망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가

Immunology and Infection

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Summary

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

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Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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Abstract

Introduction

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변.

소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 (8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다.

여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 9-12 흐름 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) 13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 (18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 19 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다.

형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 (20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

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Protocol

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다.

사출 용 재료 1. 준비

  1. 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다.
  2. 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용액을 준비합니다.
    참고 : 식균 작용 분석을위한 검증 된 곰팡이 원산지 AF488 표지 입자는이 프로토콜 21-23에 사용됩니다. 최적의 흡수를 들어, 신선하고 즉시 주입하기 전에 입자를 준비합니다.
    주 2 : 입자 농도는 각각의 특정 실험을 위해 최적화 될 수있다.

구슬 솔루션 2. 유리체 강내 주입

참고 : 두 페이지eople 방식으로, 주입을 수행하기 위해 요구되도록 다른 사람이로드 된 주사기를 통과하고, 상기 플런저를 가압하는 동안, 마우스를 길게 안구의 초점을 유지할 수있는 주입을 수행하는 사람.

  1. 20 μL / 체중 10 g의 투여 량으로 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖의 자일 라진 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 주입 전에 마취의 수준을 평가하기 위해 발가락 핀치를 사용합니다.
    참고 : 아이소 플루 란은 골수 세포 기능에 큰 효과가있다, 따라서,이 분석을 통해 그것의 사용은 24, 25을 피해야한다.
  2. 0.5 μL의 형광 표지 된 입자 용액과로드 바늘.
  3. 옆으로 수술 현미경 (그림 1A-B)에서 마우스를 놓습니다. 마우스의 더 나은 위치에 대한 부드러운 소재, 예를 들면, 젤 팩을 사용합니다. 눈이 아직 열려 있지있는 젊은 쥐를 들어, 부드럽게 fissu을 만들어 좋은 45 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀을 엽니 다이로부터 눈꺼풀 것이다 결국 오픈 슬릿을 따라 다시.
    1. 안구가 소켓에서 약간 튀어 있도록 각도 (45) 미세 집게의 도움으로 조심스럽게, 눈꺼풀 주위에 압력을 적용합니다. 그냥 귀 위의 두 손가락과 턱으로 머리를 잡고 조심스럽게 소켓에서 약간 눈을 유지하기 위해 눈꺼풀에 병렬로 피부를 스트레칭. 목 (그림 1B)에 너무 가까이 파악하지 않도록주의하십시오.
  4. (각막과 공막을 연결하는 지점) 각막 윤부에서 주사기의 바늘을 삽입, 안구 천공합니다. 이 색소 마우스의 회색 원으로 표시됩니다. 유리 체액의 작은 볼륨을 추방하고 주입하기 위해 약간의 바늘을 철회. 부드럽게 한 손으로 다른과 바늘로 마우스를 보유해야 주입을 수행하는 사람; 두 번째 사람은 천천히 플런저를 밀어해야합니다.
  5. 천천히 주사기를 철회. 적용을 눈 보습은 수화 눈을 유지하기 위해 삭제합니다. </ 리>
  6. 설치류는 열 패드를 통해 새장에 복구하고 동물을 계속 모니터링 할 수 있습니다. 새끼와 함께 작업을하면, 호흡과 자발적 운동 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 동물을 반환하지 않습니다. 성인과 함께 작업하는 경우가 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지, 다른 경고 동물 케이지에 쥐를 반환하지 않습니다.

망막 조직의 3 수확

주 : 형광 표지 된 입자 주입하지 눈의 망막 조직을 유세포 분석 대조군으로 수집되어야한다. 분석은 단일 망막을 사용하여 수행 될 수 있지만, 최적의 성능을 위해 두 개의 망막 함께 풀링한다.

  1. 형광 표지 된 입자의 유리체 강내 주입 후 망막 조직 3 시간을 수집합니다.
    참고 : 입자 용액의 주입 후 시간이 각각의 특정 실험에 최적화 될 수 있지만, 우리는 3 시간 주사 후, 입자의 흡수는 O 대부분의 계층에서 볼 수 있다는 것을 발견망막 (그림 1C-D) 바.
  2. 경추 탈구로 쥐를 희생.
  3. 부드럽게 안구를 proptose하기 좋은 45 각도 집게의 도움으로 눈꺼풀에 눌러 안구를 수집합니다. 안구 및 풀 뒤 집게를 놓습니다.
  4. 해부 현미경으로 망막을 해부하다. 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 소량을 함유하는 페트리 접시에 안구 전송. 페트리 접시의 건조 지역에서 극상 집게의 끝 각막 윤부에서 안구를 관통.
  5. 각막 윤부 둘레의 약 절반이 절단 될 때까지, 좋은 45 각도 집게의 도움으로 안구를 잡고 각막 윤부 주위에 잘라 봄 가위를 사용합니다.
  6. 벌금 45 각도 집게로 안구를 잡고 PBS로 안구를 가져온다. 좋은 45 각도 집게의 두 번째 쌍으로 떨어져 각막과 공막 눈물. 렌즈와 망막이 나올 나는 것의 ntact.
  7. 렌즈와 망막을 분리합니다. 망막 모아서 칼슘 / 마그네슘 2+ PBS 2 ㎖을 함유하는 5.4 ml의 폴리스티렌 시험관에 옮긴다.

4. 단일 세포 현탁액을 준비

  1. 제조업체의 지침에 약간의 수정과 신경 조직 분리 키트를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 요약하면, 최대 피펫 팅 및 P1000 피펫과 함께 아래로 흔들어없이 37 ℃로 효소 소화를 수행하여 씹다 망막.

유세포 분석 5. 염색 단일 세포 현탁액

  1. 염색 완충액 200 μL에 재현 탁 셀은 U 바닥 96 웰 플레이트 및 전사 (0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.09 %의 아 지드 화 나트륨을 가진 둘 베코 인산염 완충 염수). 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
    참고 : 나트륨 아 지드는 인간과 환경에 유해한입니다. 적절한 개인 보호 장비 a를 사용하여차 지역 규정에 따라 폐기물을 폐기합니다.
  2. 상층 액을 버리고 싱크대 위에 접시를 반전. 5 ㎍ / 항 - 마우스 CD16 / CD32 항체 ml의 웰 당을 포함하는 얼룩 버퍼의 25 μL로 된 Fc 수용체에 resuspend 세포를 차단합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
  3. 항 - 마우스 Ly6C-APC-Cy7 0.5 ㎍ / ml의 항 - 마우스 Ly6G-PE-Cy7 0.5 ㎍ / ㎖의 항 - 마우스 CD11b를-AF650의 2.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 25 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
  4. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 버리고 접시를 반전. 염색 버퍼의 200 μl의 세포를 재현 탁하여 씻으십시오.
  5. 130 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 요오드화 프로피 듐 (PI), 0.5 ㎍ / ml를 함유 염색 완충액 200 μL에 재현 탁. 1.2 ml의 마이크로 타이 튜브에 전송합니다.
  6. 의 이전 200 μL와 PI 및 수영장 0.5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 염색 버퍼의 추가 100 μL와 우물을 씻으십시오1.2 ml의 마이크로 타이 튜브. 염색 된 세포 300 μl의 총 부피를 얻을 수있다.

6. 유세포 분석

  1. 기존의 세 가지 레이저 (보라색, 파란색과 빨간색 레이저)를 사용하여, PE,를 PerCP-Cy5.5, BV510, 그리고 매우 밝은 형광 AF488 입자에서 상당한 파급에 의한 PI 염료을 피하십시오. 그것은 (대신를 PerCP-Cy5.5 채널의 mCherry 채널)은 PE 표지 항체 및 PI 수 있습니다로 (그림 2)를 사용,이 분석을 최적화하기 위해 네 번째 (노란색) 레이저를 사용합니다.
    참고 : 옐로우 레이저를 사용할 수없는 경우, 다른 채널에서 죽은 세포 제외 염료를 사용합니다.
  2. PI 부정적인 세포 (PI-)에 게이트 죽은 세포 (그림 2B)를 제외합니다.
  3. 죽은 세포, CD11b를 양성 세포 (CD11b를 +)에 게이트를 제외하면이 모든 골수 세포 (그림 2C)를 포함한다.
  4. Ly6C에 CD11b를 + 인구, 게이트 내 - / Ly6G는 - 제외 할호중구 (CD11b를 + / Ly6G +)와 단핵구 (CD11b를 + / Ly6C +도 2D). 미세 아교 세포 (- / Ly6G - 여기 CD11b를 + / Ly6C로 정의 단순화를 위해)에 게이팅 후,이 명확 인구가 볼 수 있어야합니다; 음 하나는 형광 표지 된 입자 긍정적. 식세포 입자를 촬영 한 것입니다 AF488 + (그림 2E)는 그러므로 있습니다.
    주 : 양수 또는 Ly6C Ly6G 양성 집단의이 염색 방법을 사용하여 입자의 흡수를 측정하기 위하여 분석 될 수있다. 식세포는 CD11b + 세포의 비율은 식세포 미세 아교 세포의 비율 (그림 2 층)과 잘 상관 관계. 이 균성 호중구 및 단핵 세포뿐만 아니라, 미세 아교 세포를 포함 불구 유세포 경험이없는 연구자 단독는 CD11b 염색과 간단한 분석이 수행 될 수있다. / Ly6G - -이 CD11b를 + / Ly6C 내 </ SUP> 인구, 마커 F4 / 80과 CX3CR1 염색에 의해 판단 이러한 세포가> 99 % 미세 아교 세포이다; 이러한 마커를 추가하지만 우리의 손에 필요하지 않습니다 수 있습니다.

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Representative Results

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수있다. 리포 폴리 사카 라이드 다양한 선량 (LPS)의 복강 내 투여 하였다. 24 시간 LPS 챌린지 후, 여기에 설명 된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포 기능 (도 3A)을 평가하기 위해 사용되었다. (26) 예상되는 바와 같이, 차량 제어부 (도 3B)에 비해 1.42 mg의 복용량은 / kg의 LPS를 탐식 미세 아교 세포의 퍼센트에서 통계 학적으로 유의 한 증가를 유도.


망막 레이어에 형광 표지 된 입자를 나타내는 유리체 강내 주입 설치 및 대표 망막 섹션 : 그림 1. (A) 겔 팩 해부 현미경으로 위치된다. (B) 강내 주입, 눈의 위치를 나타내는 바와 같이 설치류가 유지된다. (C) 세 시간 주입 형광 표지 된 입자에 걸쳐 대부분의 망막 층을 볼 수있다 후에. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP 마우스와 빨간색 형광으로 표지 입자는 미세 아교 세포에 의해 입자의 흡수를 시각화하는 데 사용되었다. 깊은 (D)에서 미세 아교 세포와 표면 (E) 층은 입자를 차지합니다. 스케일 바 -. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 게이팅 전략 식세포 미세 아교 세포를 선택합니다 (A)는 P10 마우스에서 망막 조직에서 단일 세포 현탁액을 분석 (B) 죽은 세포를 (PI의 +)를 제외하면, (C)는 CD11b + 세포가 선택 (D)에... 만 미세 아교 세포에 대한 선택, CD11b를 + 호중구 (Ly6G +)와 단핵구 (Ly6C +)는 제외된다. (E) 식세포 미세 아교 세포가 형광 표지 된 입자를 촬영 한 것입니다. (F) 식세포는 CD11b + 세포의 수는 미세 아교 세포의 것과 유사하다 (CD11b를 + Ly6G - Ly6C -). N = 9, 3 개의 독립적 인 실험에서 풀링; 오차 막대는 ± SEM을 의미 나타냅니다.rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 미세 아교 세포 탐식 기능이 LPS 도전 후 새끼들까지 잔치 및 성인 마우스에서 평가 될 수있다 (A) 젊은 마우스 (P10)을 24 시간 식균 작용을 평가하기 전에, 다양한 용량으로 복강 내 LPS에 도전했다 (B) 챌린지 1.42 밀리그램과 /. 차량 제어 (p = 0.0021)에 비해 kg은 포식 망막 미세 아교 세포의 증가 비율을 크게 가져. (C)이 프로토콜은 모두 성인 새끼 마우스의 망막 소교 식세포 기능을 측정 할 수있다. LPS와 도전하지 영 (P10) 마우스 (p = 0.019)에 비해 성인 쥐의 미세 아교 세포 탐식 상당히 작은 백분율이있다. n은 서너에서 풀링 9 -12,독립적 인 실험; 오차 막대는 ± SEM을 의미 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유리체 강내 주사는 도전하고 수행이되지 않을 경우 제대로 편견과 변수의 결과로 이어질 것입니다. 가난한 사출 기술과 관련된 일반적인 문제는 출혈과 염증이 발생할 수 있습니다 망막에 렌즈 및 / 또는 손상의 천공 있습니다. 안구 외상의 위험을 최소화하기 위해, 설치류 최소한 헤드 운동 안정된 위치에 있어야한다. 안구 침투 주사기 천천히 삽입 타격하지 않도록 너무 멀리 가압되어야렌즈. 또 다른 일반적인 합병증은 눈 밖으로 주입 물질의 역류이다. 이를 방지하기 위해 상기 플런저 사출 후에 안구는 눈구멍으로 후퇴하도록 허용되어야하며, 주사기를 서서히 후퇴한다 천천히 눌려져한다. 가장 강내 주사는 낮은 수준의 미세 아교 세포를 활성화하지만, 치료 및 치료 군 들간의 차이를 측정 할 수있다. 이는 적절한 제어 (예를 들어, 비 도전 쥐) 기준 식세포 레벨을 확립하기 위해 각각의 실험에 사용하는 것이 필수적이다. 연습이 필요이 방법의 또 다른 측면은 망막 박리된다. 표본에서 유사한 단일 세포의 준비를 보장하기 위해, 망막 조직은 신속하고 최소한의 가능한 조직 중단 수집해야합니다. 수집을 용이하게 - PBS의 해부의 마지막 단계를 수행 (3.7 3.4 참조). 마지막으로, 유동 세포 계측법 정확하게 망막 조직을 제조하는 것이 중요하다. 활성화 된 미세 아교 세포가 된 Fc를 상향 조절항체의 Fc 부분에 결합하는 수용체 이에 비특이적 7을 발생할 수있다. 된 Fc 블록은 비특이적 염색을 방지하기 위해 수행되어야한다. 적절한 형광 및 설정 보상의 선택은 또한 27 중요합니다.

우리는 정기적으로이 실험을 위해 10 ~ 20 출생 후의 일 세 마우스를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 성인 마우스 (도 3c)에서 소교 식세포 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 모든 약 5 %의 성인 (보다 - (모든 CD11b를 + 세포의 50 %를 약 40)으로 인해 hyaloid 혈관의 존재에 참고, 중, 외래 골수 세포 (Ly6C + 또는 Ly6G +)의 인구는 젊은 쥐에서 더 눈에 띄는 CD11b를 + 세포). 연구진은 실험에 가장 적합한 나이를 결정해야한다. 여기에 제시된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 탐식 레벨 강력한 검출을 허용한다. 그러나, 우리는 그 세 네 생물에게 추천Al을 각각의 실험에 사용되는 복제하고, 적어도 3 개의 독립적 인 실험을 수행한다. 이 프로토콜에서 사용되는 입자는 식세포 분석 21-23 대한 검증되었지만 추가 검증이 필요한 경우, 특정 식세포 마커 입자의 면역 공동 지역화 수행 될 수있다.

이 방법의 하나의 잠재적 인 제한은 입자 미세 아교 세포의 차동 접근이다. 정상 망막, 미세 아교 세포는 두 개의 층, 깊은 외측 얼기 층 및 유리체 7에 근접할수록 표면 내측 얼기 층에 있습니다. 자극시, 또는 노화 동안, 미세 아교 세포는 모든 망막 층에 걸쳐 마이그레이션 할 수 있습니다. 이 방법에서, 형광 표지 된 입자 유리체 내에 주입된다. 세 시간 주입 한 후이 망막 전반에 걸쳐, 특히 vitreal 표면을 따라 입자의 축적을 초래한다. 연구진은 더 concentrati을 최적화 할 수있다그들의 실험 주입 후 입자 또는 시간에. 이 유리체에 가까운 근접에서 미세 아교 세포가 입자에 쉽게 액세스 할 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 입자가 망막에 걸쳐 확산과 아마도 제한된 비드 액세스 (그림 1C-E)에, 모든 계층에 걸쳐하지만 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 미세 아교 세포에 의해 흡수되는 것으로 나타났다. 우리는 (나이가 누적 될 수 있습니다) 망막 미세 아교 세포가 입자에 액세스 할 지 여부를 결정 못하고있다. 이 연구자 중요한 경우,이 프로토콜은 입자의 조심 망막 주입 후에 수행 될 수있다. 또 다른 중요한 고려 사항은 CNS의 다른 지역의 망막 미세 아교 세포 및 미세 아교 세포 사이 본질적 다양한 동작이있을 수 있다는 것이다. 또한 뇌의 특정 영역이 다른 질환 감수성있는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 파킨슨 병에서 흑질 신경 세포 주로 Alz로에 동시에 영향HEIMER 병은, 해마 신경 세포는 대부분 (28)의 영향을받습니다. 특정 질환의 병리학을 연구 할 때 즉, 뇌 영역이 중요한 요소가 될 것으로 예상된다. 여기에 설명 된 것과 유사한 프로토콜은 망막과 뇌 미세 아교 세포의 탐식 반응에 잠재적 인 차이를 탐구하는 두개 내 주사 후 수행 될 수있다. 망막은 혈액 망막 장벽 (20)의 존재를 포함하는 뇌의 다른 지역과 많은 공통 기능을 가지고 있습니다. 망막 미세 아교 세포 및 뇌 미세 아교 세포는 같은 난황 전구 세포에서 유래와 형태 및 세포 표면 마커의 발현 7,29과 관련하여 매우 유사하게 나타납니다. 또한, 몇몇 뇌 질환 (예, 알츠하이머 병, 뇌졸중, 및 다발성 경화증)이 망막도 20에 영향을 나타내는 안구 증상이있다. 연구자들은 잠재적 인 지역적 차이에주의해야하지만, 우리는이에 대한 정보 모델이라고 생각모든 미세 아교 세포의 연구, 소교 식균 작용을 연구하는 모든 신경 과학자가이 프로토콜을 사용할 수 있음을 시사한다.

눈이 분석을 수행하는 뚜렷한 장점은 여러 기술들은 다양한 망막 신경 인성 응력을 유도하기 위해 개발되었고, 스트레스 반응은 표준 프로토콜을 사용하여 (30), 생체 내에서 모니터링하고 정량화 될 수 있다는 것이다. 여기에 설명 된 분석을 신경성 스트레스를 유도하고 수행함으로써, 연구진은 정도에 차이가 모욕의 광범위한 스펙트럼에 걸쳐 미세 아교 세포의 기능을 분석 할 수 있습니다. 정렬 기술 유세포과 결합 될 때 마지막으로,이 프로토콜은 식세포 미세 아교 세포 (예, qPCR에, 세포 배양, 프로테오믹스)의 깊이 분석을 허용 할 수있다 면역 위에 이점을 갖는다.

입자의 흡수 이전 식세포 기능 모두 시험 관내생체 내 시스템에서 측정에 사용되었다. 라라 자세 히 입자, 수확 및 뇌 조직, 냉동 절편, 면역, 이미징 및 사후 영상 분석 (18)의 동결 두개 내 주입을 포함했다. 여기에 제시된 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 식세포의 기능을 훨씬 빠르게 정량화 수 있습니다. 이는 고감도 미세 아교 세포는 생리 문맥 탐식 기능의 평가를 허용 이들 미세로부터 제거되지 않는 시험 관내 시스템에 비해 이점을 갖는다. 구체적으로는 다른 세포 유형의 결함 (예, 신경 세포에서 유전자의 유전 적 절제가) 미세 아교 세포의 식세포 기능에 영향을 미치는 방법의 테스트를 사용하도록 설정해야합니다. 그것은 또한 식세포 세포 집단의 정량 빠르고, 정확한 검출을 가능 유세포 사용하여 생체 내 분석을 통해 이전의 이점을 갖는다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

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References

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