تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وغالبا ما يسبب عدم انتظام ضربات القلب ورثت من الطفرات التي تغير تسليم سطح القنوات الأيونية واحد أو أكثر. هنا، علينا أن نكيف التدفق الخلوي المقايسات لتوفير الكمي من إجمالي وسطح الخلية بروتين تعبير نسبي من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201 الخلايا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وتقدم هذه الورقة فحص موثوق للإبلاغ عن التعبير سطح الخلية النسبي للبروتينات غشاء مثل القنوات الأيونية التي أعرب عنها في خلايا المؤتلف باستخدام تقنية التدفق الخلوي القائمة. القنوات الأيونية هي تشكيل المسام بروتينات غشاء التي هي المسؤولة عن السيطرة على الإشارات الكهربائية عن طريق النابضة تدفق الأيونات عبر غشاء الخلية. يتم تصنيفها من قبل آلية تفعيل، والطبيعة، والانتقائية الأنواع أيون تمر عبر المسام حيث يتم ترجمة ما. في مستويات الخلايا والأنسجة، وتدفقات أيون العيانية من خلال القنوات الأيونية هي نتاج الخصائص الفيزيائية الحيوية 1 (النابضة وتخلل)، والكيمياء الحيوية (الفسفرة)، ونشوء حيوي (التوليف، بالغليكوزيل، والاتجار، وتدهور). كل من هذه العمليات هي فريدة من نوعها لكل نوع من القنوات الأيونية وهو الأمثل لأداء الدور الفسيولوجي للقناة أيون. ونتيجة لذلك، وتعديلات في أي من هذه العمليات ضبطها غرامة من خلالالموروثة أو التعديل الوراثي، وغالبا ما يشار إليها باسم "اعتلال القنوات"، يمكن أن يؤثر سلبا على التوازن الخلية. ومن المهم التأكيد على أن توفير "الحق" كمية من القنوات الأيونية على سطح الخلية أمر بالغ الأهمية لتوازن الخلايا. حتى زيادات صغيرة (ربح من وظيفة) وانخفاض صغيرة (الخسارة من وظيفة) في نشاط القناة الايونية لديها القدرة على التسبب في أمراض خطيرة على مدى العمر. عيوب في تسليم سطح الخلية من القنوات الأيونية الناضجة هي من العوامل الهامة في العديد من channelopathies، مثل التليف الكيسي (القناة الايونية CFTR) (2) وعدم انتظام ضربات القلب من شكل طويل كيو تي متلازمة (قنوات البوتاسيوم في القلب) 3.

ترتبط Channelopathies مع الموت المفاجئ القلب 4. ويعتقد أن انتشار في جميع أنحاء العالم الحالي لجميع channelopathies القلب أن يكون على الأقل 1: 2،000-1: 3000 في الفردي ومسؤولة عن حوالي نصف المفاجئ عدم اتساق نبضات القلب كاليفورنيا موت القلبإس إي إس 6. ومن المعروف أن الخلل في القلب الجهد بوابات sodium-، البوتاسيوم، والكالسيوم القنوات الأيونية الانتقائية للعب دورا رئيسيا في هذه العملية. مطلوب L من نوع كا V 1.2 قناة الكالسيوم الجهد بوابات لبدء متزامنة القلب تقلص العضلات. وقلبية L من نوع كا V 1.2 قناة هو بروتين معقد متعدد فرعية مؤلفة من تشكيل المسام الرئيسية الكالسيوم فرعية الخامس α1 والكالسيوم الخامس ß والكالسيوم الخامس α2δ1 مفارز المساعدة 7-12. لاحظ أنه مطلوب مجموعة كاملة من وحدات فرعية إضافية للإنتاج وظيفية الكالسيوم V 1.2 قنوات في غشاء البلازما والتفاعلات الدينامية بين هذه الوحدات الفرعية ضرورية لدعم وظيفة الكهربائية العادية للقلب 13. كاليفورنيا الخامس ß يشجع على التعبير سطح الخلية كا V 1.2 القنوات غير التساهمية nanomolar التفاعل مسعور 14. شارك في التعبير عن كا الخامس α2δ1 فرعية وايملزمة SS-تشرين الكالسيوم الخامس الكالسيوم الخامس α1 يحفز التعبير الذروة الحالية (5-10 أضعاف) ويعزز تفعيل القناة في الفولتية أكثر سلبية. الحصول على وظيفة من الطفرات من الوحيدات تشكيل المسام وقد ارتبط الكالسيوم V 1.2 مع شكل من أشكال عدم انتظام ضربات القلب البطيني تسمى متلازمة كيو تي الطويلة 15 في حين أن مجموعة من الطفرات نقطة في مفارز الرئيسية الثلاثة التي تشكل L من نوع كا V 1.2 قناة تم تحديدها في موضوعات يعانون من عدم انتظام ضربات القلب من شكل متلازمة قصيرة QT 16،17. القنوات الأيونية هي بروتينات الغشاء الذي يمكن التحقيق من وجهة نظر الكيمياء الحيوية (كيمياء البروتين) أو باستخدام أدوات الكهربية (آلات توليد الحالي) وغالبا ما تستخدم هذه المناهج التكميلية. الكهربية، ولا سيما خلية كاملة التصحيح، لقط، هو نهج مناسب لتوضيح وظيفة القنوات الأيونية 15 ولكن لا يمكن حل التعديلات في الاتجار البروتين من التغييرات في فيزيائية لهاالخصائص. الكيمياء البروتين و، ومع ذلك، وغالبا ما يقتصر استخدام بسبب التعبير منخفضة نسبيا من بروتينات الغشاء كبيرة النسبية للبروتينات قابلة للذوبان أصغر. تحتاج إلى تطوير لتعالج على وجه التحديد عيوب في نشوء حيوي البروتين يسبب تغييرات في التعبير سطح الخلية من القنوات الأيونية قوية الأساليب الإنتاجية العالية باستخدام قراءات مضان.

التدفق الخلوي هي تكنولوجيا الفيزيائية الحيوية المستخدمة في عد الخلايا، والفرز، وكشف العلامات البيولوجية، وهندسة البروتينات 18. عندما يتم حقن محلول عينة من الخلايا الحية أو الجسيمات في قياس التدفق الخلوي، يتم ترتيب الخلايا في تيار واحد التي يمكن بحثها من قبل نظام الكشف عن الجهاز (الشكل 1). تدفق الأول الكريات أداة أنتجت في عام 1956 19 الكشف عن معلمة واحدة فقط ولكن أجهزة قياس التدفق الخلوي الحديثة ليزر متعددة وأجهزة الكشف عن مضان التي تسمح للكشف عن أكثر من 30 المعلمات الفلورسنت 20،21.الفلاتر والمرايا (البصريات الانبعاث) مباشرة مبعثر خفيفة أو ضوء الفلورسنت من الخلايا لشبكة إلكترونية (الضوئي وأجهزة الكشف) التي تحول ضوء يتناسب مع شدته. ويتم تحليل البيانات الرقمية باستخدام برامج متخصصة ويتم عرض الإنتاج الأساسي باعتباره نقطة مؤامرة 21.

شكل 1
الشكل 1: مبادئ فيزيائي حيوي من تدفق الفرز الخلوي يتم دفع الخلايا واحدة من خلال فوهة تحت ضغط عال داخل تيار من السوائل غمد الذي ينقلهم عبر واحدة أو أكثر من نقاط الاستجواب الليزر. ينحرف شعاع ضوء من الخلايا تمر ويتم إرسالها ضوء جمعها في الاتجاه إلى الأمام (إلى الأمام مبعثر، FCS) إلى الثنائي الضوئي الذي يحول الضوء إلى إشارة يتناسب مع حجم الخلية. يتم جمع ضوء أيضا في زاوية 90 درجة إلى طريق الليزر وإرسالها إلى أجهزة الكشف عن (وتسمى أيضا صمام تضخيم ضوئي (PMT)).يتم توجيه هذا الضوء من خلال المرايا مزدوج اللون التي تسمح للكشف عن إشارة الجانب مبعثر (SSC)، مما يعكس تحبب داخل الخلايا، والانبعاثات الفلورسنت إذا fluorochromes متحمس موجودة في الخلية. يتم تمثيل ثلاثة أجهزة الكشف عن (الأخضر والأصفر، والأحمر) مع مرشحات مختلفة الطول الموجي ممر الموجة، والسماح للكشف في وقت واحد fluorochromes مختلفة. ورقمنة الإشارات المختلفة من خلال جهاز كمبيوتر خارجي وتحويلها إلى بيانات التي سيتم تحليلها لتحديد خصائص الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد استغل القدرة الإنتاجية العالية من أجهزة قياس التدفق الخلوي لقياس التعبير غشاء النسبي المؤتلف من النوع البري والاتجار نقص الجهد بوابات L من نوع كا V 1.2 القنوات ومفارز المرتبطة في الخلايا الحية. كدنا] يبني المشتركوالموسومة دينغ للبروتينات مضاعفة للقيام في وقت واحد حاتمة خارج الخلية غير الفلورسنت التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة مترافق فلوري كتيمة وfluorophore الخلايا التي هي فلوري جوهري. كلا حاتمة خارج الخلية، وإدراجها في حلقة خارج الخلية من البروتين، وfluorophore داخل الخلايا، وإدراجها بعد C-محطة، وتحول مع البروتين. في هذه السلسلة من التجارب، وهندسة كا بروتين الخامس α2δ1 إبداء هيماغلوتينين خارج الخلية (HA) حاتمة (YPYDVPDYA) الكشف من قبل FITC (فلوريسئين ثيوسيانات) بردة -conjugated مكافحة HA و mCherry كما fluorophore الخلايا الذاتية. لتحديد مستوى التعبير سطح الخلية النسبي للmCherry-كا الخامس α2δ1 بروتين HA الموسومة، وخلايا تم حصادها المؤتلف التعبير عن بروتين الانصهار بعد ترنسفكأيشن، وملطخة FITC مترافق الماوس وحيدة النسيلة المضادة للHA العلامة حاتمة antibodص (الشكل 2). FITC هو مركب الفلورسنت العضوي الذي هو أصغر بكثير من صحفيين الانزيم وبالتالي ليس من المرجح لتتداخل مع وظيفة بيولوجية. mCherry- الكالسيوم الخامس α2δ1-HA overexpressed في TSA-201cells، وتنتج عن زيادة قدرها 3-سجل كبيرة في مضان FITC وmCherry مضان على قطع ثنائية الأبعاد 22. وبالنظر إلى أن حاتمة HA يقع في جزء الخلية من البروتين، وكثافة مضان لFITC التي تم الحصول عليها في وجود خلايا سليمة تعكس المؤشر النسبي للتعبير عن سطح الخلية من البروتين HA الموسومة. إمكانية الوصول إلى حاتمة HA في بنيات يتم التحقق بشكل منهجي عن طريق قياس إشارة FITC بعد permeabilization الخلية. يخدم هذا الإجراء أيضا لإثبات مجموع تعبير البروتين تطبيع منذ كثافات مضان النسبية لFITC قدرت في الخلايا permeabilized قابلة للمقارنة نوعيا إلى القيم النسبية مضان FOص mCherry تقاس في ظل ظروف permeabilized وغير permeabilized 22،23. من المهم أن نلاحظ أن الطيف مضان جوهري هو تحول نحو القيم العليا بعد permeabilization إلا أن القيمة الوحيدة التي أبلغ عنها هو التغير في كثافة مضان بالمقارنة مع بناء السيطرة. وتقدر التغيرات النسبية في كثافة مضان لبنيات الاختبار باستخدام كثافة ΔMean الإسفار (ΔMFI) القيم لكل fluorophore (mCherry أو FITC). تم تصميم التجارب لقياس كثافة مضان الاختبار بناء بالنسبة للكثافة مضان من بناء سيطرة أعرب تحت نفس الظروف للحد من الاختلافات التجريبية في مضان لا يتجزأ من الأجسام المضادة fluorophore مترافق. درست اثنين من البروتينات الغشاء بنجاح باستخدام هذا الاختبار: الوحيدات تشكيل المسام من L-نوع الجهد بوابات قنوات الكالسيوم الكالسيوم V 1.2 14،22 وفي سلسلة مختلفة منالتجارب، مساعد خارج الخلية كا الخامس α2δ1 فرعية 22،23. تم استخدام بروتوكول التالية لتحديد التعبير سطح الخلية من الكالسيوم الخامس α2δ1 فرعية من القلب L من نوع كا V 1.2 قناة ظل ظروف السيطرة وبعد الطفرات التي تؤثر على تعديل posttranslational من القناة الايونية. تحت ظروف تجريبية موحدة، ومضان سطح الخلية من FITC يزيد شبه خطيا مع التعبير عن كدنا] الترميز لmCherry-كا الخامس البروتينات α2δ1-HA (الشكل 5 من مرجع 22).

الشكل 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لوضع العلامات الكلي والغشاء في التدفق الخلوي بروتوكول تجريبي ويبين المخطط بعض الخطوات الرئيسية اللازمة لقياس نسبي تعبير كامل وسطح الخلية من القنوات الأيونية المؤتلف التي كتبها فلوريداآه الخلوي. و transfected الخلايا مع المزدوج معلم البناء mCherry-كا الخامس α2δ1-HA في TSA-201 الخلايا (1) وملطخة قبل أو بعد permeabilization (2). يتم الحصول على البيانات Multiparameter في قياس التدفق الخلوي (3) للتحليل متعدد المتغيرات (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. يبني المضاعفة معلم الحمض النووي

  1. إدراج حاتمة HA (YPYDVPDYA) في رابط خارج الخلية كا الخامس α2δ1 بين D676 و R677 من قبل الموقع الموجه الطفرات (الشكل 3B) 20. استخدام gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC التمهيدي إلى الأمام وعكس acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC التمهيدي.
  2. Subclone تسلسل كدنا] من ها كا الخامس α2δ1 الموسومة في ناقلات التعبير عن pmCherry N1 الثدييات تهدف إلى التعبير عن بروتين تنصهر إلى N-محطة من mCherry بين المواقع ساسي وسالي (الشكل 3B) 20.
    ملاحظة: المناسبة وظيفة قناة لا بد من اختبار مع بناء للسيطرة على استخدام أساليب الكهربية القياسية 24.

2. بوساطة الحويصلية ترنسفكأيشن عابر (30 دقيقة، يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت تدفق رقائقي هود)

  1. يوم 1: لوحة لنصف مليون تسا-201 الخلايا (أو HEKT) في35 أطباق ثقافة ملم مع 2 مل من Dulbecco والأساسية الدنيا والمتوسطة عالية الجلوكوز (DMEM-HG) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ المتوسطة (PS) ثقافة البنسلين ستربتومايسين. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات القياسية. تقييم قابلية الخلية من جزء من العينة الخلية باستخدام التريبان الأزرق. لوحة خلايا كافية للوصول إلى 90٪ التقاء في وقت ترنسفكأيشن.
  2. يوم 2: تغيير مستنبت مع 2 مل من جديد قبل تحسنت (37 درجة مئوية) مستنبت دون PS.
  3. لكل عينة ترنسفكأيشن، وإعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب. في أنبوب 1، وتمييع 4 ميكروغرام من الحمض النووي في 250 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. في أنبوب 2، مزيج 10 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن بوساطة الحويصلية مع 250 ميكرولتر مستنبت خفض المصل. المزيج بلطف كاشف ترنسفكأيشن قبل الاستخدام.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. الجمع بين محتويات أنبوب 1 و 2 أنبوب، مزيج بلطف واحتضان لا يقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة الجسيمات الشحمية / DNوالمجمعات إلى الخلايا المستزرعة وبلطف تهز الطبق الثقافة إلى المزيج.
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 24 ساعة.

3. تلون الخلايا للالتدفق الخلوي (3 ساعات)

  1. إعداد عينات الخلايا
    1. يوم 3: إزالة المتوسطة من الطبق الثقافة بعناية وغسل الخلايا مع 400 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين 1X-EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل).
    2. إضافة 400 ميكرولتر من التربسين-EDTA واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا لفصل من الطبق.
    3. وقف انزيم الهضم عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت البارد دون PS وتغسل جميع الخلايا من السطح عن طريق pipetting بلطف 4-5 مرات. تجنب الإفراط في الهضم والإفراط pipetting لللحد من موت الخلايا.
    4. جمع الخلايا في أنابيب 1.5 مل ومكان على الفور على الجليد. استخدام حلول الباردة الجليد والحفاظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية لمنع تدخيلمن السطح المستضدات. تقليل الإضاءة للحد من photobleaching من إشارة الفلورسنت.
    5. أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح بعناية وتجاهل طاف.
    6. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإعداد تعليق خلية واحدة.
    7. لفترة وجيزة دوامة الأنابيب بلطف شديد وكرر الخطوات من 3.1.5 و 3.1.6 لإزالة مستنبت.
    8. إعادة تعليق بيليه في 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X وضبط تركيز الخلية إلى الحد الأدنى من 3 × 10 6 خلية / مل.
    9. تقسيم الخلايا في اثنين الجديدة 1.5 مل أنابيب لتلطيخ خارج الخلية والخلايا. وتشمل الضوابط المناسبة للتمييز تلطيخ محددة من تلطيخ غير محددة.
      ملاحظة: الجسم المضاد isotype السيطرة يساعد على تقييم مستوى تلوين الخلفية ويجب أن تتطابق بشكل مثالي الأنواع المضيفة كل الأجسام المضادة الأولية، ونمط إسوي وfluorophore. استخدام isotype السيطرة والأجسام المضادة مترافق في الوقت نفسهتركيز البروتين.

الجدول 1
الجدول 1: الانسياب الخلوي عينات السيطرة التجربة لغير permeabilized وpermeabilized الخلايا كل تجربة يجب أن تشمل ضوابط السلبية التالية: (1) خلايا Nontransfected (بدون الأجسام المضادة، مع نمط إسوي أو مع الأجسام المضادة مترافق). (2) خلايا Transfected مع البروتين من الفائدة subcloned في البلازميد دون التأسيسي تألقي داخل الخلايا فلوري (pCMV- الكالسيوم الخامس α2δ1-HA) أو مع بناء الموسومة مضاعف (pmCherry-كا الخامس α2δ1 وحضنت دون الأجسام المضادة، مع نمط إسوي أو مع الأجسام المضادة مترافق). وتستخدم الضوابط لون واحد للحصول على تعويضات من تداخل الانبعاثات تألقي. يتم تشغيل الضوابط نفسها لغير permeabilized وpermeabilized الأوضاع في كل سلسلة من التجارب.

  1. تلطيخ الخلايا السطحية سليمةخلايا حية
    1. قسامة 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل.
    2. إضافة FITC مترافق المضادة وحيدة النسيلة المضادة للHA الأجسام المضادة في 5 ميكروغرام / مل، ودوامة قبل احتضان الخلايا على منصة الروك (200 دورة في الدقيقة) في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: تم تحديد تركيز الأمثل من الأجسام المضادة في التجارب المعايرة الأولية (الشكل 4).
    3. إزالة الخلايا من الظلام وإضافة 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / أنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. نضح طاف و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X، دوامة والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. تكرار غسل (الخطوة 3.2.4) مرتين لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن، واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسب.
    6. بعد غسل النهائي، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X ونقل تعليق خلية واحدة في 5 مل التدفق الخلوي الأنابيب. إبقاء الخلاياالصورة في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تشغيل العينة.
    7. تشغيل العينات على الكريات التدفق. للحصول على أفضل النتائج، وتحليل الخلايا على قياس التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن وفي موعد لا يتجاوز 24 ساعة بعد.
  2. تلطيخ الخلايا: التثبيت، Permeabilization، وتلطيخ
    1. قسامة 1 × 10 6 خلية / 100 ميكرولتر في 1.5 مل الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 100 ميكرولتر من محلول التثبيت-permeabilization مباشرة من الأسهم.
    3. احتضان في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1X permeabilization غسل الطازجة (تمييع 10X العازلة permeabilization الغسل في المقطر H 2 O). دوامة والرواسب الخلايا باستخدام جهاز للطرد المركزي الطاولة في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. نضح وتجاهل طاف.
    6. كرر الخطوات من 3.3.4 و 3.3.5.
    7. إضافة FITC مترافق المضادة وحيدة النسيلة-HA مكافحة الأجسام المضادة في 5ميكروغرام / مل في 100 ميكرولتر من العازلة 1X permeabilization الغسل، ودوامة قبل احتضان الخلايا في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ تلطيخ الخلايا باتباع نفس الإجراء واحدة تستخدم لتلوين سطح الخلية. بوساطة سابونين permeabilization الخلية ومع ذلك، فإن عملية عكسها بسرعة، ولذلك فمن المهم أن تحل محل برنامج تلفزيوني 1X العازلة مع 1X بيرم / غسيل للحفاظ على الخلايا في الوجود المستمر للسابونين خلال تلطيخ الخلايا.
    8. إزالة الخلايا من الظلام، وإضافة 100 ميكرولتر العازلة permeabilization الغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر العازلة permeabilization الغسل، دوامة والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    10. تكرار غسل (الخطوة 3.3.9) واحد مزيد من الوقت لإزالة أي أجسام مضادة غير منضم.
    11. بعد غسل النهائي، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X ونقل الخطيئةتعليق خلية غلي إلى 5 مل التدفق الخلوي الأنابيب. إبقاء الخلايا في الظلام في 4 درجات مئوية حتى حقن العينة إلى قياس التدفق الخلوي.
    12. تشغيل العينات على الكريات التدفق. تشغيل عينات ثابتة على الكريات في أقرب وقت ممكن ولكن في موعد لا يتجاوز 1 في الاسبوع بعد تلطيخ. تشغيل الخلايا غير permeabilized وpermeabilized في نفس اليوم.

4. التدفق الخلوي

  1. تدفق عداد الكريات خلية إعداد فارز يوميا
    1. تشغيل البرنامج التدفق الخلوي. قبل التجربة ومعايرة والإعداد قياس التدفق الخلوي فارز خلية لضمان الأداء الأمثل أداة (أي الليزر والبصريات يؤدون طبقا للمواصفات، ليزر والتدفق الخلوي يتم محاذاة بشكل صحيح) باستخدام الخرز إعداد الصك.
    2. استخدام فوهة 100 ميكرومتر مع 20 رطل ضغط غمد.
      ملاحظة: ليس لدى فوهة إلى تغيير على مقاعد البدلاء تدفق عداد الكريات.
    3. تعيين معدل تدفق الكريات وفقا لإنتاج موادمواصفات إيه. غاية معدلات تدفق عالية ستنخفض حساسية في الكشف عن الاختلافات في مضان.
    4. اختر الزرقاء (488 نانومتر لإثارة فلوريسئين Isothiocayanate أو FITC) والأصفر والأخضر (561 نانومتر لإثارة mCherry) ليزر. جمع FITC وmCherry مستويات مضان مع نانومتر 530/30 ومع 610/20 نانومتر ممر الموجة مرشح على التوالي.
    5. الحصول على مبعثر إلى الأمام (FCS) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة نقطة للخلايا غير ملوثين باستخدام مقياس خطي. ضبط تضخيم كل كاشف لتصور خلايا في الربع السفلي الأيسر من مؤامرة نقطة.
  2. قراءة عينة من خلايا سليمة غير permeabilized-
    1. تعيين P1gate للخلايا غير permeabilized الحية التي ترسم شكل حر حول الخلايا لتحليلها باستثناء حطام الخلايا والمجاميع الخلية، مما يحد من إشارة مضان إلى خلايا سليمة.
      ملاحظة: لايف / الأصباغ استبعاد الميتة يمكن استخدامها لتسهيل وضع بوابة على الخلايا الحية. تعيين 10000 الأحداث لتسجيلفي P1 بوابة توقف. تعيين هذا إلى عدد أكبر من الأحداث إذا دعت الحاجة إلى ذلك.
    2. الحصول mCherry مقابل FITC يومين المعلمة كفاف مؤامرة للكشف عن تألق ذاتي أساسي من خلايا غير ملوثين. استخدام على نطاق ونصف لوغاريتمي لإظهار القيم السلبية وتحسين قرار بين السكان 25. ضبط الجهد كل كاشف لضبط الخلايا السلبية غير ملوثين في الجزء السفلي من الوحدات العشرة الأولى من المؤامرات كثافة سجل مضان.
    3. الحصول على جميع العينات سليمة غير permeabilized باستخدام إعدادات أنشئت في 4.1.5 و4.1.6 وجمع FSC، SSC وإشارات في الكشف عن مضان.
    4. تصدير وحفظ الملفات * .fcs لاستخدامها في التحليل باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.
  3. قراءة عينة من خلايا Permeabilized
    1. نقل بوابة P1 لتحديد الخلايا الحية في عينات permeabilized وضبط FSC والجهد SSC كما هو موضح في 4.1.5 و4.1.6.
    2. الحصول على جميع العينات permeabilized وجمع FSC، SSC لإشارات الثانية في الكشف عن مضان.
    3. تصدير وحفظ الملفات * .fcs لاستخدامها في التحليل باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.
  4. تحليل البيانات
    1. إطلاق التدفق الخلوي ملفات برامج التحليل واستيراد * .fcs المحفوظة في 4.2.4 و4.3.3.
    2. انقر على العينة الأولى المدرجة في إطار مساحة العمل. نافذة جديدة سميت على اسم رقم أنبوب يفتح تلقائيا. بدء عملية المحاصرة في حبكة محكمة أمن الدولة مقابل FSC. رسم بوابة (P1) باستخدام رمز البيضوي حول الخلايا الحية، والقضاء على أي حطام، الخلايا الميتة، أو المجاميع التي لها مبعثر إلى الأمام مختلفة والتشرذم الجانب من الخلايا الحية
    3. لرسم يومين المعلمة كفاف مؤامرة من mCherry (المحور الصادي) مقابل FITC (محور س) كثافة مضان من الخلايا الحية، انقر فوق لأول مرة على محور س واختيار FITC-A قناة، ثم انقر على ذ -axis واختيار PE-mCherry-A القناة. انقر على أيقونة "رباعية" لوضع علامة رباعي في حافةخلايا utofluorescent في كل قناة مضان.
      ملاحظة: بوابة مقامة حول الخلايا إيجابية FITC وmCherry هي بوابة P2. يشار إلى السكان الخلية سلبي مضان باسم بوابة P3. انظر الشكل 5 للأسلوب النابضة التمثيلي المستخدمة في هذه المقالة.
    4. حدد P2 P3 والبوابات وانقر على أيقونة "إضافة الاحصائيات" في إطار مساحة العمل الأصلي. انقر على "الكونت" (عدد الخلايا إيجابية)، وانقر على "المتوسط" (متوسط ​​مضان شدة كل تألقي) أو "الوسيط" (الأوسط الإسفار كثافة كل تألقي) الإحصاءات ضمن قائمة من الخيارات. انقر على أيقونة "إضافة الإحصاء" مرة أخرى. يتم نقل جميع هذه القيم تلقائيا إلى إطار مساحة العمل الأصلي.
      ملاحظة: "يعني" يستخدم فقط إذا كانت كثافة مضان تتبع التوزيع الطبيعي. في كل حالة أخرى، انقر فوق علامة التبويب "الوسيط". مؤسسة التمويل الأصغر وبالتالي يمكن أن تشير إلى مضان يعني كثافهذ أو وسيطة الإسفار كثافة.
      ملاحظة: الخطوة التالية هي تطبيق المعلمات والإحصاءات بوابات "لجميع عينات بحثها من قبل الكريات.
    5. في إطار مساحة العمل، واستخدام الماوس لسحب وإسقاط البوابات وإحصاءات المعلمات على خط علامة جميع العينات.
    6. إنشاء تقرير دفعة من المؤامرات ثنائية الأبعاد كفاف (mCherry مقابل FITC) ورسوم بيانية (خلية عد مقابل كثافة مضان) للخلايا غير permeabilized وpermeabilized (أرقام 6A - B).
    7. من الإحصاءات إنشاؤه في الخطوة 4.4.4، وحساب كثافة مضان متوسط ​​(MFI) لكل تألقي للخلايا الملون. من هذه القيمة، وطرح قيمة مؤسسات التمويل الأصغر التي تم الحصول عليها من خلايا غير ملوثين لتحديد السطح والتعبير الكلي للبروتين من الفائدة.
    8. عن القيم ΔMFI لكل fluorophore (mCherry وFITC) (الشكل 6C - D). تطبيع ΔMFI قياس لكا ملاحظة: القيمة المطلقة للكثافة مضان يمكن أن تختلف بشكل كبير تبعا لمجموعة من الأجسام المضادة والقدرات التقنية لكل عامل مختبر، وبالتالي الحاجة إلى تطبيع كثافة مضان من بناء متحولة باستخدام بناء WT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن الاعتماد عليها لتحديد مساحتها الكلية وخلية من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201cells بتدفق اللونين الخلوي الفحص. وكمثال على ذلك، كان كميا سطح الخلية النسبي ومجموع تعبير البروتين لV α2δ1subunit الكالسيوم. من أجل أداء تدفق اللونين الخلوي الفحص، كانت المعلمة الكالسيوم الخامس α2δ1 مضاعف إبداء HA حاتمة غير فلوري خارج الخلية التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق والتأسيسية الفلورسنت الخلايا fluorophore mCherry. الإثارة وانبعاث الأطياف لFITC وmCherry تبين أن FITC هو متحمس بكفاءة 88٪ من الليزر 488 نانومتر ولكن كفاءة تنخفض إلى 0٪ مع ليزر 561 نانومتر. يظهر mCherry 63.9٪ من الحد الأقصى مضان لها عندما متحمس مع ليزر 561 نانومتر ولكن٪ فقط 7.6 مع الليزر 488 نانومتر (الشكل 3). الإثارة وانبعاث جمعية مهندسي البترولCTRA لكل من fluorophores المعرض جمع ضوء الأمثل والحد الأدنى من التداخل مع مختلف أجهزة الليزر واختيار المرشحات. التدفق الخلوي فحوصات يمكن أن توفر معلومات كمية عن التعبير النسبية للبروتينات غشاء من سكان الخلية كبير طالما أن مؤسسات التمويل الأصغر لتألقي معين هو يتناسب طرديا مع تعبير البروتين من الكالسيوم الخامس α2δ1 على كل خلية بدلا من عدد الخلايا الفلورسنت. وهذا ينطوي على استخدام تركيز الأجسام المضادة مضان مترافق خارج التشبع. منحنى المعايرة للأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق ملزمة لالكالسيوم الخامس α2δ1 (الشكل 4) يظهر ثلاث مراحل. في حين تم الكشف عن أي مضان في المرحلة الأولى، وزادت كثافة مضان أضعافا مضاعفة مع زيادة تركيز الأجسام المضادة في المرحلة الثانية. بعد نقطة التشبع (المرحلة الثالثة)، وزيادة تركيز الأجسام المضادة لديها أي تأثير على inten مضان النسبيSITY (RFI) من FITC. تأسست نقطة الأجسام المضادة التشبع مكافحة HA FITC مترافق في 5 ميكروغرام / مل، وبالتالي ضمان أن تركيز مترافق الضد لا يحد من مؤسسات التمويل الأصغر خلال التجارب.

α2δ1was أعرب كا الخامس الموسومة في TSA-201cells والتدفق الخلوي وأجريت فحوصات في وجود FITC مترافق مكافحة HA في الخلايا غير permeabilized (الشكل 5). وقد تم تحليل الضوابط المناسبة (الجدول 1) على الكريات تدفق أن سمات القيم س ص إلى كل خلية تمر عبر شعاع الليزر. هو تصور توزيع الخلايا على قطع نقطة (الشكل 5A). FCS / SSC نقطة المؤامرات تؤكد أن إعداد عينات من الخلايا يوفر تعليق خلية واحدة مع قابلية عالية (الشكل 5BA). بوابة المختارة للخلايا الحية (P1) تمثل 75٪ من العدد الكلي للخلايا تحليلها. مجموع تعبير البروتين سواعتبرت و الكالسيوم الخامس α2δ1 في TSA-201 الخلايا لتكون متناسبة مع مضان mCherry. كما رأينا في mCherry مقابل FITC المؤامرات كفاف ورسوم بيانية (الشكل 5BB - قبل الميلاد)، 47 2٪ TSA-201 خلايا transfected مع pmCherry-كا الخامس α2δ1-HA تم العثور على التعبير عن ملحوظ mCherry مضان كذلك تبين مضان FITC كبير نظرا ل الربط إلى العلامة HA الخارجية من الكالسيوم الخامس α2δ1 في الخلايا غير permeabilized. تجارب السيطرة السلبية التي نفذت دون الأجسام المضادة أو مع نمط إسوي تشير إلى أن FITC يربط فقط أو في الغالب إلى الخلايا transfected بشكل إيجابي.

وقد استخدم هذا البروتوكول لتوصيف دور N-بالغليكوزيل على التعبير الكامل وسطح الخلية من الكالسيوم الخامس α2δ1 في TSA-201cells 23. أجريت تجارب في الخلايا غير permeabilized لتقييم التعبير سطح الخليةوفي الخلايا permeabilized لتقييم التعبير البروتين الكلي وكذلك التأكيد على إمكانية الوصول إلى حاتمة HA. تم احتساب التعبير النسبي من الكالسيوم الخامس α2δ1 بناء على تقدير المؤسسة لكل fluorophore (mCherry أو FITC). تم تطبيع القيم ΔMFI لالمسوخ إلى أقصى القيمة المقاسة في نفس اليوم لmCherry-كا الخامس α2δ1-HA WT أعرب في ظل نفس الظروف. وهذا أمر مهم لحساب التغيرات على مر الزمن في كثافة مضان المطلقة للأجسام المضادة مترافق مكافحة HA FITC. كما رأينا في الشكل 6A، كان ΔMFI لFITC في الخلايا غير permeabilized قوية لWT و4xNQ بناء ولكن على مقربة من مستوى مضان الخلفية للبناء 16xNQ مشيرا إلى أن البروتين هو غائب تقريبا من غشاء البلازما. فحوصات أجريت بعد permeabilization الخلية، وأظهرت أن إجمالي التعبير البروتين في بناء 16xNQ وأيضا انخفضت بشكل ملحوظ سواء كانويستدل من مضان FITC في الخلايا permeabilized أو من مضان mCherry التأسيسي قياس في غير permeabilized وفي الخلايا permeabilized (الشكل 6C - D). كما رأينا في الشكل 6B، زادت مستويات تألق ذاتي الخلوية بعد permeabilization الخلية، والذي يمنع المقارنة بين القيم مضان المطلقة بين خلايا سليمة غير permeabilized وpermeabilized. كان مضان ΔMFI قياس لmCherry مماثل لكل من خلايا غير permeabilized وpermeabilized مما يدل على أن حل permeabilization لا يغير إشارة مضان النسبية mCherry. وارتبط الطفرات المواقع N-بالغليكوزيل مع انخفاض في كثافة مضان لmCherry دعم المراقبة نشرت أن البروتين نشوء حيوي / الاستقرار تم تخفيض 23. في هذه السلسلة من التجارب، وتحولت إشارة مضان النسبية لFITC تقاس في خلايا permeabilized إلى به حتى أصغر من إشارة النسبية لmCherry مما يدل على أن N-نوع الحالة بالغليكوزيل من البروتين يمكن أن تؤثر على كثافة مضان الكشف عنها بواسطة FITC مترافق الأجسام المضادة لمكافحة HA في المجال خارج الخلية. تماما التغيرات في مضان النسبي للFITC قبل بعد permeabilization الخلية توفر مقياس موثوق لتحديد بروتين تعبير.

الشكل (3)
الشكل (3): FITC وmCherry تشكيل زوج مناسب من fluorochromes لفحوصات الخلوي اللونين الإثارة (منحنيات فارغة) والأطياف الانبعاثات (منحنيات شغل) لFITC متحمس مع 488 نانومتر الليزر الأزرق (أأ) وmCherry متحمس مع 561 نانومتر yellow-. ليزر أخضر (آب). تم جمع FITC وmCherry مضان مع 530/30 نانومتر و610/20 نانومتر bandpasالصورة مرشحات على التوالي. ويتم اختيار الطول الموجي للأشعة الليزر مختلفة (لون خطوط عمودية) والمرشحات (المستطيلات الملونة) لجمع الضوء الأمثل والحد الأدنى من التداخل. (ب) تمثيل تخطيطي mCherry-كا الخامس البروتين α2δ1-HA. كانت المعلمة كاليفورنيا الخامس α2δ1 مضاعف إبداء HA حاتمة غير فلوري خارج الخلية التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق والتأسيسية الفلورسنت الخلايا تألقي mCherry. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
و transfected المعايرة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للHA FITC مترافق ملزمة لالكالسيوم الخامس α2δ1 TSA-201 خلايا عابر مع pmCherry-كا V &: الرقم 4. # 945؛ 2δ1-HA وحضنت مع مجموعة من الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق أو نمط إسوي. فقط يتم تحليل إشارة FITC في هذا الفريق. (أ) رسوم بيانية واحدة المعلمة عرض العدد النسبي للخلايا على المحور الصادي وكثافة مضان FITC على محور س لمجموعة الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق تركيزات (0،01 حتي 20 ميكروغرام / مل). (ب) الرسم البياني شبه سجل للأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق بوصفها وظيفة من مؤسسات التمويل الأصغر من FITC. تم تركيب منحنى المعايرة باستخدام موقع واحد المعادلة ملزم مع قيمة خط الاتجاه R 2 = 0.99561. وأظهرت المعايرة تنفيذها للأجسام المضادة نمط إسوي لا مضان كما هو متوقع. تركيزات 0،001-0،01 ميكروغرام / مل لا يمكن تمييزها من الضوضاء في الخلفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1 "> الرقم 5
الرقم 5: تدفق الممثل تحليل الخلوي من غير permeabilized-TSA-201cells transfected مع pmCherry-كا الخامس α2δ1-HA (أ) تمثيل تخطيطي للاستراتيجية المعزولة المستخدمة في التدفق الخلوي عينة التحليل. وقد تم تحليل البيانات بعد استحواذ مع البرنامج المناسب. استراتيجية النابضة الأولى تستغل مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) نقطة مؤامرة لعرض البوابة (P1) حول الخلايا الحية، والقضاء على أي حطام، الخلايا الميتة، أو المجاميع التي لها مبعثر إلى الأمام مختلفة والتشرذم الجانب من الخلايا الحية . تم عرض اثنين من المعلمة المؤامرات كفاف من mCherry (المحور الصادي) مقابل FITC (محور س) كثافة مضان للسكان P1. وضعت بوابات مستطيلة على حافة تألق ذاتي للخلايا لتحديد P2 إيجابي السكان (FITC وmCherry) وP3 السكان سلبي. مستوى مضان لرانه الخلايا داخل P2 المنطقة وP3 وتصور باستخدام الخلايا اللاحقة عد مقابل كثافة مضان رسوم بيانية-معلمة واحدة FITC أو mCherry. وهناك تحول في كثافة مضان على Y- ومحور س يوفر مؤشر موثوق به للتعبير كامل وغشاء من الكالسيوم الخامس α2δ1 على التوالي. شدة إشارة مضان يزيد بوصفها وظيفة من عدد الجزيئات تألقي. (با) الممثل FCS / مؤامرات نقطة SSC لكل حالة كما ورد. تم الحصول على ما مجموعه 10،000 الأحداث لتحليلها. بوابة القطع الناقص (P1) ويوجه بالعين حول الخلايا الحية باستثناء الأحداث مع FSC منخفض (الخلايا الميتة) أو عالية SSC (المجاميع). وضعت (ب ب) الممثل يومين المعلمة المؤامرات كفاف من mCherry (المحور الصادي) مقابل FITC (محور س) كثافة مضان. غيتس على حافة تألق ذاتي للخلايا لعزل السكان من خلايا إيجابية FITC-mCherry (بوابة P2 ) والخلايا الفلورسنت السلبية (P3). (قبل الميلاد) واحدة والسلطة الفلسطينيةrameter رسوم بيانية العد النسبي (أو٪ كحد أقصى) خلايا مقابل كثافة مضان (FITC أو mCherry). وترد توزيع كثافة مضان قياس للخلايا داخل بوابة P2 (الخلايا مضان إيجابي) في الرمادي، ويتم عرض توزيع كثافة مضان للخلايا الموجودة في البوابة P3 (الخلايا مضان السلبية) كما تراكب في مؤامرة رمادية شفافة. كما رأينا، كانت كثافة مضان قوية لكلا mCherry وFITC مشيرا إلى أن الكالسيوم الخامس α2δ1 يتم التعبير بشكل جيد والحاضر بشكل واضح في غشاء الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل (6): في وقت واحد الطفرات المواقع -glycosylation N عطلت السابقين سطح الخليةالضغط والكالسيوم الخامس α2δ1. المستقرة TSA-201 كا خلايا الخامس β3 و transfected عابر في وقت واحد مع pCMV-كا V 1.2 WT وpmCherry-كا الخامس α2δ1-HA WT أو المسوخ. غير permeabilized (A) والخلايا permeabilized (ب) كانت ملطخة مع الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC مترافق كما هو موضح أعلاه. وتظهر الممثلة يومين المعلمة المؤامرات كفاف من mCherry مقابل FITC مضان (لوحات اليسار) والرسم البياني المؤامرات لتوزيع كثافة مضان لمكافحة HA FITC مترافق تلوين الأجسام المضادة (لوحات اليمين) عن المسوخ -glycosylation N (كيو) بعد تعطل أربعة مواقع (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) و 16 مواقع (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) في الخلايا غير permeabilized أو NP سليمة (A) وفي permeabilized أو P خلايا (B). وتوزيع الطاقوتظهر ution من كثافة مضان قياس للخلايا داخل بوابة P2 (الخلايا مضان إيجابي) في الرمادي، ويتم عرض توزيع كثافة مضان للخلايا الموجودة في البوابة P3 (الخلايا مضان السلبية) كما تراكب بشكل شفاف مؤامرة الرمادية. كما رأينا في الفقرة (ب)، وزيادة مستويات تألق ذاتي بعد permeabilization الخلية. كثافة مضان لFITC قياس لجميع خلايا transfected permeabilized زيادة (ينظر إليه على أنه الصحيح التحول على المحور س) مما يدل على أن كل كا البروتينات الخامس α2δ1 transfected الموسومة HA-كانت ملطخة والكشف من قبل الأجسام المضادة لمكافحة HA FITC. (C) بار الرسم البياني يظهر مؤسسات التمويل الأصغر تطبيع قياسها في وجود FITC في (التعبير السطح) سليمة غير permeabilized أو الخلايا permeabilized (مجموع التعبير). وقد تم قياس كثافة مضان النسبية في يثلث لكل حالة (30000 الخلايا) وعلى ثلاث دفعات مختلفة من الخلايا transfecتيد على مدى فترة من 1 الشهر ومن ثم يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM عن 90000 خلايا لكل حالة. تم التوصل إلى كثافة ذروة مضان بين 24 و 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تم استخدام القيم ΔMFI لFITC قياس في الخلايا permeabilized غير سليمة وذلك في مؤشر على التعبير سطح الخلية من الكالسيوم الخامس α2δ1-HA، والقيم ΔMFI لFITC قياس في الخلايا permeabilized تعكس التعبير البروتين الكلي (سطح الخلية والتعبير البروتين داخل الخلايا ). تم احتساب ΔMFI لFITC بطرح كثافة مضان FITC من FITC خلايا السلبية (P3) من شدة مضان من الخلايا إيجابية FITC (P2). تم استخدام نفس الطريقة لحساب ΔMFI لmCherry. وكانت القيم مؤسسات التمويل الأصغر تطبيع إلى القيمة القصوى المقاسة في نفس اليوم لmCherry-كا الخامس α2δ1-HA WT. (D) بار الرسم البياني يبين تطبيع ΔMFI mCherry قياس في غير permeabilized أو الخلايا permeabilized (TOTآل التعبير). يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SEM الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطبيق هذا التدفق الفحص القائمة على الخلوي بنجاح لقياس مستويات الكلية وسطح الخلية النسبية للمفارز fluorescently المسمى تشكيل المسام وما يرتبط بها من قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 14،22،26. يتم استخدام أفضل ما عند التحقيق في تأثير الطفرات الوراثية، وبالتالي يتطلب أن كثافة مضان الجوهرية للمن النوع البري بناء fluorescently المسمى الموسومة تكون على الأقل 10-100 أضعاف أكبر من لشدة مضان من بناء علامة عليه fluorescently المسمى . في هذه الحالة بالذات، وmCherry-كا بناء V α2δ1-HA الموصوفة هنا أسفرت عن أكبر إشارة إلى نسبة الضوضاء ومجموعة ديناميكية أكبر من ما تم قياس للكا V نشرت سابقا 1.2-HA والكالسيوم V 2.3-HA يبني. هناك العديد من الأسباب التي يمكن تصورها لهذا الغرض. ويمكن تكهن بأن البيئة المحلية من حاتمة HA في المجال خارج الخلية كا V &# 945؛ 2δ1 البروتين يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من FITC مترافق الأجسام المضادة لمكافحة HA.

وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن هذه الطريقة لا توفر قيمة مطلقة في عدد من البروتينات على سطح الخلية. التعبير النسبي لبناء المعلمة المطلوبة للحصول على التعبير قناة وظيفية يمكن الحصول عليها على الرغم من ذلك عن طريق أداء جنبا إلى جنب التصحيح، المشبك والتدفق الخلوي التجارب تحت نفس الظروف كما هو مبين في الشكل 7 المرجعية 22. من هذه البيانات، فإنه يمكن تقدير أن الكثافة الحالية الذروة، وهو مقياس عالمي لنشاط القناة الايونية، تزداد بشكل عام بوصفها وظيفة من التعبير سطح كا الخامس α2δ1 فرعية المعلمة. يبقى الحد الرئيسي لهذا سطح الخلية التعبير فحص الحالي أنه لا يمكن تطبيقها في هذا الوقت لدراسة القنوات الأيونية الذاتية. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن بعض الأجسام المضادة المتاحة تجارياومن المعروف أن تربط خصيصا إلى مجالات خارجية توقع من القنوات الأيونية. وبالتالي فإنه يتطلب التلاعب الجيني للتسلسل الرئيسي للبروتين لدراستها وأعرب في خط الخلية المؤتلف غير متمايز مثل TSA-201 الخلايا.

خطوات حاسمة في تعظيم الاستفادة من الفحص: إن التعرف على زوج مناسب من fluorophores، واختيار حاتمة الخارجية، وتوطين الموقع الإدراج حاسمة لنجاح هذا الأسلوب لأن إدخال حاتمة لا ينبغي أن تتداخل مع وظيفة البروتين. تم اختبار تركيبات fluorophore مختلفة. اثنين الحواتم الخارجية: وهيماغلوتينين (HA) حاتمة (YPYDVPDYA) وحاتمة الموقع ملزم بنغاروتوكسين (WRYYESSLEPYPD) 27 وثلاثة مترافق الأضداد الفلورسنت كتيمة قيمت، وهي FITC (فلوريسئين ثيوسيانات) - وR-فيكوإيريترين -، و وPE-Cy7- مترافق الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، أكثر من 10 الإدراج مختلفةتم اختبار مواقع لحاتمة HA الخارجية في كاليفورنيا الخامس α2δ1. وفيما يتعلق بإدراج حاتمة يتطلب الطفرات موقع الموجه وتقنيات الحمض النووي المؤتلف، وينصح لتصميم ما لا يقل عن ثلاث مجموعات من الاشعال في نفس المنطقة. مع 9 المخلفات، حاتمة HA هي واحدة من أصغر الحواتم التي يقوم الأجسام المضادة فلوري، مترافق المتاحة تجاريا ولكن معدل نجاح إدخال 27 النيوكليوتيدات أقل من لطفرة نقطة. زخارف Tetracysteine (بقايا السيستئين-السيستئين برو-الغليسين-السيستئين-السيستئين) هي أصغر 2-بقايا من حاتمة HA لكن فلوريسئين زرنيخي دبوس الشعر الموثق هو غشاء نفيذ وغير مناسبة لتحليل البروتينات بغشاء 28. وأجريت التجارب الأولية مع اثنين fluorophores الخلايا بروتين mCherry والفلوري الأخضر (GFP). واستخدمت ثلاثة معايير للتمييز الزوج الناجح لfluorophores مع القنوات الأيونية: 1) أطياف انبعاث احتياجات fluorophoresلا تتداخل (انظر المراجع 20،21 لمزيد من التفاصيل). 2) التعبير عن بناء الموسومة يولد القناة الايونية وظيفية في الخلايا المؤتلف كما التصديق عليها من قبل وسائل الكهربية القياسية؛ و3) التعبير عن بناء تحكم تنتج قراءات الفلورسنت قوية. إذا كان أحد هذه المعايير ليست الوفاء بها، على سبيل المثال إذا كان إدخال العلامة أو fluorophore يتداخل مع وظيفة قناة، على المرء أن نعود إلى المربع رقم واحد وتعديل أي موقع الإدراج من حاتمة الخارجية و / أو الموقع الإدراج من fluorophore. ورابط من بقايا 5-الجلوتامين بين C-محطة من البروتين وfluorophore يمكن أن تساعد على تحسين وظيفة البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه قد يساعد على ادخال حاتمة الخارجية في الحلقات الكبيرة التي ليست معروفة للعب دورا حاسما في وظيفة البروتين و / البروتين بالغليكوزيل. يحتاج المرء أيضا أن يكون على بينة من الجوانب الفنية طفيفة.

نسبة نجاح transf بوساطة الحويصليةيمكن انخفض ection في TSA-201 الخلايا بعد إدخال الحواتم اثنين في كاليفورنيا الخامس α2δ1. ومن هنا يقترح إعادة تقويم كفاءة ترنسفكأيشن مع يبني الحمض النووي جديدة. يحدث هذا لأن ادراج 30 كيلو دالتون البروتين يتغير الوزن الجزيئي من الحمض النووي. يمكن للمرء أن تعديل الحمض النووي لنسبة الجسيمات الشحمية إلى 1: 2-1: 3 إذا لزم الأمر أو احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لفترة أطول من الزمن (24-72 ساعة). ومن المهم أن يتم اختيار صيغة المناسبة لpermeabilizing الخلايا. تحولت معظم الحلول المنزلية المقدرة لهذا المشروع من أن يسبب الخلايا لتجميع ويعوق تدفق عداد الكريات.

الحد من التعرض للضوء في حين تلطيخ الخلايا مع fluorophore مترافق الضد من الضروري للحد من photobleaching من وفقدان الإشارة. للحد من الخلفية الفلورسنت، فمن المهم أن أجهزة الطرد المركزي الفائض من الأجسام المضادة مترافق قبل الاستخدام. وأخيرا، فإنه من أقصى أهمية لتحليل رانه الخلايا على قياس التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن وفي موعد لا يتجاوز 24 ساعة بعد. والحفاظ على الخلايا الملون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الأرجح تقليل إشارة ويضعف بقاء الخلية. الاختلافات في مضان لا يتجزأ من الأجسام المضادة fluorophore مترافق من دفعة لدفعة تملي أن كثافة مضان من بناء الاختبار يجب أن يتم الإبلاغ كما أعربت وظيفة من كثافة مضان من بناء التحكم في ظروف تجريبية متطابقة.

لتحقيق إشارة جيدة عموما إلى نسبة الضوضاء، فمن المستحسن للحد من pipetting لخلية للحد من موت الخلايا ول resuspend بلطف الخلايا بحيث يتم حقن 3 × 10 6 خلية / مل في قياس التدفق الخلوي. حذار أن تركيز الخلية أعلى سيقلل تدفق الخلايا ويمكن أن يعوق تدفق عداد الكريات. من ناحية أخرى، فإن تركيز خلية أقل تتطلب وقتا أطول معالجة. وبالتالي قد يكون واحد لضبط تركيز تبعا للتايالمؤسسة العامة للخلايا ليتم تحليلها.

فحوصات بديلة: منهجيات إضافية المنتشرة في توثيق وجود القنوات الأيونية على سطح الخلية سقوط غشاء البلازما في أربع فئات كبيرة: 1) وسائل التصوير متحد البؤر استغلال التفاعل عالية تقارب بين الأجسام المضادة fluorophore مترافق والبروتين المستهدفة؛ 2) تقنيات البروتين الكيمياء يستريح على تعديل التساهمية من البروتين الهدف من الكواشف biotinylation. 3) تدابير الكهربية من تحليل الضوضاء غير ثابتة. و4) وضع العلامات Photoaffinity من البروتين الهدف مع تحقيقات المشعة. في حالة قناة الكالسيوم الجهد مسور، photoaffinity وضع العلامات مع معالج بالتريتيوم (±) - [3 H] PN 200-100، وكان يستخدم ليجند عالية تقارب الأسرة ديهيدروبيريدين على نطاق واسع في 1980s 31. ويبقى مقايسة حساسة للغاية ولكن ينطوي على تلاعب من المواد المشعة 31، الذي سقط من الأزياء بعد ظهورمن حساسة للغاية مضان والتلألؤ تحقيقات خاصة مع المحققين الصغار. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المستحيل لقياس النشاط القناة الايونية في وجود خصم، مثل أن العلاقة بين التعبير السطحية وظيفة خارج نطاق هذا النهج. في الطرف الآخر من التواصل التجريبية، تحليل الضوضاء غير ثابتة من القنوات الأيونية يتطلب جودة عالية التسجيلات gigaseal التصحيح، المشبك مع خط الأساس مستقرة للتسجيلات لمدة دقيقة. مع هذا النهج واحد يمكن استخراج عدد من القنوات الأيونية مفتوحة في خلية واحدة من المنحدر من الرسم بالتخطيط التباين الضوضاء بوصفها وظيفة من متوسط التيار قياس في اي وقت المحتمل 32-34. فإنه يعرض نفسه مظاهر النهج الكهربية القياسية. وهي طريقة كثيفة العمالة وانخفاض الإنتاجية التي تتطلب بالإضافة إلى معرفة جيدة مع التحليل الطيفي 32-34، وليس العنصر الرئيسي في البيولوجيا الخلوية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النوع من تحليل سياسيالصورة يحدد عدد من القنوات الأيونية النشطة (في حالة فتح) التي قد تكون مختلفة من عدد من البروتين الكلي في الغشاء. وسم البروتينات سطح الخلية مع الكواشف البيوتين هو أداة فعالة نسبيا لتحديد البروتينات الموجودة في غشاء البلازما. هذه الطريقة يستغل تعديل التساهمية للبروتينات الغشاء البيوتين ومزيد عالية تقارب وعالية الدقة وعدم التساهمية ملزم من البيوتين إلى streptavidin غشاء impermeant أو جزيئات أفيدين. هذا النهج هو موثوق بها نوعيا ولكن يعوق أو محدودة بسبب قضايا الكمي المرتبطة بانتظام مع الكشف عن البروتينات باستخدام تقنية لطخة الغربية. وتستخدم على نطاق واسع التصوير متحد البؤر ومشتقاته لتوثيق شارك في توطين بروتينات الغشاء مع سطح الخلية 35. تبقى النوعية العزلة غشاء البلازما ممكنة باستخدام التقنيات التفاضلية الطرد المركزي مع أو من دون التدرج السكروز 36. كما في التدفق الخلوي أسا المبين أعلاهذ، فإنه يعتمد على التفاعل محددة للغاية بين البروتين المستهدف والضد fluorophore مترافق. مجموع التصوير انعكاس مضان الداخلية على وجه الخصوص، هو نهج القوية التي يمكن أن يقدم تقريرا عن التوزيع والسلوك الجزيئي للقنوات ايون واحدة على سطح غشاء 37،38. قراءات هي بالتأكيد لافتة للنظر ولكن تبقى نهج حجم صغير الإنتاجية المنخفضة. كل تلك المقايسات لديها الجدارة العلمية. تدفق عالية الإنتاجية مقايسة على أساس الخلوي هو المتفوق من حيث التكاثر قراءات ومقاييس قابلة للقياس ولكنها تتطلب سهولة الوصول إلى تدفق متعدد الليزر الخلوي فارزات الخلية التي هي جزء من المرافق الأساسية في المؤسسات الكبيرة. القراء لوحة مضان القائم على أرخص وأكثر سهولة ولكن إشارة إلى نسبة الضوضاء الحصول عليها قياس مع نفس البني تحت ظروف تجريبية نفسها كان أقل من ذلك بكثير بسبب في جزء كبير منه إلى خلفية مضان أعلى. تكلفة ل-مترافق fluorophoreويمكن أيضا tibodies أن تؤخذ في الاعتبار خاصة بسبب عدد من التجارب المراقبة المناسبة التي يجب أن تتم معالجتها مع بنيات الاختبار. وتشمل الاختلافات حول نفس الموضوع تغيير الفلورسنت الضد صبغ مترافق إلى فعالية من حيث التكلفة البيروكسيديز أو الفوسفاتيز القلوية انزيم الأجسام المضادة مراسل الحصان الفجل الذي انزيم النشاط يمكن أن يعاير بواسطة التوهج 29،30.

الخاتمة: وضعت اللونين المقايسات مضان لتقدير التعبير سطح الخلية النسبي من البروتينات المؤتلف وأعرب في الخلايا المستزرعة باستخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي. وعلى الرغم من استخدام اثنين فقط من المعلمات الفلورسنت في هذا الاختبار الحالي، التدفق الخلوي غير قابلة للكشف في وقت واحد من أكثر من 30 تحقيقات الفلورسنت على خلية واحدة، مما يدل على المرونة العالية لهذا النهج. هذا الاختبار فائق الحساسية العالية الإنتاجية يمكن تكييفها للتحقيق في تأثير الطفرات الوراثية 22،26 أو modificati posttranslationalالإضافات 23، فضلا عن دراسة الملف الشخصى الدوائية للمرافقين للاتجار سطح غشاء تقنيات البروتينات 39. هو الدافع وراء هذا البروتوكول نشأت من الحاجة إلى تقييم بمعزل تأثير الطفرات الوراثية على التعبير غشاء من القنوات الأيونية في الخلايا المؤتلف. غير أنه من المهم أن نلاحظ أن شدة ضعف قناة متحولة في خطوط الخلايا النموذج لا تتطابق دائما مع شدة الأعراض السريرية في ناقلات طفرة 5 وذلك جزئيا بسبب مزيج من الطفرات في الأليلات مختلفة قد تكون هناك حاجة لتحريك القلب والموت المفاجئ 40 (41 عاما). وفي هذا السياق، يمكن اعتبار هذا الاختبار عن توفير السريع تقريب الخطوة الأولى لدراسة الطفرات واحدة أو متعددة في جين واحد يرتبط مع فقدان وظيفة من الطفرات 22. ومع ذلك فمن المعقول أن نتصور في المستقبل التعبير بوساطة فيروس من نفس البناءات في خلايا متباينة من cardiomyocyالشركة المصرية للاتصالات النسب. وبشكل عام، بالمقارنة مع تقنيات التصوير أو الانارة أخرى، وتدفق الكريات فارزات التعامل مع الخلايا الحية في تعليق وتقرير شدة مضان من سكان الخلية متجانسة. تتم هذه العملية دون الحاجة لتثبيت مع امتصاص العرق، وهي العملية التي يدفع المحلي permeabilization غشاء البلازما، حتى في ظل ظروف معتدلة 42. فحص سريع ومحددة، ومناسب مع التحليل لمدة تصل إلى عدة مئات من العينات في كل يوم عمل. بالإضافة إلى تحليل، قد يكون في نهاية المطاف فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لتقييم إمكانات وظيفية من الخلايا معربا عن مستويات أعلى أو أقل من البروتين نفسه الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics