En ny metode for kvalitativ Multi-skala analyse av bakterielle biofilmer på Trådformede soppkolonier Bruke Confocal og elektronmikroskopi

Immunology and Infection
 

Summary

Denne protokollen beskriver en ny metode for å dyrke og kvalitativt analysere bakterielle biofilmer på sopp-hyfer ved konfokal og elektronmikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miquel Guennoc, C., Rose, C., Guinnet, F., Miquel, I., Labbé, J., Deveau, A. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54771, doi:10.3791/54771 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakterielle biofilmer ofte dannes på sopp overflater og kan være involvert i en rekke bakterielle soppsamhandlingsprosesser, for eksempel metabolsk samarbeid, konkurranse eller predasjon. Studiet av biofilm er viktig i mange biologiske felt, blant annet miljø, matproduksjon, og medisin. Imidlertid er det få studier fokusert på slike bakterielle biofilmer, delvis på grunn av vanskelighetene med å undersøke dem. De fleste av de fremgangsmåter for kvalitativt og kvantitativt biofilm analyser beskrevet i litteraturen, er bare egnet for biofilm forming på-biologiske overflater eller på homogene og tynne biotiske overflater, som et monolag av epitelceller.

Mens laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM) blir ofte brukt for å analysere in situ og in vivo-biofilm, blir denne teknologien svært utfordrende når det påføres på bakterielle biofilmer på sopp hyfene, på grunn av tykkelsen og de tre dimensjonene til nettdekning hyphalOrks. For å overvinne denne mangel, har vi utviklet en protokoll som kombinerer mikroskopi med en metode for å begrense akkumuleringen av hyfene lag i soppkolonier. Ved hjelp av denne metoden, var vi i stand til å undersøke utviklingen av bakterielle biofilmer på soppens hyfer på flere skalaer som bruker både LSCM og scanning elektronmikroskopi (SEM). Denne rapporten beskriver protokollen, inkludert mikroorganisme kulturer, bakterielle biofilmdannelse forhold, biofilm flekker, og LSCM og SEM visualiseringer.

Introduction

Sopp og bakterier har mange muligheter til å samhandle med hverandre fordi de samboere i de fleste terrestriske miljøer. På grunn av deres mangfold og deres ubiquity, disse interaksjonene er viktig i mange biologiske felt, blant annet bioteknologi, landbruk, matvareindustrien, og medisin 1, 2. Molekylære interaksjoner krever en viss grad av nærhet til tillate utveksling mellom partnerne, og i noen tilfeller er det nødvendig med fysisk sammenslutning av partnerne for en funksjonell samhandling tre. En vanlig fysisk assosiasjon mellom bakterier og sopp er dannelsen av bakterielle biofilmer på soppflatene 4. Denne direkte kontakt mellom bakterieceller og sopp hyfer tillater intime interaksjoner som er involvert i forskjellige biologiske prosesser. For eksempel i medisin, studiet av biofilmdannelse av Pseudomonas aeruginosa på mulighetunistic sopp patogen Candida albicans kan gi innsikt i sammenhengen mellom biofilmdannelse og virulens 5. I landbruket studier tyder på at plantevekstfremmende rhizobacteria og BIOCONTROL bakterier har en økt effektivitet når assosiert med en sopp i en blandet biofilm. For eksempel har Bradyrhizobium elkanii forbedret N2 -fixing aktivitet når de er knyttet til Pleurotus ostreatus i et blandet biofilm 6. Til slutt, i bioremediering, bakteriell-sopp blandede biofilmer har blitt brukt til utbedring av forurensede områder 7, 8.

LSCM er spesielt egnet for å studere biofilmer, siden det muliggjør en tredimensjonal observasjon av levende hydratisert biofilmer med minst forbehandlinger, for derved å opprettholde biofilm struktur og organisering. Dermed er biofilm analyse av LSCM veldig lærerikt, spesielt til Detrøyskatt tidsforløpet av biofilmdannelse og deteksjon av karakteristiske trinn 9, 10, fra adhesjonen trinn i utviklingen av en moden biofilm. Den er også særlig innrettet til å visualisere biofilm struktur og matrise 11, 12 eller for å kvantifisere størrelsen biofilmen 13, 14. Selv om denne metoden er egnet til å studere biofilm på abiotiske eller tynne biotiske overflater, studere bakteriell biofilm på en sopptrådformede koloni er fortsatt svært utfordrende. Faktisk, de fleste trådformede sopper bygge tykke, komplekse, tridimensional nettverk i kultur. Selv om tykke gjenstander kan avbildes ved konfokal mikroskopi, dempningen av laseren penetrasjon og fluorescensemisjonen ofte redusere kvaliteten av de endelige bilder over en dybde på 50 um 15. Dessuten, fordi soppkolonier ikke er stive, it er vanskelig å håndtere mikroorganismene uten å forstyrre biofilm. På grunn av tykkelsen av prøvene, blir de få mikroskopiske analyser av bakterielle biofilmer på sopp hyfer vanligvis bare utført på en liten del av soppkolonien, inneholdt derfor bare noen få hyfene 16, 17, 18. Alt dette begrenser muligheten for å beskrive biofilm fordeling på soppkolonien og dermed kan bringe skjevheter i analysen i tilfellet med heterogen fordeling av biofilmen i løpet av soppkoloni.

For å overvinne slike vanskeligheter, rapporterer en metode for vekst og analyse av bakteriell biofilm på sopp hyfer. Denne metoden ble brukt for å studere biofilmdannelse i Pseudomonas fluorescens BBc6 på hyfer av ectomycorrhizal basidiomycet Laccaria bicolor S238N. Disse to forest-jord mikroorganismer ble beskrevet tidligere for å danne blandedebiofilm-lignende strukturer 19, 20. Denne fremgangsmåten kan lett bli ytterligere tilpasses andre filamentøse sopp / bakterielle systemer. Metoden som presenteres her, er basert på kombinasjonen av en soppkultur-metoden, noe som muliggjør vekst av meget tynne soppkolonier, med LSCM og SEM avbildning. Dette tillater oss å få mikro- (mikrometer utvalg) og meso- (mm range) skalere utsikt over samspillet mellom de to mikroorganismer, slik at for kvalitativ karakterisering av biofilm. Vi viste også at prøvene kan observeres med SEM, tillater strukturanalyse av biofilm på nanoskala (nm).

Protocol

1. Utarbeidelse av bakterier og sopp kulturer

  1. Utarbeidelse av soppkulturer
    1. Forbered cellofanmembraner med samme diameter som petriskåler og koke dem i EDTA (1 g / l i avionisert vann) i 30 minutter. Skyll ark med avionisert vann og autoklaveres dem to ganger.
    2. Forbered en sopp pre-kulturen ved inokulering sopp agar plugger på den aktuelle agar medium dekket med en EDTA forbehandlet cellofan membran. Inkuber det ved den optimale veksttemperatur for å oppnå kolonier omtrent 1 cm i diameter.
      1. For L. bicolor S238N, Inkuber ved 25 ° C i 5 dager på agar-medium Pachlewski P5, laget av 0,5 g diNH4 tartrat, 1 g KH 2 PO4, 0,5 g MgSO4 .7H 2 O, 5 g Maltose D + 20 g Glukose D +, 1 ml 10% tiamin-HCl, 1 ml av fortynnet 1/10 mikronæringsstoff-oppløsning (6 g / l jernsulfat, 0,27 g / liter molybden trioxyde, 8,45 g / l borsyre, 5 g / L mannmangansulfat; 5 g / l kuprisulfat; 2,27 g / l sinksulfat) gjøres opp til 1 liter med deionisert vann; og 20 g agar; pH 5,5.
    3. Fra sopp pre-kultur, inokulere en ny agar-plate dekket med EDTA forbehandlet cellofan membran inneholdende et lav-karbon-agar-medium for å fremme den radielle ekspansjon av koloniene.
      1. For å inokulere petriskål, forsiktig skraper det ytre område (hvor cellene har den samme fysiologiske tilstand) av en fungal koloni fra pre-kulturen med en skalpell og overføre hyfene til den nye agar plate.
      2. Inkuberes ved den optimale veksttemperatur inntil de nye kolonier er omtrent 1 cm i diameter. For L. bicolor S238N, inkubere dem ved 25 ° C i 5 dager på agar-medium P20 (0,25 g Dinh 4-tartrat, 0,5 g KH 2PO 4, 0,25 g MgSO4 .7H O 2; 1 g glukose + D ; 0,5 ml 10% tiamin-HCl, 0,5 ml fortynnet 1/10 mikronæringsløsning (jfr 1.1.2.1), gjøres opp til 1 liter med deionisert vann; og 20 g agar; pH 5,5).
        Merk: På grunn av pre-kultur på cellofan, vil den andre kulturen ikke inneholde agar media i de sentrale plugger. De agarplugger bør fjernes for videre analyse av biofilm, siden disse pluggene introdusere agar og næringsstoffer som kan skape skjevheter i analysen. Dette trinnet gjelder bare sopparter som blir holdt og formert på agarskåler, og det er ikke nødvendig for sopp som er formert fra sporer eller frossen fisk.
  2. Fremstilling av bakteriekulturer
    1. Bruke en steril løkke for å samle 2 til 3 individuelle bakteriekolonier fra en kultur på passende agarmedium og inokuler 25 ml flytende Luria-Bertani (LB) medium (eller andre egnede medier, avhengig av belastningen som brukes). For P. fluorescens BBc6, ruge en overnatting kultur ved 28 ° C med forsiktig risting (~ 150 rpm).
      Merk: Bruk en belastningmerket med fluorescerende protein, slik som GFP, er å foretrekke, fordi dette unngår å utføre en dobbel-farging (sopp og bakterier) forut for mikroskopiske observasjoner. Tidspunktet, omrøringshastigheten og temperaturen på inkubasjonen avhenger av belastningen som brukes, målet er å oppnå en kultur sen eksponensiell vekst.

2. Utarbeidelse av N In Vitro Biofilm av bakterier på Fungal Colony

  1. Sentrifuger bakteriekultur ved 5000 x g i 3 min og suspendere pelleten i 25 ml steril 0,1 M kaliumfosfatbuffer (25 g / l KH 2PO 4 og 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Gjenta denne fremgangsmåten en gang og justere den endelige bakteriekonsentrasjonen til 10 9 celler / ml med den samme buffer.
  2. Fylle et 6-brønns mikroplate med 5 ml av bakteriesuspensjonen (eller steril 0,1 M kaliumfosfatbuffer for negativ kontroll).
  3. Skjær cellofan membran av fungal kultur med en steril barberblad for å oppnå kvadratene av cellofan med en enkelt fungal koloni på hver membran. Fjern forsiktig cellofan rutene inneholder hyfer fra fast medium ved hjelp av pinsett og overføre kvadratet av cellofan inneholder hyfer til brønnene på mikro inneholder bakteriesuspensjonen.
  4. riste mikro forsiktig mens soppkolonier er fortsatt festet til cellofan; Deretter fjerner cellofan ark, forlater soppkolonier i platen.
  5. Inkuber mikroplate med forsiktig omrøring (~ 60 min) ved en temperatur som er tilpasset til de undersøkte mikroorganismer.
    Merk: inkubasjonstiden avhenger av hastigheten av etablering av biofilm og scenen som skal analyseres. For P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, inkuberes ved 20 ° C i 30 minutter for å komme tidlig stadium biofilm og opp til 16 timer for å få modne biofilm.

3. Laserskanning Konfokalmikroskopi Analyse av Biofilm Formation

  1. prøveopparbeidelse
    1. For å fjerne planktoniske bakterier og bakterier elektro-festet til hyfer, skyll soppen ved å overføre den til en ny seks-brønns mikro fylt med 5 ml av en sterk saltløsning (NaCl, 17 g / L) 17; rist i 1 min.
    2. Overfør soppen i et nytt 6-brønns mikroplate inneholdende 5 ml sterilt 0,1 M kaliumfosfatbuffer, rist i 2 min, og overføre soppen i frisk kaliumfosfatbuffer.
    3. Skjær den delen av fungal koloni som skal bli avbildet med en skalpell samtidig holder den i kaliumfosfatbuffer, slik at den oppnådde delen inneholder omtrent halvparten av soppkolonien.
    4. Å farge prøven, overføre den til en petriskål fylt med sterilt vann inneholdende et passende fluorescerende fargestoff (avhengig av målet for analysen), og inkubere det i mørket.
      1. For å visualisere sopp nettverk, bruker, for eksempel, Kongo Rød (0,1% siste concentration, 5 min inkubasjonstid), hvetekim agglutin (WGA) lectin konjugert til Alexa Fluor 633 (10 ug / ml endelig konsentrasjon, 10 min inkubasjonstid) eller FUN1 (10 pM sluttkonsentrasjon, 10 min inkubasjonstid).
      2. Hvis du bruker et ikke-fluorescerende-merket bakterie, counterstain bakterieceller med en DNA-spesifikke fluorescerende probe blant de mange celle permeant DNA fargestoffer kommersielt tilgjengelige. For eksempel bruke DAPI (0,25 pg / ml sluttkonsentrasjon, 10 min inkubasjonstid).
      3. For å visualisere matrix proteiner, bruke et protein flekken 21.
    5. Etter farging, skylling prøven ved å overføre det til en petriskål inneholdende lokk 10 ml steril 0,1 M kaliumfosfat, og rist i 1 min.
    6. Halv senk en side i en petriskål lokket og delikat bringe kutt delen til å flyte over lysbildet. Deretter sakte fjerne lysbildet fra bufferløsning, slik at prøven forsiktig bosette seg på lysbildet.
    7. Til slutt legger 10 mL av anti-falming monteringsmedium til prøven og dekke den med et dekkglass.
      Merk: Når sleiden er fremstilt, må den mikroskopiske analysen utføres så snart som mulig (innenfor høyst 30 min) for å unngå endring i biofilm-strukturen.
  2. Confocal mikroskopisk analyse
    1. Undersøk lysbildene under ett konfokal laser mikroskop med en 10X eller 40X objektiv koblet til bildebehandlingsprogrammer.
      Merk: Her, en multi-stråleskanning konfokalmikroskop utstyrt med 405, 488 og 561 nm eksitasjon lasere, en Gaasp PMT-detektor, og 10X 0,3 NA og 40X 1,2 NA målene ble brukt.
      1. Utfør bildebehandling ved hjelp av parametre tilpasset den type data forespurt og til tids begrensninger. Bruk laser eksitasjon / emisjonsbølgelengder i henhold til flekken brukt og produsentens recommendations. Bruk en kombinasjon av flis skanning og Z-stack funksjoner for å oppnå globale 3D-visning av soppkoloni og biofilm.
        Merk: Bildene på figur 3 ble anskaffet ved hjelp av følgende parametere: 8-bit / pixel, gjennomsnitt = 2, pixel dvele = 1.58 usekunder, fliser skanne på 5x5 bilder med elektronisk søm (10% dekning, terskel = 0,7); Z-trinn = 2 mikrometer.
    2. For 3D datavisualisering, bruke en av de mange gratis eller kommersielle programvare (disse tilbyr mange muligheter for 3D-rendering).
      1. For eksempel, for å vise Z-stack data som 2D maksimal intensitet projeksjoner, trekker den lyse-feltet kanal, justere lysstyrke og kontrast, og flette kanaler for å skape et sammensatt bilde. Hvis de er til stede, eliminere skiver uten signal på Z-stack ekstremiteter. Utfør deretter en 2D maksimal intensitet projeksjon og konvertere resultatet til RGB farge. Bruk "Z prosjektet" -funksjonen i ImageJ programvare 22 for å få bildene pmislikte her ved 2D maksimal intensitet projeksjoner.

4. Elektronmikros Analysis

  1. Forbered prøvene som beskrevet for LSCM, bortsett fra i trinn 3.1.2, overføre biofilmer til sterilt vann i stedet for kaliumfosfatbuffer etter at skylletrinn. Dette unngår dannelse av saltkrystaller under dehydratiseringstrinnet, noe som ville forstyrre SEM avbildning.
  2. Overfør biofilm til en prøveholder og fjerne overflødig vann; bare tillate en liten hinne av vann til å dekke prøven.
  3. Overføre prøven til kammeret av en variabel trykk scanning elektronmikroskop (SEM-VP); fryse den til -50 ° C på et Peltier-kjøletrinn; og la den sakte fryse-tørt, direkte i SEM kammer, med 100 Pa for variabelt trykk satt i 15 timer.
  4. Etter fullføring av frysetørking, hente prøven og overføre den til en høy-vakuum-filmavsetning system. Coat prøven med 2 nm fra Platinum (kvarts måling) under argon plasma (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA).
  5. Observer belagt prøven med en SEM utstyrt med et felt utslipp pistol (FEG) med høy oppløsning "i objektivet" detektor og en elektronisk høy spenning på 1 kV.

Representative Results

Den generelle skjematiske Måten fra soppkulturen og biofilm fremstilling er gitt i figur 1. Kulturen metoden mulig for oss å få soppkolonier 20 til 50 mikrometer tykk som inneholder et par lag med hyfer, slik at mikro- og meso-skala analyser av hydrert levende biofilm ved hjelp LSCM. Anvendelsen av metoden tillatt oppkjøpet av høy kvalitet bilder av P. fluorescens BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer langs dannelsen av biofilm (figur 2 - 4).

Meso-skala analyse av biofilm viste heterogen fordeling av biofilm fra P. fluorescens BBc6 på hyfene av L. bicolor S238N (figurene 2 og 3). Meso-skala analyse også tillatt for sporing av biofilmdannelse over tid (figur3) fra de tidlige trinn, der bare noen bakterier var festet til hyfer (figur 3a), til dannelse av et tykt, mature biofilm (figur 3b). Den høye oppløsning av meso-skala bilder tillatt oss å utføre mikroskala-analyse på samme bilder for å oppnå de koloni arkitekturer (figur 3c - d).

Mikro-skala analyse kombinert med spesifikk merking aktivert oss å gå et skritt videre i biofilm karakterisering. Her, SYPRO Ruby 23, hvilke etiketter de fleste klasser av proteiner, ble påført på prøvene (figur 4), og viser tilstedeværelse av proteiner i matrisen.

Til slutt ble ytterligere detaljer om biofilm struktur oppnås ved SEM avbildning av den samme prøven etter dehydrering og belegg (figur 5). SEM bildebehandling forutsattadgang til nanoskala nivå, og dermed gi tilgang til den grunnmassestruktur.

Figur 1
Figur 1: Samlet skjematisk prosedyre av soppkultur og biofilm forberedelse. Dette tallet beskriver hovedtrinnene i fremgangsmåten, fra mikroorganismekulturer for å prøve analyser. Flere detaljer er gitt i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: BBc6 biofilm partisjonere på soppkoloni. Prøven ble fotografert etter 18 timer for interaksjonen ved 10X forstørrelse. Bildet ble innhentet via 2D maksimal intensitet projeksjon av 3D konfokalmikroskopi bilder. Den grå rutenett på Figure viser mosaikk stillinger. L. bicolor hyfer er farget med Congo Red (rød) og bakterier er GFP-merket (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Tidlig og sene stadier av BBc6 biofilmdannelse på L. bicolor hyfer. Dette bildet ble innhentet via 2D maksimal intensitet projeksjon av 3D konfokalmikroskopi bilder. Imaging ble utført ved 40X forstørrelse. (A) biofilmer partisjonere etter 2 timer for interaksjon. (B) Biofilm partisjonere etter 14 timer for interaksjon. (C) Utvidelse av den hvite rektangelet i (a). (D) Utvidelsen av det hvite rektangelet i (b). Fungal hyfer er farget med Congo Red (rød) og bakterier er GFP-tagged (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Matrix farging av BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer. (A) biofilmer etter 16 timer for interaksjon. (B) Utvidelse av hvite rektangelet i (a). Imaging ble utført ved 40X forstørrelse, og disse bildene ble innhentet via 2D maksimal intensitet projeksjon av 3D konfokalmikroskopi bilder. Bakterier er GFP-merket (grønn), er sopp farget med Fun1 (mørk grønn), og proteiner er farget med S. Ruby (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5: SEM avbildning av BBc6 biofilm på L. bicolor hyfer. SEM Imaging ble utført ved 2360X, EHT: 1kV. Før avbildning, prøven ble langsomt frysetørket i SEM kammeret og belagt med platina. Grønne pilene peker på bakterielle biofilmer og gule piler peker sopp hyfer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bakterielle biofilmer hentes i mange miljøer og er blitt studert siden 1950-tallet, som fører til utvikling av en rekke metoder for å analysere dem 24. Klassiske metoder for å kvantifisere og overvåke biofilm inkluderer mikro-titer analyser og, den mest brukte metoden, krystallfiolett (CV) farging. Disse metodene er rask, billig og lett å håndtere 25 og er spesielt nyttig for kvantifisering av total biofilm biomasse eller for å utføre levedyktighet og matrise kvantifisering analyser. På en annen side, "omics" metoder er også nyttige i biofilm studier, slik at for kvantitative og funksjonelle analyser av biofilmer 26, 27. Til tross for fordelene med mikro-titer plate og "omics" metoder, kan flere viktige funksjoner i biofilmer ikke fanges med disse teknikkene, hindrer en fullstendig forståelse av denne prosessen. Slike funksjoner inkluderer matrisestrukturs, bakterielle koloni arkitekturer, celle / celleinteraksjoner og kolonisering mønstre, som er viktige data for å forstå både funksjon av biofilm og dynamikken i deres dannelse. Til tross for kapasiteten til mikroskopi for å fange opp disse funksjonene, mikroskopi analyse av bakterielle biofilmer på trådformede sopp er fortsatt mangelvare. Dette er hovedsakelig på grunn av vekst av filamentøse sopp, som ofte danner kolonier av tykke, kompleks, tredimensjonalt nettverk. Dannelse av bakterielle biofilmer på sopp er vanlig i ulike miljøer og er betydelig involvert i ulike felt 4 (for eksempel medisin, landbruk og miljø.); derfor er det viktig å utvikle nye metoder for å lette deres undersøkelse. For å oppnå dette kombinert vi en fremgangsmåte for å generere svært tynne soppkolonier med mikroskopisk avbildning av de bakterielle biofilmer. I tillegg foreslo vi et sett med mikroskopi verktøy til kvalitativt analysere disse biofilm. Suksessen til metoden er avhengigevnen til å fremstille meget tynne hyphal kolonier og for å anvende de passende fargestoffer. Disse punktene er omtalt nedenfor.

På grunn av de komplekse strukturene i biofilmer, forstå deres funksjon krever en multi-skala tilnærming 28, 29. Distribusjon mønstre av biofilm, bakteriekoloni arkitektur, og matrise struktur og sammensetning er analysert på ulike skalaer (dvs. meso-skala og mikro-skala). Videre tillater nanoskala oppløsning tilgang til celle / celle fysiske interaksjoner og nano-struktur av matrisen. Således muliggjør den utviklede fremgangsmåten lett en multi-skala analyse av de bakterielle biofilmer dannet på soppkolonien.

I de fleste studiene, analyser LSCM av biofilm er begrenset til den mikroskala, meso-skala vanligvis blir utført ved hjelp av optisk koherens tomografi 30, 31, (figur 3). Dermed spørsmål knyttet til samlet data samlet inn på ulike skalaer med forskjellige metoder er her unngås.

Denne kombinasjonen av analysene ga tilgang samtidig til biofilmen partisjonere på soppkolonien, den bakterielle koloni arkitekturen langs fremkallings biofilm, og det grunnmassestruktur. Meso-skala-analyse viste en heterogen fordeling av de bakterielle biofilmer på soppkolonier (figurene 2 og 3). Denne observasjonen ville ikke ha vært mulig med protokoller som bare tillater avbildning av en liten del av fungal koloni, som ikke nødvendigvis er representative for hele kolonien. Således, mensofte neglisjert, meso-skala analyse kan gi verdifull informasjon om biofilm distribusjonsmønstre.

Endelig kan den utviklede fremgangsmåten brukes til å analysere prøver med forskjellige mikroskopi teknikker, inkludert scanning elektronmikroskopi. Her SEM ble brukt for å nå nano-skala og for å få bakteriell romlige organiseringen i biofilm. Det utføres meget godt med de tynne soppkoloniene, mens SEM bare tillatt overflate imaging. I motsetning til LSCM, SEM, er imidlertid nødvendig prøven dehydrering og, som oftest, belegging med et ledende metall. Denne dehydrering prosessen kan endre biologiske strukturer når det ikke er riktig utført, og kan kreve optimalisering. Her ble prøven dehydrering ved hjelp av treg frysetørking brukt 33. Likevel vil anvende både LSCM og SEM til prøvene tillate utførelsen av korrelerende mikroskopi på samme sted av prøven.

Til tross for fordelenebeskrevet ovenfor, eksisterer noen begrensninger. For det første kan det ikke være aktuelt å sopp alle slag. Faktisk er denne dyrking metode utviklet for fungi sprer seg radialt på overflaten av faste medier. Denne metoden kan ikke være egnet for sopp som danner hovedsakelig lufthyfer (f.eks, Fusarium sp.) Eller for mikro-aerobisk fungi spredning hovedsakelig inne agar. Videre kan sopp nedverdigende cellofan være problematisk også (f.eks., Trichoderma sp.). For det andre er det viktig å merke seg at fargingen strategien er et kritisk punkt og valget av flekken må gjøres forsiktig, som flekken ikke må forstyrre den biofilm. For eksempel, la vi merke til at Calcofluor Hvit forårsaket delvis biofilm avbrudd (data ikke vist), sannsynligvis på grunn av den høye pH-verdien i denne flekken. Også noen fargestoffer produsert uensartet farging (f.eks., Congo Red), mens andre frem homogen farging (f.eks., Cellevegg farging med WGA-lektin), som gir et heterogent bildekvalitet.Videre er det viktig å være oppmerksom på at enkelte fargestoffer som ikke kan være fullt ut bestemt. For eksempel WGA flekker ikke bare soppens cellevegger, men også N-acetylneuraminsyre i gram-positive bakteriecellevegger og adhesinene produsert av gram-positive og -negative bakterier i løpet av biofilmdannelse 34, 35. Derfor bruker fluorescerende protein-merket bakterier og / eller sopp anbefales å unngå flere flekker. Hvis flere fargestoffer brukes, må de ikke er kjemisk forstyrre, og deres emisjonsspektra bør ikke overlapper hverandre.

Meso-skala-analyser krever en stor skannede området, og derfor kan LSCM være tidkrevende (40 min til 1 time, avhengig av prøvens tykkelse) og flaskehals analyse av et stort antall prøver. Ikke desto mindre, kan justeringer gjøres avhengig av hvilken type data som kreves. Det er mulig å redusere innhentingstiden og bildestørrelsen ved å endre bildekvaliteten. For eksempel, høyoppløseliger det ikke nødvendig å analysere biofilmen generelle partisjonere.

Endelig noen begrensninger må vurderes når du velger å vise Z- stabelen data som 2D eller 3D anslag. Todimensjonale anslagene er en god måte å oppsummere data, men dybde informasjon går tapt, og overlappende strukturer blir skjult. På den annen side, 3D-projeksjoner tillater visualisering fra ulike synsvinkler, men de ofte gjør det dårlig i tilfelle av romlig kompleksitet.

Som konklusjon, har vi rapportert en metode for karakterisering av bakterielle biofilmer på hyfene på det strukturelle nivå. Metoden kan utvides til andre applikasjoner. Faktisk, gir denne metoden ytelsen funksjonell eller kjemisk karakterisering av bakterielle biofilmer forming på sopp hyfer. På grunn av den store variasjonen av eksisterende fluorescerende reporter-systemer, kan brukes LSCM analyse for flere formål 29. For eksempel, fluorescensen microscopy kan brukes til å overvåke pH-gradient 36 eller molekyl diffusjon i biofilmer 37. I tillegg gir fremgangsmåten for samfunnet analyse i flerbestands biofilmer. For eksempel, fluorescens in situ hybridisering rettet mot spesifikke bakteriegrupper er spesielt nyttig for å studere bestemte bakterie partisjonere i flerbestands biofilmer 38, 39. Siste, mange fluorescerende fargestoffer kan anvendes for å karakterisere matrisen sammensetningen av biofilm 21. Her, proteiner ble rettet ved hjelp av Sypro, som flekker et stort utvalg av proteiner, blant dem matriksproteiner (figur 4), men også andre fargestoffer tillate visualisering av andre viktige matrise bestanddeler, slik som exopolysaccharides eller ekstracellulært DNA. Interessant, kan alle disse analysene utføres på meso-skala ved hjelp av den beskrevne metoden. Siden LSCM kan utføres på levende prøver,Det er også mulig å oppnå time-lapse avbildning ved hjelp av, for eksempel, coverwell kamre, spesielt egnet for tynne soppkolonier. Dette alternativet er spesielt interessant, da biofilmdannelse er en kompleks, dynamisk prosess. Til slutt, for en kvantitativ formål, kan den rapporterte metoden forbedre nøyaktigheten av automatiske kvantitativ analyse ved å gjøre denne kvantifisering mulig på meso-skala bilder. Dette kan overvinne biofilm heterogenitet og statistiske spørsmål 29.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well Falcon Tissue Culture Plates Fisher Scientific 08-772-33 Used in 2.2 & 3.1
Congo Red Fisher Scientific C580-25 Used in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain Thermo Fisher Scientific F7030 Used in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 Used in 3.1.4.1
DAPI solution Thermo Fisher Scientific 62248 Used in 3.1.4.2
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 Used in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain Thermo Fisher Scientific F10318 Used in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Used in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1 Zeiss Used in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software  Zeiss Used in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 Leica Used in 4
GeminiSEM-FEG Zeiss Used in 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75, (4), 583-609 (2011).
  2. Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
  3. Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, (34), 14558-14563 (2009).
  4. Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
  5. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296, (5576), 2229-2232 (2002).
  6. Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29, (3), 293-296 (2004).
  7. Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. 739-743 (2008).
  8. Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00, (0), 1-10 (2014).
  9. Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71, (11), 7301-7309 (2005).
  10. Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94, (1), 149-156 (2010).
  11. Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8, (9), 623-633 (2010).
  12. Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244 (2012).
  13. Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28, (1), 1-5 (2014).
  14. Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
  15. Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6, (12), 1399-1437 (2011).
  16. Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
  17. Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6, (10), (2011).
  18. Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. (2014).
  19. Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176, (1), 22-36 (2007).
  20. Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2, (4), 560-568 (2010).
  21. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
  22. Rasband, W. S. imagej. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  23. Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2, (5), 486-498 (2002).
  24. Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25, (1), 31-42 (2013).
  25. Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  26. Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31, (4), 477-485 (2009).
  27. Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10, (9), 4105-4119 (2011).
  28. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8, (3), 203-208 (2009).
  29. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23, (4), 233-242 (2015).
  30. Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11, (3), 34001 (2006).
  31. Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47, (7), 2531-2542 (2013).
  32. Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47, (6), 2085-2095 (2013).
  33. Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34, (1), 26-36 (2012).
  34. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, (1), 1-4 (2007).
  35. Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3, (4), 1-45 (2015).
  36. Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  37. Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (6), 3349-3358 (2012).
  38. Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6, (3), (2011).
  39. Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, (8), 2603-2611 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics