유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

Immunology and Infection

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Summary

이 원고는 표현형 및 유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 거주하는 대 식세포의 정량 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 얻어진 염색 된 세포는 이에 실험 모델에서 얻어진 정보를 증가, 세포 선별, 유전자 발현 분석 또는 기능적 연구를 포함하는 다른 응용에 사용될 수있다.

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Rubio-Navarro, A., Guerrero-Hue, M., Martín-Fernandez, B., Cortegano, I., Olivares-Alvaro, E., de las Heras, N., Alía, M., de Andrés, B., Gaspar, M. L., Egido, J., Moreno, J. A. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54599, doi:10.3791/54599 (2016).

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Abstract

Protocol

이 프로토콜은 지침 유럽 의회의 63분의 2,010 / EU 및 국가 가이드 라인 2천13분의 53 다음 지역 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

시약 및 솔루션 1. 준비

  1. 무균 조건 하에서 모든 시약 및 솔루션을 준비하고 층류 후드 사용합니다. 4 ° C에서 솔루션을 유지합니다.
  2. 염색 버퍼를 준비 (2 % 태아 소 혈청 1 배 둘 베코의 PBS에서 (FBS)).
  3. 식염수의 각 ml의 콜라게나 제 0.5 mg을 추가하여 콜라겐 솔루션을 준비합니다.
  4. 케타민 / 자일 라진의 마취 솔루션을 준비합니다 (2 : 1 v / v)로.

2. 신장 관류 및 추출

  1. 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사 (75 밀리그램 / 12 ㎎ / ㎏ 체중)로 쥐를 마취. 조심스럽게 동물이 충분히 마취되어 있는지 확인하기 위해, 피부의 작은 배를 꼬집어. 그런 다음, 마취 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고와 눈을 다룹니다. 참고 : 4 월을일짜리 위 스타 쥐이 분석에 사용됩니다.
  2. 쥐가 완전히 마취되면, 앙와위에서 수술 테이블에 놓습니다.
  3. 복부에 70 % 에탄올을 적용합니다.
  4. 흉막과 복강을 노출, 흉곽의 치골에서, 복부 피부와 복막을 통해 중앙 절개를합니다.
  5. 모든 혈액 신장에서 제거 될 때까지 관류 시스템을 사용하여 신장을 관류하는 복부 대동맥에 생리 식염수 (0.9 %)을 주입한다. 피를 해제하기 위해 복부 수준에서 대동맥을 잘라.
  6. 신장 폐문 (신장 정맥, 동맥과 요관)에서 절단하여 쥐에서 모두 신장을 제거합니다. 신장을 디 캡슐주의 깊게 캡슐 (11)을 분리, 손가락을 사용하여 신장의 가장자리를 누른다.
  7. 행크스 '균형 소금 용액에 신장을 놓습니다.

3. 신장의 소화와 세포 현탁액

  1. 작은 조각으로 가위 신장의 절반을 잘라 넣어1.5 ML 튜브에 조각.
    참고 : 모든 다음의 농도는 1 샘플 (1/2 쥐의 신장)에 대해 계산된다.
  2. 콜라게나 제 용액 1 ㎖를 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 콜라게나 제 용액을 전체 조직에 접근하는지 확인 반전하여 매 5 분 혼합한다.
  3. 솔루션을 수집하고 플런저의 도움으로 스트레이너 (40 μm의)를 통해 통과하고, 염색 버퍼 10ml에 그것을 재현 탁.
  4. 15 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  5. 1 ml의 ACK (암모늄 - 염화 - 칼륨) 용균 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 1 분, 실온에서 30 초 후, 반응을 중지 염색 완충액 10 ㎖를 추가한다.
  6. 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  7. 다시 중단 완충액 (1 ml)로 염색 적절한 부피 펠릿 및 스트레이너 (30 μm의)을 사용하여 세포 현탁액을 필터.
  8. 혈구에 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포의 수를 세어 STA하는 1.5 ㎖의 튜브에 2 백만 세포를 추가ining.

4. 세포 염색 및 유동 세포 계측법 분석

  1. 5 분 100 XG에 원심 분리기 세포.
  2. Fc 수용체를 차단하기 위해 39 ° C에서 10 분 동안 : 다시 일시 래트 혈청 100 ㎕에서 펠렛 (1 : 100 희석).
  3. 5 분 동안 염색 버퍼와 원심 분리기 (100) XG 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다.
  4. 살아있는 세포 (1,000 3) 감지 및 솔루션 CD45 APC-Cy7 (1 : 100), CD163 A647 (100 4) 각 조건에 대한 염색 버퍼 100 ㎕의 세포 표면 얼룩에 대한 항체를 섞는다.
  5. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체 믹스 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
  6. 5 분 동안 100 XG에 염색 버퍼 원심 1 ㎖을 첨가하여 세척 하였다. 이 단계를 반복합니다.
  7. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 고정 / Permeabilization 솔루션의 600 μl를 추가합니다.
  8. 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리하는 과정을 2 회 반복한다.
  9. intracel의 경우 : CD68 FITC 항체 (1000 35)를 추가각 조건에 대한 Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕에적인 다공질 염색.
  10. CD68 항체 용액에 펠렛을 다시 중단하고 어둠 속에서 4 ° C에서 50 분을 품어.
  11. 5 분 동안 170 XG에 1 ml의 Permeabilization / 워시 버퍼와 원심 분리기로 씻으십시오.
  12. , Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시하면 일시 중지 CD86PE 항체 (35 : 1000)를 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
  13. 5 분 동안 100 XG에서 버퍼와 원심 분리기 Permeabilization / 워시 1 ㎖를 추가하여 씻으십시오.
  14. Permeabilization / 워시 버퍼 100 ㎕의 펠렛을 다시 중단하고 관 세포 계측법 흐름에 전달합니다.
  15. 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 측면 산란 빛 / 앞으로 산란 빛 (SSC / FSC) 창에 문이 살아있는 세포에서 CD45 염색을 결정합니다. 제 2 단계에서, CD68 + 세포에서 CD86 및 CD163의 발현을 분석한다.

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Representative Results

우리는 신장에서 대 식세포 침투의 증가 존재와 관련된 신 손상의 염증 실험 모델에서 대 식세포의 이질성을 분석 하였다. 이전 12보고 된이 모델에서 신장 손상, 위 스타 쥐 3 주 동안 물을 마시는 알도스테론 (1 mg의 -1 kg -1 일)을 더한 소금 (염화나트륨 1 %)의 투여에 의해 유도했다.

우리 실험 스케줄이도 1에 도시되어있다. 우선, 신장 세포를 분리 하였다 기계적 방법 및 콜라겐 (도 1a)와 상기 소화 효소를 사용. 그 후, 적혈구가 용해시켰다 신장 식세포는 유동 세포 계측법을 사용하여 검출 하였다. 세포 막 탐지 및 CD68 세포 염색 (그림 1B)에 대한 CD45, CD86 및 CD163에 대한 항체로 배양 하였다. 대 식세포 (p)의 마지막으로, 표현형opulations 그림 1C에서 보여 방식에 따라 분석 하였다.

신장 식세포 콘텐츠는 CD45 및 CD68 (도 2a)와 이중 양성 세포를 선택하여 분석 하였다. (상술 한 프로토콜 대조군 (총 신장 세포 당 + 식세포 0.57 ± 0.16 대 0.25 ± 0.02 %의 CD45 + / CD68)에 비해 알도스테론 - 처리 된 래트에서 관찰 된 CD45 + / CD68 + 마크로파지의 증가 사용 그림 2) 테이블 삽입을 참조하십시오. 바이올렛 염료로 염색을 유동 세포 계측법에 의해 결정되는 CD45 + / CD68 + 대 식세포의 세포 생존율은 통상적이었다 95 % 이상 (데이터 미도시) .Thereafter는 CD86 (M1 마커) 및 CD163 (M2 마커) 식은 중에서 평가 하였다 CD45 + / CD68 + 세포. 알도스테론 행정부는 CD45 + / CD68 + / CD86 + M1의 함량을 증가대 식세포 (2.87 ± 2.3 대 1.36 ± 0.68; %의 CD45 + / CD68 + / CD86 + 총 CD45 + / CD68 + 세포 당 대 식세포) (그림 2). 그러나, CD45 + / CD68의 낮은 번호 + / CD163 + M2 식세포 모두 알도스테론 - 처리 군과 대조군에서 관찰되었다. 이전 13 바와 같이 저 CD163의 발현은 실험 프로토콜 동안 단백질 분해 흘림과 관련되었는지 여부를 분석하기 위해, 래트 복막 마크로파지의 분리 콜라게나 제 소화를 포함하여이 과정을 반복했다. 도 2b에 보도 된 바와 같이, CD45 + / CD68 + 복강 대 식세포는 선택된 항체의 유용성을 검증하고 쥐의 신장에서 M1 / M2의 대 식세포의 특성에 대한 우리의 프로토콜의 효과를 확인, CD86와 CD163 모두 긍정적이었다.

이러한 결과를 확인하려면,상기 실험 모델에서 신장 손상과 연관된 염증 반응은 면역 조직 화학 및 실시간 PCR로 조사 하였다. 도 3에보고 된 바와 같이, 제어에 비해 CD68 + 대 식세포는 알도스테론 + 염 처리 된 래트에서 관찰 된 증가. 이어서, 대 식세포 표현형 마커 신장 M1 / ​​M2 대식 분포의 특성을 측정 하였다. 이며 Arg1 또는 IL-10 mRNA 발현 (M2 식세포 마커) 알도스테론 투여 후 변경되지 않은 반면, 증가 인 iNOS의 mRNA 발현 및 IFN-γ (M1 마커), 알도스테론 + 염 처리 후 관찰되었다. 함께, 이러한 결과는 알도스테론 + 소금 정부가 생체 내에서 염증 M1 대식 세포 표현형을 매개 확인합니다.

그림 1
그림 1 : 프로토콜 유동 세포 계측법에 의해 신장 세포의 분리 및 대 식세포 감지합니다. (B)에 의한 신장 세포 분리 (A)와 대 식세포 검출 g> 도식 표현. CD45, CD68, CD86 및 CD163 마커 (C)에 대해 서로 다른 분포에 따라 서로 다른 대식 세포 표현형의 대표적인 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 알도스테론에서 M1과 신장에서 M2 대 식세포 마커, 측면 산란 빛 / 앞으로 산란 빛 (SSC / FSC) 창 (A에서 게이트 살아있는 세포에서 유동 세포 계측법에 의해 CD45 염색의 대표 도트 플롯을 쥐를 치료 왼쪽 ) 제어 및 알도스테론 + 소금 처리 된 동물에서 신장 현탁액에서. 도트 플롯 내부 상자 생균 식별CD45을 표현. 이 상자에 들어있는 세포 (오른쪽, A) CD68 + 세포에서 CD86와 CD163의 발현을 결정하기 위해 분석 하였다. 이전에 사용 된 것과 같은 전략을 적용 CD45, CD68, CD86 및 CD163의 검출을위한 양성 대조군으로 복강 대 식세포에 대한 도트 플롯. 데이터는 SEM (B) ± 평균으로 표시하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 알도스테론 + 소금 투여 후 염증 반응. (A) CD68 염색 및 대표 이미지 (B) 제어 및 알도스테론 + 염 처리 된 래트에서 M1 마커에 대한 RT-PCR (iNOS의 및 INFγ) 및 M2 마커 (이며 Arg1 및 IL-10)에 의해 측정 된 mRNA 수준의 정량적 분석한다. 데이터는 명시 적입니다에드으로 평균 ± SEM. * P <0.05 대 제어 할 수 있습니다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

대 식세포는 신장 질환 등 다양한 염증 질환에 중요한 역할을 이종 세포이다. 각 모집단 식세포는 사구체 신염, 당뇨 성 신장 병증 및 신장 암 14-16에서보고 된 바와 같이, 신장 손상의 발달에 다른 방식으로 기여하기 때문에 신장 질환 식세포 서브 세트의 특성에 대한 관심이 높아지고있다. 급성 신장 손상의 초기 단계에서, M1 식세포의 우세는 관상 괴사 및 염증 촉진이 관찰된다. 그러나, 이후의 단계에서 M2 식세포의 높은 함량은 염증을 해결하고 조직 재 형성에 참여 관찰된다. M1이 우세 할 따라서 증가 및 염증성 신장 손상을 영속 수 있지만 만성 신장 질환에서 M1과 M2의 대 식세포 모두 동시에 공존. 따라서, 신장 질환에서 대 식세포 아형의 병태 생리 학적 역할에 대한 지식을 증가하는 것이 중요하다. 면역 조직 화학적 연구는 강력한 방법으로 17 대 식세포 부분 집합의 비율을 확인할 수 없습니다. 따라서, 양적으로 다른 식세포 표현형을 결정하는 신장 염증 반응에 대한 이들 세포의 역할을 이해하기 위해 새로운 기술을 개발하는 것이 필요하다.

이 논문은 래트에서 유동 세포 계측법에 의해 신장 식세포 서브 세트의 개수 및 표현형을 결정하기위한 프로토콜을 설명한다. 우리의 연구에서, 쥐 알도스테론의 투여에 의한 신장 손상의 염증 모델로 하였다. 유동 세포 계측법에 의해 결정 면역에 의해 확인 된 모델에서는, CD45 + 및 C68 + 대 식세포의 침윤이 증가 관찰했다. 또한, M1 식세포 (CD68 + / CD86 +의) 아니지만 M2 식세포의 보충은 알도스테론 - 처리 마우스에서 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 M1 (은 iNOS 및 IFN-γ)의 mRNA 발현과 M2의 macroph을 결정함으로써 확인 하였다나이 마커 (이며 Arg1 또는 IL-10). 격리 프로토콜 동안 분석보고 낮은 세포 사망률 유동 세포 계측법. 여러 티슈 해리 레벨과 세포 생존 및 표면 마커 검출에 영향을 미칠 수있는 요인들뿐만 아니라 시간과 조직 소화 (효소, 정비공 등)의 종류가있다. 과도한 소화 세포 사망과 대 식세포의 활성을 증가시키고 반대의 효과가 낮은 신장 해리 발생할 수있는 반면, 표면 마커의 발현을 감소시킨다. 우리 프로토콜 래트 복막 마크로파지의 분리 하였다 그러나, CD86 및 CD163의 향상된 존재는 이들 세포에서 관찰되었다.

우리 프로토콜은 알도스테론 - 매개 된 고혈압 쥐 신장 식세포 이질성을 결정하기 위해 최적화되었으며, 따라서 다른 염증성 신장 질환 모델을 추정 할 수있다. 그러나,이 과정은 각 실험 조건에 적합 할 수있다 염증 수정하므로이에 의하여 조직 콜라겐 분해 속도에 영향을 미치는 조직의 무결성.

그것은 총 식세포 내용의 결정을 위해 점에 유의하는 것이 중요하다, 세포는 고정 CD68 항체 (18)와 세포 내 표시를 허용하도록 투과성이되었다. 고정 용 프로토콜은 형광 색소 일차 항체, 특히 피코 에리 트린에 접합에 영향을 미칠 수 포름 알데히드의 사용을 포함했다. 이 문제를 해결하려면, CD86-PE 항체 배양은 고정 / Permeabilization 솔루션 및 추가 CD68-염색을 첨가 한 후 실시 하였다. 한편, 또한 mRNA 발현 분석 등 식세포 분리 후 수행 될 수있는 다른 분석법 방해 할 수있는 포름 알데히드를 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 포름 알데히드 고정 세포의 mRNA를 분리 할 수 ​​상용 키트가 있습니다.

요약하면,이 프로토콜은 quantitati에서 신장 식세포의 표현형 특성에 대한 방법을 기술적이 방식으로 유동 세포 계측법 사용. 전반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 쥐의 신장에서 다른 대식 세포 집단을 차별하는 사용하기 쉽고 재현성, 그리고 유용합니다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood Faster Or equivalent equipment
Centrifuge Hettich Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria) BD Biosciences
Fetal bovine serum BioWest S1820-500
PBS 10x LONZA BE17-515Q
Collagenase Sigma-Aldrich 12/1/9001
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A10492-01
Flow cytometry strainers BD Biosciences 340626
Falcon cell strainers Thermo Fisher Scientific 352340
Flow cytometry tubes Falcon 352052 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes Corning centristar 430791
Water bath Memmert GmbH + Co. KG WNE 7 37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer BD Biosciences 554714
Rompum (Xylazine) Bayer Or equivalent
Ketalar (Ketamine) Pfizer Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution Sigma-Aldrich H8264-500ML
Saline solution Braun 622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 Biolegend 202216 Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC Bio-RAD MCA341F Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE Biolegend 200307 Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 Bio-RAD MCA342R Diluted 4:100
Live/dead stain  Molecular Probes L34955 Diluted 3:1,000

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References

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