auf den meisten menschlichen Gedächtnis - B - Zellen exprimiert wird, wird es üblicherweise zu unterscheiden sie von CD27 verwendet. Da jedoch CD27 ist auch auf T-Zellen und NK-Zellen exprimiert, die Verwendung von anti-CD27 microbeads (Klon: O323) in Speicher B-Zellen positiv Auswahl erfordert eine vorherige Reinigung von B-Zellen (Schritte 1,1-1,19). Für eine Reinheitskontrolle nach der Trennung spezifische mAb für die menschliche CD27 (Klone: ​​L128 oder LG.3A10) empfohlen (Schritt 2.12). Weil CD27 + Gedächtnis - B - Zellen heterogen, zusätzliche Oberflächenmarker, wie beispielsweise IgD und FCRL4 sind, können zur weiteren Trennung in Zellsortierungs 4, 7 betrachtet werden.

Zellsortierung zu Naïve B Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und PBs / PCs erhalten

Da B-Zellen FcγRIIB exprimieren, ein Fc-Block (Schritt 3.3) vor empfohlen Zytometrie die Zellen mit mAb für Fluss zum Färben. Die Fc - Fragmente des menschlichen allein IgG kann bei 1 & mgr; g / 10 6 Zellen als die ganze menschliche IgG gleich gut blockieren. Anti-Human-CD32 mAb (Klone: ​​3D3 oder AT10) ist eine weitere Option für den Block Fc. Zu beachten ist, wenn FcγRIIB einen Oberflächenmarker in gereinigter B-Zellen gefärbt werden, die Fluorophore-konjugierte anti-CD32 mAb shOuld werden hinzugefügt, um die Fc-Block, gefolgt zu verzichten, indem sie mit anderen mAbs ohne PBS waschen Färbung.

Für Drei-Farben-Durchflusszytometrie, CD38-FITC (Fluorescein), CD27-PE (Phycoerythrin) und CD19-APC (Allophycocyanin) eine typische Kombination von Fluorophoren sind. Trotzdem wird, wenn der durchflusszytometrischen Sortierer mit drei Lasern ausgestattet ist, wie die von 405 nm, 488 nm und 640 nm, die Forscher haben dann die Luxus Fluorophore durch verschiedene Laser für die Zellsortierung angeregt zu wählen. , CD27-eFluor450 (entspricht Pacific Blue, Klon: O323) und CD38-PE (Klon: HB7): Wie in Abbildung 1 dargestellt ist , wurden die Zellen mit CD19-APC (HIB19 Klon) gefärbt , um die naive B - Zellen zu trennen, Speicher B-Zellen und PBs. Zu beachten ist , bevorzugen manche Forscher die Aufnahme von CD45 (Klon: HI30) als Leukozyten Linienmarker und Gate - B - Zellen als CD45 + CD19 + Population. Da der Nachweis von PBs im Umlauf in einem stabilen Zustand ist eine seltene Vorabendnt bei gesunden Menschen, geringe oder gar keine Oberflächenexpression von CD20 auf PBs (CD19 + CD27 + / hallo CD38 + CD20 lo / -) begründet ihre bona fide Existenz 2, 30-31. Dies ist nützlich, wenn die Quantifizierung Ergebnisse von PBs durch Oberflächen Phänotypen und ASCS durch ELISPOT-Tests verglichen werden. In der Zeit vor der Zellsortierung, wird 7-AAD zu Propidiumiodid bevorzugt für den Ausschluss von toten Zellen aufgrund seiner engeren Emissionsspektrum und unteren Spill-over in Multicolor Durchflusszytometrie.

In - vitro - Stimulation und Differenzierung von isolierten humanen B - Zellen

Der Typ B CpG (ODN 2006) allein kann sowohl begrenzte Differenzierung von IgM- und IgG-ASC aus dem Gedächtnis B-Zellen induzieren. Außerdem sind naive B - Zellen nur schwach in Reaktion auf CpG und vor allem Anlass zu geben IgM-ASCS 6, 11. Die Konzentration an CpG in Kultur liegt im Bereich von 2,5 bis 5 & mgr; g / ml pro 10 6 B - Zellenoder 11 PBMCs, 18. Andere als CpG, gereinigtes B-Zellen und PBMCs kann in Gegenwart von Kombinationen von CpG mit Mitogenen, Zytokine und BCR-Agonisten gezüchtet werden, humanen B-Zellen in Kultur in ASCs (Schritt 4.3) zu differenzieren. Zum Beispiel häufig Rezepte verwendet für 10 6 Zellen pro ml enthalten (a) CpG (5 ug / ml), rekombinantes menschliches IL-2 (10 ng / ml) und rekombinantem Human - IL-10 (10 ng / ml) 15, 34; (b) CpG (5 ug / ml) und F (ab ') 2 -Fragmente von anti-human - Ig (IgG + IgM + IgA) (20 ug / ml) 11; (c) CpG (5 ug / ml), Protein A von S. aureus Cowan (SAC) (1: 10.000 Verdünnung) und Pokeweed - Mitogen (PWM) (1: 100.000 - Verdünnung) 18; (d) rekombinantes humanes IL-21 (100 ng / ml) und rekombinantem sCD40L (1 ug / ml) 12, 15, 33; und (e) rekombinantes humanes IL-2 (10 ng / ml) und R848 (1 ug / ml), ein TLR7 - Agonist 33-34. Obwohl B - Zellen in ASCs in drei Tagen 11 unterschieden werden können, sind Zellen im allgemeinen vorge stimulated für 5 bis 6 Tage vor werden 11, 18 für die Quantifizierung von ASCs zur ELISpot Platte gegeben. Während der Kulturzeit ist es in der Regel keine Nachfüllung der Ausgangsdifferenzierungsmittel.

Die Zugabe von IL-2 und IL-10 zu CpG-enthaltenden Kulturen können signifikant die Anzahl von differenzierten IgM- und IgG-ASCs 15, 35 erhöhen. Die Gegenwart von IL-2 in Kultur kann mitogene Stimulation der Expansion von differenzierten B-Zellen durch CpG zu erleichtern. IL-10 im Bereich von 10-25 ng / ml die Produktion von ASCs stark erhöhen kann (~ 3- bis 10-fach) in Gegenwart von CpG 35. BCR - Agonisten, einschließlich anti-BCR und SAC und PWM 18 können auch die Proliferation von primären humanen B - Zellen stimulieren. Inkubieren Speicher B - Zellen mit CpG und polyklonalen anti-BCR hauptsächlich zu einer Erhöhung in IgM-ASCs aber nicht in IgG-ASCs 28. Zur Verhinderung der Hemmung der Signalgebung durch BCR von FcγRIIB, einem F (ab &# 39;) & sub2 ; -Fragment von Anti-Ig (10 - 20 & mgr; g / ml pro 10 6 Zellen) wird empfohlen, wenn 11 Vernetzungs BCR. Anstelle von polyklonalen Anti-Ig, Anti-BCR - mAb spezifisch für entweder IgM + oder IgG + B - Zellen sollten isotypspezifischen B-Zell - Subpopulationen zur Differenzierung in ASCS Ziel angesehen werden. Eine Kombination von CpG, SAC (1: 10.000 Verdünnung) und PWM (1: 100.000 Verdünnung) können Speicher - B - Zellen effizient aktivieren in IgM- und IgG-ASC 18, 24 zu unterscheiden. Darüber hinaus können CpG mäßig Klassenwechsel von Ig in vitro 28-29 induzieren. Im Gegensatz dazu IL-21 (100 ng / ml) und sCD40L (1 ug / mL) effektiv Speicher B - Zell - Differenzierung ausschließlich geschaltet IgG-ASCs 12, 30 induzieren. Die sCD40L können B - Zellen durch die Nachahmung von T-Zell - Hilfe durch CD40 auf B - Zellen, beeinflussen deren Differenzierung in PCs in vivo zu aktivieren. Zu beachten ist , anti-CD40 (Klone: 89 oder G28.5) für sCD40L in Kultur 15 ersetzen. However weder sCD40L noch anti-CD40 allein ist in der Lage, die Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen zu induzieren. Somit wird der CD40-Aktivierung von kultivierten B-Zellen oft mit einem Differenzierungsmittel kombiniert werden, wie beispielsweise IL-4, CpG, R848 oder IL-21, von denen jeder Ig-Klassenwechsel fördern können. IL-4 spielt eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von CD4 Th2 - Zellen, die Induktion der meisten IgM + -B - Zellen erlaubt zu IgG1 + B - Zellen in Kultur zu wechseln. Auf ähnliche Weise in Gegenwart von IL-21, unterscheiden beide Speicher B - Zellen und naiven B - Zellen ausschließlich in die Klasse vermitteltes ASCs 12, 32. Wie CpG kann R848 34 eine marginale Klasse Schalter von B - Zellen zu induzieren. Schließlich ist es erwähnenswert , dass , obwohl Lipopolysaccharide (LPS) effektiv Differenzierung von Maus - B - Zellen in ASCS induzieren können, zum Ausdruck humanen B - Zellen geringe Mengen von TLR4 und CD14 29. Da die Zugabe einer Differenzierungsmittel in Kultur die Entstehung von geschalteten B-Zellen fördert, sollte dies vermieden werden zusätzlichwenn bereits bestehenden PBS / PCs oder nicht geschaltete B-Zellen-Speicher zu messen sind.

ELISPOT-Assay

Der ELISPOT - Assay kombiniert plattenbasierte ELISAs mit membranbasierten Western - Blotting - Technologien, so dass für den Nachweis von Abs sezerniert von einer einzigen B - Zelle 18. Die ELISpot wurde auch Ag-spezifischen T - Zellen angepasst zu quantifizieren , die Zytokine 17, 36 sezernieren. In einem ELISPOT-Assay entweder gereinigten Zellen oder unfraktionierten PBMC (frei von RBCs) verwendet werden. Jedoch ~ 10-fach PBMCs erforderlich sind als gereinigter Zellen konsistente Ergebnisse in ELISPOT-Tests zu erhalten. Ein guter Ausgangspunkt ist 1 - 2 mal 10 5 Zellen pro Vertiefung für das zirkulierende ASCS in PBMCs zu erkennen. Bei der Detektion von Ag-spezifischen ASCs wird anti-Ig üblicherweise durch Ag ersetzt (von 5 bis 10 & mgr; g / ml in PBS) Ag-spezifischen ACSs (Schritt 5.4) zu erfassen. Die Verwendung von Isotyp-spezifischen Nachweis Abs erlaubt die Unterscheidung zwischen Ag-spezifischen IgM-ASCs und IgG-Isotyp-ASCs (Schritt 5.14). Bemerkenswert ist, unabhängig davon, ob anti-Ig oder Ag verwendet werden ASCs zu erfassen, kann die Erfassungs Abs verwendet für ELISA nicht immer für ELISpot geeignet sein. In ähnlicher Weise nicht alle Farb Substrate für ELISA richtig funktionieren in ELISpot. AP- und HRP-konjugierte ABS sind die am häufigsten für Spot Detection in ELISpot verwendet. Das BCIP / NBT-Substratlösung ist eine beliebte Wahl für AP-basierte Erkennung, während 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) Lösungen sind übliche Substrate für HRP in ELISpot. Wenn der AP oder HRP direkt mit dem Detektions Abs konjugiert ist, nur ein Schritt zur Detektion benötigt wird, wie im Protokoll (Schritt 5.14) beschrieben. Im Gegensatz dazu sind die Detektions Abs biotinyliert und erfordern anschließende Inkubation mit AP- oder HRP-konjugiertem Streptavidin, bevor in einem zweistufigen Verfahren mit den Substraten reagieren. Beide Ein-Schritt-und Zwei-Schritt-Verfahren arbeiten effizient Spots in ELISpot zu erkennen.

Der ELISPOT-Assay kann quantitativ nicht nur circulating sondern auch ASCS in Kultur unterschieden (Schritt 1,19 gegenüber 4,6). Falls vorhanden, zirkulierende ASCS, die in der Regel nicht mehr leben als zwei Tage in der Kultur, in der ELISpot Platte direkt kultiviert werden, mit oder ohne Reinigung von PBMCs 11. Im Gegensatz dazu erfordert die Differenzierung der B-Zellen-Speicher 5 Tage. Daher ist eine direkte Kultivierung in ELISpot Platten nach Zellisolierung (Schritt 1.19) nicht zu empfehlen; die toten Zelltrümmer aus dem erweiterten Kulturperiode, kann sie den Hintergrund in Spot Detection erhöhen. Stattdessen sowohl gereinigte B-Zellen und Gesamt PBMCs kann zuerst in einer 6-Well oder 12-Well-Platte in Gegenwart von Mitogenen und Differenzierungsmitteln (Schritt 4.3) kultiviert werden. Während des Kultivierungsprozesses ist die wiederholte Zugabe von Stimulationsmittel unnötig ist (Schritt 4.3). Während die Platten in den Inkubator sind, sollte die Tür des Inkubators sanft bewegt, um zu verhindern seeded ASCs geöffnet und geschlossen werden, um sie sekretierte Abs entlang der Bewegungsbahnen diffundieren kann, Erzeugen spotsmit Schwanz (die so genannten "kometenhafte" Spots) (Schritt 5.11). Die Inkubationszeit in ELISpot Platten wird durch die für die Zellen nachweisbare Mengen von Abs absondern benötigte Zeit bestimmt, ohne dass die Zellen zu unterteilen, die Schwierigkeiten bei der Punktzählung schaffen würde. Somit sind Zellen, in der Regel kultiviert im Bereich von 8 h bis über Nacht (Schritt 5.11).

Der ELISPOT-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Quantifizierung von Zellantworten Speicher B. Es ist ein beliebtes, unabhängige Auslesen der humoralen Immunantwort und immunologische Gedächtnis werden. In der Praxis wird der vorhergehende mitogene Kultur benötigten Speicher B-Zellen zur Differenzierung in ASCs zu aktivieren (Schritt 4.3). Jedoch variiert die Frequenz, bei der Speicherzellen B expandieren und differenzieren sich in ASCs in verschiedenen Kulturmilieu, wie oben beschrieben. Obwohl ohne Konsens, nehmen die meisten Forscher die Induktion Bedingung, die die Produktion von ASCS maximieren. In Bezug auf die Mittel verwendet für Punkt detection, einem löslichen biotinylierten Ag kann die unbefriedigende Nachweis Ab ersetzen , ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen 37. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn die Verfügbarkeit von Ag begrenzt ist, weil eine viel geringere Menge an Ag für die Detektion erforderlich ist, als für die Platten zu beschichten. Schließlich hat ELISpot nicht phänotypische Analyse zellulärer Heterogenität ermöglichen und erfordert dadurch vor der Fraktionierung von Zell-Subpopulationen. Vor kurzem sind ein Mehrfarben ELISPOT - Assay, in dem die Erfassung Abs mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert wurde mehrere Arten von Cytokin-sezernierenden Zellen in einer einzelnen Vertiefung 38-39 zu erkennen entwickelt. Diese neue Technologie wird für die Detektion von niederfrequenten Zellen in PBMCs und für eine großflächige Analyse Impfstoff-induzierten B-Zell-Reaktionen von besonderem Interesse sein.

Weil der ELISPOT-Assay ist schnell und effizient in ASCs und Cytokin-sezernierenden Zellen zu quantifizieren, wurde erweitert, um die Funktionalität nicht nur circu zu messenLating Lymphozyten, aber 40 auch Immunzellen Gewebe wie intrahepatischen Leukozyten. Wegen seiner Empfindlichkeit das Niveau der Erkennung auch nur einen einzigen ASC erreicht, wurde die ELISPOT-Tests zunehmend zu messen menschlichen Immunreaktionen auf Impfstoff Wirksamkeiten gegen bestehende und neu auftretender Krankheitserreger eingesetzt. Obwohl die Hochdurchsatzleistung und Robustheit der ELISPOT-Tests sind hervorragend für die großtechnische Bewertung der Immunreaktionen unter Verwendung von PBMCs, können die Ergebnisse der Tests von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise die Verarbeitungsverzögerung der Proben beeinflusst werden, ob die Zellen frisch oder gefroren sind , Serumkomponenten in dem Kulturmedium, und die Anzahl der an die ELISpot Platte 41 hinzugefügt Zellen. Somit sollte die Normalisierung Verfahren im ELISpot Protokoll aufgenommen werden , zu minimieren Intra- und Inter-Assay - Variationen in großem Maßstab und Längs Follow-up - Studien (zB Impfstoff - Studien). Das Normierungsverfahren der Platte lesen, ist auch entscheidend für die Linearität, Genauigkeit und Nachteileistency in der Assay - Ergebnisse 41-42. Eine Möglichkeit Platte lesen Normalisierung auszuführen ist, das Verfahren der seriellen Verdünnung von Zellen zu ELISpot Platten (Schritt 5.10) ausgesät zu verlängern. Durch die Schaffung einer Referenzplatte, mehrere serielle Verdünnungen sollten pro Vertiefung eine lineare Beziehung zwischen den Zellzahlen plattiert pro Vertiefung und den Spot zählt zu demonstrieren. Wiederholte Scans der ELISpot Platte kann die Vorlage von Punktzählung zur Validierung verwendet werden, sowohl automatisch als auch manuell. Minimale intra gut Variabilität in Punktzahlen wird nach diesen Normalisierungsverfahren 43 erwartet. Schließlich kann die Anwendung von ELISpot in vielerlei Hinsicht erweitert werden, beispielsweise für die Überwachung der Behandlungs Reaktionen von Patienten mit Infektionen und unter Krebs Immuntherapien sowie zur Bewertung der Immuntoxizität (zB Immunsuppression und Arzneimittel-induzierte Autoimmunität).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

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