Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Biology

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Summary

Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

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Abstract

La microscopie à fluorescence permet la visualisation directe de biomolécules spécifiques dans les cellules. Cependant, pour la microscopie par fluorescence classique, la résolution spatiale est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image et> 500 nm le long de l'axe optique. Par conséquent, la microscopie par fluorescence a longtemps été sévèrement limité à l'observation des caractéristiques ultrastructurales dans les cellules. Le développement récent des méthodes de microscopie super-résolution a surmonté cette limitation. En particulier, l'avènement de fluorophores photoswitchable permet de super résolution microscopie à base de localisation, ce qui fournit un pouvoir de résolution approcher l'échelle moléculaire longueur. Ici, nous décrivons l'application d'une méthode ultra tridimensionnelle résolution microscopie basée sur une seule molécule microscopie localisation et interférométrie polyphasique, appelé interférométrique photoactive Localisation Microscopie (iPALM). Cette méthode offre une résolution quasi isotrope sur laordre de 20 nm dans les trois dimensions. Des protocoles pour la visualisation du cytosquelette d'actine filamenteuse, y compris la préparation des échantillons et le fonctionnement de l'instrument iPALM, sont décrits ici. Ces protocoles sont également facilement adaptable et instructif pour l'étude d'autres caractéristiques ultrastructurales dans les cellules.

Introduction

La visualisation des structures cellulaires complexes depuis longtemps partie intégrante de connaissances biologiques et de découverte. Bien que la microscopie de fluorescence peut imager des cellules ayant une spécificité moléculaire élevée, son pouvoir de résolution est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image (x, y ou dimension latérale), et> 500 nm le long de l'axe optique (z, ou dimension axiale) 1,2. Par conséquent, l'observation des caractéristiques ultrastructurales ont toujours été limitées à la microscopie électronique (EM). Heureusement, le développement récent de nanoscope a contourné cette limite, ce qui permet une résolution spatiale dans le 10 - gamme de 100 nm 1-6. En particulier, super résolution approches basées sur la localisation unique molécule, connue par des acronymes tels que PALM (photoactive Localisation Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence photoactive Localisation Microscopy) 5 (d) STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topographie) 8, GSDIM (État sol Depletion Microscopie suivi par retour moléculaire individuel) 9, ou SMACM (Single-Molecule Active-contrôle Microscopy) 10, ainsi que leurs (3D) implémentations 3 dimensions, telles que PALM interférométrique (iPALM) 11 ou 3D-STORM 12, ont été précieux pour révéler de nouvelles perspectives dans l'organisation à l' échelle nanométrique de nombreuses structures biologiques, y compris les axones neuronaux et synapses 13, adhérences focales 14,15, jonctions cellule-cellule 16, les pores nucléaires 17 et centrosomes 18-20, pour ne citer que quelques - uns.

Une autre caractéristique ultrastructural dans les cellules pour lesquelles nanoscope est potentiellement utile est le cytosquelette d'actine. Le maillage complexe de filamenteuse (f) actine dans le cortex cellulaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la forme cellulaire et les propriétés mécaniques 21. L'organisation of f-actine est active et dynamique régulée si de nombreuses protéines régulatrices qui influencent fortement la polymérisation, la réticulation, le chiffre d' affaires, la stabilité et la topologie du réseau 22. Cependant, bien que la caractérisation de l'architecture meshwork f-actine est important pour des idées mécanistes dans un large éventail de processus cellulaires, la petite taille (~ 8 nm) des filaments f-actine entrave leur observation par microscopie optique conventionnelle limitée par la diffraction; ainsi, la visualisation de structure fine actine a jusqu'à présent été exclusivement réalisé par EM. Ici, nous décrivons les protocoles pour visualiser le cytosquelette d'actine F dans les cellules de mammifères adhérentes, en utilisant la technique de microscopie super résolution iPALM pour tirer parti de sa capacité de très haute précision en 3D 11,23. Bien que l'instrument iPALM est hautement spécialisée, des instructions sur la mise en place d' un tel instrument a été récemment décrit 23, alors que l' accès au microscope iPALM hébergé par le Hopupille Hughes Medical Institute a également été mis à la disposition de la communauté scientifique à un coût minime. En outre, les méthodes de préparation des échantillons décrits ici sont directement applicables à d' autres approches 3D super - résolution, tels que ceux basés sur défocalisation astigmate de la fonction d'étalement de point (PSF) 12 ou bi-plan de détection 24, qui sont plus largement disponibles.

Nous notons qu'un ingrédient nécessaire pour la microscopie de super - résolution basée sur la localisation unique de molécule en général est le fluorophore photoswitchable 25, qui permet aux trois exigences critiques pour la microscopie super - résolution basée sur la localisation unique de molécule à être remplies: i) élevé seule molécule luminosité et le contraste par rapport aux signaux d'arrière-plan; ii) la distribution clairsemée de molécules simples dans une trame d'image donnée; et iii) de haute densité spatiale d'étiquetage suffisant pour capturer le profil de la structure sous-jacente (également connue sous le nom de Nyquist-Shacritère d'échantillonnage nLes) 26. Ainsi, pour obtenir des résultats satisfaisants, l'accent doit être mis aussi à la fois sur la bonne préparation des échantillons pour optimiser fluorophore photocommutation et de préserver l'ultrastructure sous-jacent, ainsi que sur les instruments et d'acquisition aspects des expériences.

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Protocol

1. Préparation des échantillons d'imagerie

  1. Comme les signaux de fluorescence de fond interfèrent avec la fluorescence des étiquettes fluorophores, nettoyer les couvre - objets d'abord les rincer dans de l'eau déminéralisée (ddH 2 O), puis les séchage à l' air à l'air comprimé. Par la suite, effectuer une gravure par plasma dans un nettoyeur à plasma pendant 15 secondes, ou plus si nécessaire.
  2. Pour activer la correction de la dérive et de l'étalonnage iPALM, utilisez # 1.5 ronde (diamètre 22 mm) couvre-objets préalablement nettoyées embarqués avec des nanoparticules fluorescentes comme points repères qui servent fiducials comme hautement photostables pour l'étalonnage fiable et correction de la dérive. En raison du long temps d'acquisition requise pour accumuler la densité fluorophore suffisante (> 15 - 30 min), la dérive de l'échantillon est inévitable.
  3. Placez chaque lamelle fiducialed dans une plaque de culture de tissus à 6 puits. Stériliser par rayonnement ultraviolet (UV) dans une hotte à flux laminaire pendant 15 min.
  4. Dans une hotte à flux laminaire stérile, préparer fibronectine solution pour le revêtement coverglass en diluant 1 mg ml solution mère / fibronectine dans un tampon phosphate stérile une solution saline de Dulbecco (DPBS) à une concentration finale 2-10 ug / ml. Rincer chaque lamelle trois fois avec du DPBS et incuber avec 2 ml de la solution de fibronectine pendant une nuit à 4 ° C. Par la suite, aspirez la solution de fibronectine et rincer une fois avec DPBS.
  5. Rincer les cellules brièvement avec DPBS. Incuber avec 1 - 2 ml de trypsine pendant quelques minutes à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent et étancher avec ~ 10 ml de milieu de culture cellulaire contenant du sérum frais. Par exemple, pour les cellules humaines ombilicales veine endothéliales (HUVEC), utiliser un grand milieu de culture navire endothéliale complétée avec de grands facteurs navire endothéliales et de la pénicilline ou la streptomycine.
    1. Réensemencement les cellules sur la lamelle de fibronectine (pour la densité clairsemée, plaque <50.000 cellules par lamelle) et maintenir la culture dans un incubateur réglé à 95% d' humidité, 5% de CO 2, et 37 & #176; C.
  6. Pour une bonne conservation des structures fines du cytosquelette f-actine, utiliser des solutions tampons en fonction des réactifs tampons de bonnes 27.
    1. Par exemple, préparer un tampon de MEHP comme solution 2x mère (PIPES 120 mM, HEPES 50 mM , EGTA 20, 4 mM de MgCl2, pH 7,0 avec KOH) en dissolvant 6,5 g d'HEPES, 3,8 g d'EGTA et 190 mg de MgCl 2 dans ~ 300 ml d'ddH 2 O, avec le pH ajusté à 7,0 par addition goutte à goutte d' une solution de KOH concentrée; puis ajouter ddH 2 O pour amener le volume à 500 ml. Stériliser le tampon en utilisant un filtre de 0,22 um, le stocker à 4 ° C, et diluer 1: 1 avec ddH 2 O avant utilisation.
  7. Pour obtenir les meilleurs résultats avec un étiquetage de haute densité de la F-actine, on utilise la phalloïdine conjuguée avec des fluorophores organiques, tels que Alexa Fluor 647. Au point de temps souhaité après réensemencement des cellules, fixer les cellules comme suit:
    1. Aspirer les médias de chaque puits de culture contenant le CEspécimen ll. Doucement mais passer rapidement de 2 ml d'eau tiède (37 ° C), des fixateurs d'extraction contenant 0,25% de glutaraldéhyde dans un tampon de MEHP avec 0,25% de Triton X-100. Incuber à température ambiante pendant 1 - 2 min. Pour les étapes suivantes, en utilisant 2 ml de fixatif ou d'un tampon de trempe par lamelle, sauf indication contraire.
    2. Remplacer le fixateur d'extraction avec un glutaraldéhyde fixateur de 2,5% dans un tampon MEHP et laisser les échantillons incuber pendant 10-12 min. Ceci et les étapes suivantes sont toutes réalisées à température ambiante.
    3. Aspirer les fixateurs et doucement les remplacer avec un tampon de MEHP. Tilt et agiter doucement, puis lavez à nouveau avec MEHP. Répéter deux fois.
    4. Pour étancher l' autofluorescence de glutaraldéhyde, ce qui peut submerger les signaux provenant des fluorophores souhaités, incuber les échantillons avec un tampon de trempe fraîchement préparée contenant du NaBH 4 à une concentration massique de 0,1% dans les MEHP. bulles profuses seront observées. appuyez sur le plat à l'occasion de l'échantillon doucement pour Dislodge les bulles. Laisser incuber pendant 5 - 10 min.
    5. Aspirer le tampon de trempe et doucement le remplacer avec un tampon de MEHP. Rincez plusieurs fois pour enlever les bulles. Pipette dans 2 ml de MEHP tampon et laisser incuber dans l'obscurité pendant 5 min. Répéter deux fois et laisser l'échantillon reste dans un tampon MEHP lorsque vous avez terminé.
    6. Préparer une chambre d'humidité pour phalloïdine incubation en utilisant une grande boîte de Pétri en plastique rembourrée avec un morceau de serviette en papier généreusement humidifié avec 5 - 10 ml de ddH 2 O. Placez une grande feuille de Parafilm propre sur le dessus de la serviette en papier humide.
    7. En raison du coût relativement élevé de phalloïdine marquée, utilisez un petit volume pour chaque étiquetage. Pour l'étiquetage de haute densité, commencer avec une concentration de 0,3 uM. Préparer ~ 60 pi par lamelle en utilisant phalloïdine-Alexa Fluor 647 dans un tampon MEHP.
    8. Introduire à la pipette 55 - 60 ul de la solution de phalloïdine sur la feuille de Parafilm dans la chambre d'humidité. En utilisant des pinces fines, retirez délicatement le coverg spécimenfille. Veillez à noter le visage contenant des cellules correctes.
    9. appuyez rapidement et doucement l'excès de tampon en touchant le bord de la lamelle avec un morceau de papier plié absorbant délicat, puis placer le côté de la cellule coverglass vers le bas sur la goutte de solution de phalloïdine sur le Parafilm. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles piégées par la lamelle.
    10. Placez le couvercle sur la chambre d'humidité. Enveloppez la chambre dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière ambiante, et de laisser l'échantillon incuber une nuit à 4 ° C. L'échantillon peut être conservé dans cet état pendant plusieurs jours. Assurez-vous que la chambre d'humidité reste humide si le stockage à long est prévu.
  8. Avant imagerie, placez doucement le côté de la cellule coverglass vers le haut sur une nouvelle plaque de 6 puits contenant 2 ml de tampon de MEHP par puits.
  9. Préparation des tampons d'imagerie à base de thiol de l'oxygène en utilisant les balayé les solutions mères suivantes: 1 M de glucose, 1 M cystéamine et 100x glucose oxydase / catalase mixte de l'enzymeure (4 mg de catalase et 10 mg de glucose oxydase dans 100 ul de tampon de MEHP, bien mélangés par tourbillonnement 28). Juste avant l'imagerie, mélanger 75 pi de 1 M solution de glucose, 30 pi de solution 1 M de cystéamine et 3 pl de 100x mélange stock enzyme. Réglez le volume à 300 pi avec un tampon de MEHP et utiliser immédiatement après le mélange pour monter l'échantillon.
  10. Pour iPALM, préparer l'échantillon d'imagerie utilisant un pré-nettoyé # 1.5 coverglass (diamètre 22 mm).
    1. Vous pouvez également utiliser une lame de verre (3 "x 1") avec un adhésif double face entretoise à l' aide dans l'ensemble si elle est basée astigmatisme-3D-STORM 12 doit être utilisé à la place.
    2. Pour assembler l'échantillon d'imagerie, utilisez une pince fine pour enlever délicatement la lamelle d'échantillon du puits de tampon. Puis, rapidement et doucement tapoter l'excès de tampon en touchant le bord de la lamelle avec du papier absorbant plié.
    3. Placez le côté de la cellule de lamelle orientée vers le haut sur un morceau de papier de verre propre. Rincer l'échantillonen plaçant 30 - 50 pi de tampon d'imagerie sur l'échantillon, et enlever l'excès de tampon en inclinant et en tapotant avec du papier absorbant plié.
    4. Répétez l'étape de rinçage à quelques reprises, puis placer 30 - 50 pi de tampon d'imagerie sur l'échantillon. Séchez le bord de la lamelle et placez plusieurs très petits points d'époxy à durcissement rapide sur la zone sèche.
    5. Abaissez lentement une autre pré-nettoyée # 1.5 lamelle (lamelle rond, diamètre brut, 18 mm) sur le centre de la 22-mm coverglass contenant des cellules. Laisser le tampon d'imagerie mouille les deux couvre-objets par capillarité. Les petits points d'époxy à durcissement rapide doivent respecter les deux couvre-objets.
    6. Appuyez doucement sur l'échantillon assemblé à l'aide de papier absorbant plié pour répartir la pression uniformément. Utiliser une pression suffisante pour que l'échantillon de cellules minces et même (<15 pm), mais pas autant que pour écraser les cellules. Jauge l'épaisseur correcte en observant des anneaux de motif de Newton. Aussi, assurez-vous d'effectuer cette step doucement pour minimiser les bulles d'air. Si nécessaire, pratiquer avec couvre-objets vides plusieurs fois au préalable.
  11. Sceller l'échantillon avec fondu Vaseline-lanoline paraffine (valap, Stock préparé à partir de 100 g chacune de gelée de pétrole, la lanoline, et de la paraffine, fondus ensemble) 29, rincer l'échantillon scellé avec ddH 2 O, et sécher à l' air comprimé. L'échantillon est maintenant prêt à être monté sur le microscope pour l'imagerie.

2. Placement de l'échantillon et l'alignement iPALM

  1. Déplacer la lentille d'objectif supérieure d'un ressort vers le haut pour permettre le retrait du porte-échantillon. Placer l'échantillon scellé préparés à l'étape 1.10 sur le porte-échantillon et le fixer avec plusieurs petits aimants de terres rares. Appliquer de l'huile d'immersion des deux côtés de l'échantillon de formation d'image. Placez le porte-échantillon de nouveau dans le chemin optique et abaissez doucement la lentille supérieure objectif.
  2. Allumez les lasers d'excitation. Allumez le périphérique Electron Multipliant Charge-Coupled (EMCCD) appareil photo en mode de transfert de trame.
    1. Faire pivoter les filtres d'émission appropriés. Activer un obturateur mécanique pour bloquer le trajet du faisceau haut (figure 1A) et d' ouvrir le trajet du faisceau inférieur. Apportez l'objectif de fond au point par translation par petits incréments à l'aide de l'actionneur piézo-électrique.
    2. Une fois que le fiducial est mis au point, ouvrir le chemin de poutre supérieure tout en bloquant la trajectoire du faisceau de fond et porter l'objectif haut dans le foyer d'une manière similaire. Surveiller la largeur de la mire sur l'écran d'ordinateur pour la mise au point optimale.
  3. Pour centration appropriée, ouvert à la fois le haut et les chemins de faisceau bas. Ajustez manuellement la lentille objectif prioritaire tandis que l'objectif de fond est maintenue constante à l'aide d'une paire de micro-fine les vis de réglage, jusqu'à ce que les images repères se chevauchent aussi étroitement que possible, idéalement au sein d'un pixel.
    1. Par la suite, effectuer des réglages fins pour que les images repères dans l'étape 2.3 chevauchement au sein d'un dixième de pixel EMCCD. Réglez le hautmiroirs piézoélectriques montés 2 axes via le logiciel de contrôle tout en maintenant les deux lentilles de l'objectif et la réflexion de fond miroirs constant. Comparez les centres des mires de haut et les vues de dessous objectives via l'écran d'ordinateur pour guider le processus.

3. Calibrage de la configuration iPALM

NOTE: Depuis l' émission de fluorescence est incohérente, d'interférence à observer dans iPALM, le chemin longueurs par le haut et les objectifs de fond doit être proche de l'autre, à quelques microns. Ceci peut être réalisé comme suit:

  1. Avec les lasers sur les caméras flux continu, et les deux trajectoires de rayon supérieur et inférieur ouvert, faire osciller le porte-échantillon z piézoélectrique en utilisant une forme d'onde de tension sinusoïdale générée par le logiciel de commande pour une oscillation continue de l'axe z sur une amplitude de 400 nm, .
  2. En profitant du fait que, lors de l'alignement optimal, l'intensité de repère varie peu avec le til oscillation, traduire manuellement l'ensemble de diviseur de faisceau motorisé vers le haut ou vers le bas jusqu'à ce que l'intensité des repères oscille en raison de l'effet désiré d'interférence à photon unique. Cela signifie la concordance étroite des longueurs de trajet optique. Un rapport de pic à vallée> 10 peut être réalisé dans le meilleur des cas (figure 1D).
  3. Pour veiller à ce que l'amplitude et la phase à chaque surface sont aussi uniforme que possible à travers le champ, régler le miroir de fond de l'ensemble de diviseur de faisceau en petites étapes pour affiner l'écart et les angles d'inclinaison. Effectuer diviseur de faisceau alignement fin en traduisant l'échantillon dans 8 nm z étapes de plus de 800 nm.
    1. Surveiller l'intensité fiducial entre les caméras n ° 1 - 3. Réglez la hauteur, la position, et l'inclinaison du miroir de fond dans l'ensemble de diviseur de faisceau en petites étapes, de telle sorte que la phase d'oscillation de la caméra # 1 par rapport à la caméra n ° 2 est maximisée, idéalement à 120 ° (figure 1B-D).
    2. Une fois que le premieralignement est terminé, traduire l'échantillon à analyser pour un champ de vision approprié qui contient les deux cellules à l'image et plusieurs mires à proximité. Placez une enceinte autour du système pour bloquer la lumière parasite et les perturbations ambiantes. Une fois que la zone d'imagerie est trouvé, effectuer la procédure à l'étape 3.4 à nouveau, et enregistrer la courbe d'étalonnage pour une utilisation dans z coordonnées suivantes extractions en utilisant la commande "Acquisition d'étalonnage Scans vs Piezo Sample Position" dans l'interface principale.

4. Acquisition de données

  1. Une fois qu'une zone souhaitée est trouvée et la courbe d'étalonnage est obtenue, entrez les noms de fichiers appropriés dans le logiciel. Ouvrez le dessus et les chemins de faisceau bas. Augmenter la puissance d'excitation du laser à 642 nm au maximum. Pour Alexa Fluor 647, une période initiale de mise hors fluorophore peut être nécessaire (figure 2A).
    1. Expose avec une excitation constante 642 nm pendant 5 minutes, ou plus si nécessaire, jusqu'à ce que simolécule ngle clignotante est observée (figure 2B). Le logiciel permet une augmentation automatique de 405-nm photo activation au cours de l'acquisition. Un grand nombre de cadres d'acquisition sont généralement nécessaires pour les fonctions filamenteuses d'être clairement visible (> 50.000 cadres). Lorsque vous êtes prêt, commencer l'acquisition d'ensembles d'images brutes en utilisant la commande "Start iPALM Acquisition" dans l'interface principale.
  2. Lors de l'acquisition, réglez le niveau de photoactivation en ajustant l'intensité du laser de 405 nm pour maintenir la densité clignotante appropriée au besoin (voir les exemples dans la figure 2B).
    NOTE: Une fois que l'acquisition est terminée, le logiciel convertit automatiquement les fichiers d'image dans le format binaire approprié. Le référentiel de données dans le serveur de calcul est monté en tant que lecteur réseau, ce qui permet aux données d'être copiées directement là pour un traitement ultérieur.

5. Traitement des donnéeset analyse

  1. Effectuer une analyse de localisation à l' aide d' un logiciel développé sur mesure pour extraire des paramètres les mieux adaptées pour toutes les molécules simples, ainsi que pour les mires 11,15,23. On obtient ainsi non seulement les coordonnées x, y de coordonnées, mais aussi l'intensité qui est utilisée pour l'analyse de la courbe d'étalonnage.
    1. Importer les données d'étalonnage premières acquises à l'étape 3.5 en utilisant la commande "Extraire Peaks multiples étiquettes" dans le menu "Fichier" pour effectuer la localisation seule molécule. Suite à l'analyse initiale de localisation, coordonnées obtenues à partir de caméras # 1 - 3 sont présents dans les canaux, respectivement rouge, vert et bleu, et peuvent être sauvegardés pour une analyse ultérieure en utilisant la commande "Enregistrer traité comme IDL (.sav)" sous la rubrique " fichier "menu.
  2. Pour apporter des données à partir de caméras # 1 - 3 dans l' enregistrement à l' aide des repères fluorescents embarqués sur les lamelles, sélectionner plusieurs repères lumineux pour fournir une couverture de l'image centrale (par exemple,Figure 1B) en utilisant la commande "Points Anchor repères" sous le menu "Transformations d'images". Utilisez les ensembles triples de coordonnées de localisation à partir de caméras # 1 - 3 obtenus à partir des repères lumineux à l'étape 5.1 pour calculer la rotation et de la matrice mise à l'échelle qui va apporter des caméras n ° 1 et n ° 3 dans le registre avec la caméra n ° 2. Avec un nombre suffisamment important de repères, d'ordre supérieur gauchissement polynôme peut être effectuée pour mieux adaptée.
  3. Une fois que la matrice de transformation est calculée, de transformer les données brutes des caméras n ° 1 - 3, ainsi que pour obtenir les données brutes sommées. Effectuez une autre série d'analyses de localisation pour obtenir un plus précis x, y coordonner et de déterminer la contribution relative de chaque canal de caméra pour les données brutes additionnées; utilisez la commande "Transform Raw, Enregistrer et Enregistrer Somme (.dat)" sous le menu "Transformations d'images". Ce rapport d'intensité contient les informations de coordonnée z.
  4. Sélectionnez un fiducial lumineux et exécuter z-calibration montage en utilisant la fonction "Test Wind Point 3D" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales". Cela s'adapter fonctions 3-sinusoïdales aux intensités des canaux 3 de la caméra pour déterminer la courbe d'étalonnage. Le fichier d'étalonnage est alors enregistré pour une utilisation ultérieure sur les principaux ensembles de données.
  5. Pour tester la qualité de la courbe d'étalonnage, effectuer une extraction coordonnée z, comme décrit précédemment 23. Pour fiducials bien élevés dans un système bien calibré, la coordonnée z devrait évoluer linéairement, étant donné que les ensembles de données d'étalonnage sont prises avec un balayage linéaire z position. En outre, les z-positions de tous les mires devraient évoluer avec une pente similaire.
  6. Une fois un étalonnage satisfaisant est obtenu, effectuer la localisation et l'analyse de transformation pour les ensembles de données d'images brutes acquises à l'étape 4 suivant la même procédure décrite dans les étapes 5.1-5.3. Une fois terminé, charger le fichier d'étalonnage de l'étape 5.4 et d'effectuer l'extraction coordonnée z en utilisant les fonctions "Pick WND Fichier" et "Extraire coordonnée Z" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales".
    NOTE: Depuis le temps d'acquisition est> 15 min, la dérive mécanique est à prévoir.
  7. Pour effectuer la correction de dérive en x, y, sélectionnez un fiducial lumineux à partir des coordonnées de localisation. Ce repère doit être présente dans tous les cadres. Ensuite, utilisez le x, dérive de la fiducial coordonnée y d'aligner toutes les autres coordonnées dans le même cadre de nouveau dans l' enregistrement (figure 3A-B) en utilisant la fonction "Test / écriture Guide Star" dans le menu "Transformations d'images". Enregistrement de coordonnée Z peut être effectuée de manière similaire en accédant au "Guide de test Star" et les fonctions "Write Guide Star" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales".
  8. Comme l'échantillon peut présenter une légère inclinaison, effectuer une correction d'inclinaison en fournissant les x, y, z les coordonnées des points de référence 3 définissant le plan qui doit être régler le niveau en utilisant la fonction "Supprimer XYZ Tilt" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur " Z-coordonner les opérations "sous le menu" Fonctions spéciales ".
  9. À la suite des dérives et d'inclinaison corrections, enregistrer les coordonnées de localisation. Reconstruire une image de super résolution pour une analyse ultérieure (figure 4A-D) en utilisant la commande "Render" sur l'interface principale. La couleur peut être utilisé pour indiquer la coordonnée z. En variante, une vue latérale de la zone sélectionnée peut également être rendue. Les coordonnées de localisation peuvent être exportées sous forme de fichiers texte pour plus de quantification, ou l'image reconstruite peuvent être enregistrés dans un fichier .tif.

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Representative Results

exigences critiques pour iPALM sont l'alignement, l'enregistrement, et le calibrage des systèmes optiques. Ceux-ci sont nécessaires pour assurer une bonne interférence dans le 3-way diviseur de faisceau requis pour l'extraction coordonnée z. Pour permettre une surveillance continue, de sources ponctuelles constantes de fluorescence sont nécessaires. Ceci peut être réalisé en utilisant des nanoparticules fluorescentes Au ou bimétalliques 23 dont la photoluminescence provenir de la résonance de plasmon de surface localisée (LSPR). Ils agissent comme un dipôle unique stable lors de l'illumination et peuvent généralement être localisés avec 5 - précision de 10 nm. Ces nanoparticules disponibles dans le commerce émettent un niveau de luminosité dans la plage de la plupart des fluorophores une seule molécule, de telle sorte que les fluorophores et les repères peuvent être imagés avec la même intensité d'excitation et les paramètres de gain sur les caméras EMCCD, sans saturation (figure 1B). En outre, ces mires aussi grandement facilitate focalisation, de sorte que la largeur apparente des mires peut être surveillé pendant le réglage de mise au point. En outre, le nettoyage rigoureux de la surface de lamelle, comme par Piranha gravure ou de nettoyage de plasma, est également nécessaire, car fond parasite fluorescence des couvre-objets non nettoyés ou mal nettoyés peuvent facilement submerger les signaux d'une seule molécule, comme décrit précédemment.

iPALM repose sur interférométrie multiphase pour permettre de haute précision de mesure coordonnée z simultanément avec PALM (pour x, y). Dans l'instrument iPALM, chaque photon de fluorescence émise peut être considérée comme se propager à travers les deux chemins optiques, qui ont ensuite auto-interfèrent dans un 3-way diviseur de faisceau fabriqué sur mesure. La coordonnée z est ainsi codé dans la phase du photon brouillée. Les différences de phase mutuelles de ~ 120 ° des faisceaux de sortie provenant du résultat du diviseur de faisceau à 3 voies de la variation d'intensité des images d'une seule molécule entre 3 cameren permettant z - coordonner l' extraction à partir d' une courbe d'étalonnage. Sur cette base, l'ensemble porte-échantillon iPALM est un composant essentiel, car il est équipé d'une paire d'actionneurs piézo-électriques qui permettent la traduction nm précision en z qui peut être utilisé pour l'alignement et le calibrage.

Lors de la mise au point et l'alignement approprié, la traduction de l'échantillon le long de l'axe z va générer un effet d'interférence. Ceci se manifeste par l'oscillation de l'intensité de repère entre les trois canaux de caméra (figure 1C-D). Ces oscillations indiquent également que le dessus et les chemins de faisceau optiques de fond sont pratiquement adaptés, permettant ainsi l'interférence à photon unique. Habituellement, lors de la rotation de l'instrument, les phases initiales de chaque caméra ne sera pas optimale et l'analyse de position z est nécessaire comme outil de diagnostic pour l'étalonnage et l'alignement. Pour arriver à la phase optimale, le miroir inférieur du diviseur de faisceau(Figure 1A) peut être ajustée en utilisant la scène tip-tilt piézoélectrique. L'analyse d'étalonnage de z-position est prise après chaque petit 10 - Réglage 20 nm. L'intensité de la mire dans chaque canal est alors déterminée par une analyse de la localisation (c. -à- raccord avec une fonction gaussienne 2D). L'intensité normalisée par l'intensité totale peut être approchée par une forme d'onde sinusoïdale, permettant l'expression de phase à calculer; Ainsi, la phase correspondant à chaque caméra peut être déterminée, comme on le voit sur la figure 1C. Nous notons que le principe d'interférence à photon unique utilisé dans iPALM peut également être démontrée à l'aide d'un beaucoup plus simple 2 voies diviseur de faisceau. Cependant, un diviseur de faisceau 2 voies est impraticable pour nanoscope 3D depuis à ou près de la limite de l'interférence destructive, le signal dans un canal est minime, ce qui entraîne des estimations bruyantes de coordonnées d'intensité et de localisation, qui limitent efficacement la coordonnée z détermination du range où les deux appareils ont une intensité importante (<100 nm). Le nombre minimum de canaux requis pour surmonter cet effet est de trois, et 3 et 4 voies systèmes de projection ont été décrits dans la littérature , 11,30.

Dans des conditions optimales, pour un diviseur de faisceau à 3 voies, les différences de phase entre les 3 caméras devrait être d'environ 120 °. Le diviseur de faisceau à 3 voies pour iPALM contient 3 interfaces réfléchissantes, comme schématisé sur la figure 1A. Le diviseur de faisceau est positionné au-dessus d'un miroir diélectrique plat, avec une fente mince rempli d'huile d'adaptation d'indice de réfraction, afin de permettre un réglage précis de longueurs de trajet à l'intérieur du séparateur de faisceau et pour obtenir des différences de phase optimale. Comme cela est représenté sur la figure 1C-D, à l'alignement correct pour iPALM, les caméras sont proches d'une différence de phase de 120 ° mutuelle. Dans la pratique, une différence de phase supérieure à 105 ° est généralement acceptable. Cette calibration deux indcats que le système est bien aligné et qu'il sera utilisé pour la suite de l'extraction de coordonnée z. Il est également utile d'évaluer la courbe d'étalonnage générée à l'aide des repères différents. La plupart des mires avec une luminosité modérée émettent généralement comme un seul dipôle, ce qui donne des courbes d'étalonnage bien élevés. Cependant, les agrégats occasionnels de mires (souvent ceux avec une luminosité extrême) peuvent se comporter d'une manière anormale, ce qui donne des courbes d'étalonnage fiables. Il est également conseillé de choisir fiducials près du centre de la zone d'imagerie et près de la zone d'intérêt biologique (figure 1B), en particulier depuis la haute NA lentille objectifs utilisés dans la configuration iPALM est pas-champ plat corrigé. Le champ de vision efficace est limitée à la zone centrale, ressort des largeurs plus grandes repères vers le bord du champ.

Après l'alignement initial, le point de vue des champs-de-contenant des cellules avec mo souhaitablerphology et plusieurs repères pour assurer une bonne calibration sont choisis pour l'imagerie. Ceci peut être réalisé en convertissant lentement le porte-échantillon en utilisant des lecteurs de servomoteurs 2 axes. Traduction de l'échantillon se traduira par une certaine défocalisation, puisque l'échantillon ne sont pas toujours parfaitement plat. Par conséquent, l'accent doit être ajusté en permanence lors de la traduction. Une fois que le champ de formation d'image a été sélectionné, un autre cycle de calibrage pour optimiser la courbe de calibration est alors effectuée pour affiner l'alignement du système et pour obtenir la courbe d'étalonnage réelle. Fait important, les zones sous le noyau ou près de régions ayant un indice de réfraction hétérogène (par exemple, des bulles d'air) doivent être évités en général, puisque ceux - ci provoquent une altération significative de la trajectoire relative des longueurs, ce qui fausse la coordonnée z.

Avec l'étiquetage de haute densité, des signaux de fluorescence de fluorophores organiques tels que Alexa Fluor 647 peuvent être extrêmement lumineux. Comme on le voit in la figure 2A, avec la préparation d' un tampon approprié contenant une concentration élevée de thiol (-SH) 31, le fluorophore doit être rapidement mis hors tension sous un éclairage d'excitation élevée. Cela se traduit par la suppression des signaux de fluorescence provenant de la majorité des molécules. A un instant donné, une très petite minorité de fluorophores revenir stochastiquement à l'état "marche". Ceux-ci devraient être clairsemées et peuvent ainsi être visualisés sous forme de molécules simples pour une ou quelques images avant de commutation «off». La dynamique de photocommutation sont fortement dépendantes de l'intensité d'excitation et la concentration de -SH, et donc, pour un système donné, il faut prendre soin d'optimiser la densité d'un étiquetage approprié, en particulier depuis une intensité relativement élevée d'excitation (640-647 nm) est nécessaire pour éteindre une majorité de Alexa Fluor 647 molécules. Si l'excitation est pas suffisamment forte, une fraction importante de Alex Fluor 647 volontérester dans l'état "on", ce qui entraîne un bruit de fond, des difficultés à observer la fluorescence de la molécule unique, et, finalement, une seule molécule résultats de la localisation de mauvaise qualité. Sous une condition bien équilibrée, les données brutes d'une seule molécule doivent contenir un nombre suffisamment grand de molécules ( des centaines) par trame (figure 2B), tandis que chaque molécule est assez rare pour permettre une détection sans ambiguïté et de l' analyse de la localisation. Il est également intéressant de noter que, pour iPALM, les principes de photocommutation sont identiques à celles de PALM ou STORM, et donc, des échantillons bien préparés pour iPALM peut être utilisé directement sur les systèmes 3D-PALM ou 3D-STORM plus simples. Pour acquérir une densité suffisante de molécules pour satisfaire Nyquist échantillonnage, habituellement 50.000 ou plusieurs trames de données brutes sont nécessaires ( à savoir, 150.000 cadres totaux pour les 3 caméras). Comme l'acquisition progresse, une fraction croissante de fluorophores pourrait être épuisé par photoblanchiment destructrices, entraînant des longeronser la densité de molécule unique. Pour compenser cela, de brèves impulsions de lumière bleue 405 nm (405 nm) peuvent être éclairés sur l'échantillon à des intervalles de promouvoir l'activation de fluorophore.

En raison de la longue période d'acquisition nécessaire, des résultats optimaux pour iPALM (ou une seule molécule microscopie localisation en général) exigent la dérive de l'échantillon à faible et / ou une bonne correction de la dérive. Par exemple, en utilisant le temps d'exposition de 50 ms en mode transfert de trame (frame rate de 20 Hz), le temps total d'acquisition de 50.000 cadres est de 42 min. Pendant cette période, la dérive mécanique sur des dizaines de nm est attendue. En effet, en plus de la précision de localisation élevée et une forte densité d'étiquetage, la résolution dépend également de la qualité de la correction de la dérive. Il existe de multiples origines à ces dérives avec la fluctuation thermique étant une cause majeure. En raison de cette considération, lorsque cela est possible, les pièces sont iPALM sur mesure usinés en utilisant Invar, un alliage à faible dilatation thermique, ou en acier inoxydable,tous deux ont des caractéristiques de dilatation thermique beaucoup plus faible que le laiton ou l'aluminium. Malheureusement, cela impose également des frais supplémentaires par rapport à l'aluminium, qui est un métal plus couramment utilisé pour les composants mécaniques, d'être beaucoup moins coûteux et plus facile à usiner. D'autres sources de dérive peuvent être des vibrations mécaniques de l'équipement périphérique, environnements ambiants, ou les courants d'air. Ceux-ci doivent être minimisées en plaçant le système dans un boîtier approprié et en redirigeant la direction du flux d'air dans la zone de microscope. L'installation doit être construite sur une table optique de recherche de qualité et, si possible, des composants contenant ventilateur doivent être placés sur la table optique. Néanmoins, malgré toutes les précautions, une certaine quantité de dérive restera. Critique, ces dérives doivent être minimisés de telle sorte que l'image reste la mise au point pendant toute la durée d'acquisition. Dans nos systèmes, ces méthodes passives suffisent à minimiser la dérive à des niveaux acceptables. Cependant, il devrait être possible de mettre en oeuvre actif dérive comméthodes de pensation pour permettre à long terme et de l' imagerie de haute précision 32.

Après le traitement des données brutes, les coordonnées 3D de localisation peuvent être obtenus avec typiquement 5-10000000 pics une seule molécule par ensemble de données. Comme on le voit sur la figure 3, la dérive en fonction du temps peut être visualisé à partir des coordonnées de localisation des repères. Fiducials multiples peuvent être utilisées pour calculer la moyenne trajectoire de correction de dérive (figure 3A-B). En outre, il est usuel de filtrer les pics qui correspondent à peu à la fonction 2D-gaussienne lors de l'analyse de la localisation. Cela pourrait être dû à des bruits parasites ou se chevauchant partiellement des pics d'une seule molécule et peut être différenciée par la grande erreur quadratique résiduelle calculée pendant le processus d'ajustement. Les pics de faible luminosité (comme indiqué par le compteur de photons) et, par conséquent, une plus grande incertitude ( à savoir, supérieure à environ 25 nm) sont également filtrés, uns Ces proviennent probablement de la fluorescence d'arrière-plan non spécifique. De même, les pics dont les intensités des canaux 3 de l'appareil correspondent mal à la courbe d'étalonnage sont également rejetés, les coordonnées z obtenus ne sont pas fiables. Il convient de noter que le contenu de l' information complète de iPALM (et par microscopie localisation en général) est massive, étant donné que les résultats d'analyse non seulement dans les coordonnées fluorophores, mais également dans plusieurs autres paramètres tels que l' intensité, la largeur, la luminosité, etc. Cependant, dans la pratique, étant donné que relativement peu d'outils de calcul sont actuellement disponibles pour analyse dans l'espace de coordonnées, les coordonnées de localisation sont généralement rendus ou reconstruits en images à base de pixels pour une analyse plus approfondie.

L'approche utilisée pour la reconstruction de l'image iPALM est de représenter chaque localisation coordonnée avec une fonction gaussienne 2D normalisée, avec l'incertitude de localisation défini comme Gaulargeur ssian 33. Ainsi, les coordonnées de haute précision (typiquement des pics à molécule unique avec une luminosité élevée contre faible bruit de fond) apparaissent comme des pics pointus et étroits, tandis que les coordonnées de faible précision (généralement faible luminosité ou élevée fond pics une seule molécule) apparaissent comme gradateur et plus large pics. De cette manière, chaque molécule apporte la même quantité d'intensité de l'image. Pour un ensemble de données 3D, la coordonnée z peut être représenté en utilisant la couleur, généralement basée sur une échelle de teinte (figure 4C-D). En variante, les images peuvent être affichées en vue de côté (x, z ou y, z) projection ou volumes. Un certain nombre de logiciels disponibles au public peut être utilisé pour visualiser ces données 34.

Comme on le voit sur les figures 4-6, les images iPALM donnent une amélioration significative par rapport à la microscopie par fluorescence à diffraction limitée. L'architecture de f-actine dans les cellules HUVEC peut être visualisé avec beaucoup de reso spatiale amélioréerésolu-. Dans les régions du cortex, les réseaux de filaments distincts peuvent être observés, alors que dans les fibres de stress, les ensembles et les lamellipodes, les réseaux de F-actine denses sont observées pour avoir une texture filamenteuse, bien que les filaments individuels ne sont pas différenciés. Ceci est probablement dû aux limitations tant dans la luminosité des fluorophores et la précision de la localisation. La présence de filaments corticales distinctes suggère que l'ultrastructure du réseau d'actine F est suffisamment bien conservée; ainsi, iPALM pourrait être un outil utile pour caractériser l'architecture corticale. Sur la figure 5, une sous-région d'une cellule HUVEC est affichée avec les profils d'un filament d'actine quantifié. On peut voir que le z-histogramme d'un filament est d'environ 15 nm de largeur, soit relativement faible par rapport à ~ 45 nm pour la direction transversale (x, y) point de vue, montrant que iPALM donne une amélioration de la résolution significative de résolution z par rapport à x, y-plan, comme prévu. Cependant, étant donné que l'ACTUdiamètre al de f-actine est ~ 8 nm, il est difficile de savoir si le filament observé est un filament unique ou un faisceau de quelques filaments. Imagerie corrélative utilisant iPALM et EM pourrait être une stratégie utile pour une caractérisation plus poussée de l' architecture f-actine, bien que cette approche n'a pas été appliquée à l' étude f-actine encore 23.

Figure 1
Figure 1: Diagramme schématique de iPALM 3-D Super Résolution Microscopie. A) Schémas de l' optique iPALM. Les deux lentilles d'objectif (Nikon, NA 1,49 60X) permettent à chaque photon de fluorescence émise à se propager à travers le dessus et les chemins de faisceau optique de fond, et ils sont redirigés vers interférer dans le diviseur de faisceau par une paire de miroirs orientés à 22,5 °. La phase du photon auto-brouillée est directement proportionnelle à Az, codant ainsi la coordonnée z du fluorophore, et peut être mesuré nousment un diviseur de faisceau à 3 voies avec des différences de phase mutuelles de 120 ~ ° entre les trois faisceaux de sortie. Ils sont focalisés par les lentilles de tube (L1-L3, f = 400 nm) et filtrés par le filtre d'émission (F1 - F3). Chaque molécule unique apparaît donc avec des intensités différentes entre les caméras (EMCCD1-3) , mais à x similaires, les coordonnées y. (A) est reproduite et modifiée à partir Réf. 11. (B) image Diffraction limitée de cellules HUVEC marquées pour f-actine avec Alexa Fluor 647. Les points lumineux désignent Au mires de nanoparticules. Les angles de phase pour les caméras # 1 - 3 sont représentés par des lignes rouges, vertes et bleues, respectivement, centrés sur chaque repère, à la différence de phase entre les caméras # 1-3 indiqué. Barre d' échelle:. 5 um (C) images fiduciels montrant les effets interférométriques. Images d'une nanoparticule fiducial Au pour chaque caméra (CCD1-3) ou totale (somme), pris comme position z (en nm, sur la rangée du bas) est numérisé pour l'étalonnage. L'intensité dans each caméra peut être vu à osciller avec une relation de phase, comme indiqué dans (B). Courbe de calibrage (D) iPALM. L'échantillon est translaté le long de l'axe z. Les intensités d'une nanoparticule fiducial Au pour la EMCCD1-3 sont spectacle comme des lignes rouges, vertes et bleues, respectivement (en haut). Ceux-ci sont ensuite normalisés et aptes à déterminer les différences de phase (en bas). Pendant l'alignement, le système est ajusté afin d'obtenir des différences de phase maximale entre les trois caméras. La courbe d'étalonnage est prise à chaque site d'imagerie à utiliser dans l'extraction de la coordonnée z de chaque molécule unique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Molecule Simple Imaging de photocommutation Alexa Fluor 647-phalloïdine comme actine étiquettes. (A) étape de photocommutation initiale. F-actine dans des cellules fixées est marquée à une densité élevée par phalloïdine conjuguée à Alexa Fluor illumination 647. haute intensité dans un résultat de tampon d'image contenant un thiol en rapide arrêt de la plupart des fluorophores. (B) cadres représentatifs de première molécule unique cadres. À l'état d'équilibre clignotant, l'Alexa Fluor actif 647 doit être suffisamment rare que les molécules simples individuelles apparaissent comme une tache de PSF taille. Images des mêmes cellules indiquées dans (A), montré avec un contraste inverse. Barres d'échelle en A et B:. 5 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Correction de la dérive en utilisant Multip. le fiducials coordonne la localisation pour quatre mires (A, coordonnée x; B, coordonnée y) ont été utilisées pour calculer la dérive à l' aide des raccords polynôme (5 ième ordre, paramètres d' ajustement sur coin supérieur droit). La trajectoire de dérive moyenne permet la correction de la dérive avec des sous-5 nm de précision (x: 3.085 nm, y: 3.606 nm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Visualisation de 3-D f-actine Architecture par iPALM. (A) de l' image limitée par la diffraction des cellules HUVEC avec des filaments d' actine marqués par Alexa Fluor 647-phalloïdine (correspondant aux sous - zones de la cellule de la figure 2). La tache lumineuse est due aux mires de nanoparticules Au. (C) de l' image reconstruite iPALM, chaque localisation de coordonnées 2D est rendue par une gaussienne avec une largeur correspondant à la localisation d' incertitude. La coordonnée z est colorée en fonction de la barre de couleur. Domaines de caractéristiques filamenteuses denses et rares peuvent être vus. Les barres d'échelle (AC): 1 pm (D) Zoom-in vue zone encadrée en C montrant filamenteuse corticale topologie de l' actine.. Barre d'échelle:. 250 nm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Nanoscale Dimension f-actine visualisés par iPALM. (A) l' image Reconstructed iPALM cellules HUVEC avec b f-actine marqué y Alexa Fluor 647-phalloïdine. La couleur indique la coordonnée z en fonction de la barre de couleur. Barre d' échelle: 1. Um (B) , en coupe transversale histogramme de x, y coordonnées de localisation le long de l'axe long de la zone encadrée (A). Pour obtenir l'histogramme, les coordonnées sont projetées sur le grand axe de la boîte et binned avec 5 nm bin-size. La courbe grise indique un meilleur ajustement gaussien à l'histogramme, avec une largeur à mi - hauteur (FWHM) de 43,88 nm. (C) Histogramme du z-position localisation coordonnées dans la zone encadrée en (A). Les z-positions sont binned avec une taille de bac de 1 nm. La courbe grise indique un meilleur ajustement gaussien à l'histogramme, avec une FWHM de 17,50 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6:. Comparaison des iPALM Imaging de f-actine Utiliser différents réactifs de marquage des images Reconstructed iPALM de f-actine marqué en utilisant Alexa Fluor phalloidin 647 conjugué (A), Alexa Fluor phalloidin 568-conjugué (B), ou par transfection avec l' actine vecteur d'expression de la protéine de fusion -mEos2 (C). Les barres d'échelle (AC):. 1 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le système optique de iPALM est basé sur une conception à double objectif opposé 4-π, comme illustré sur la figure 1A. La configuration est construit en utilisant des pièces opto-mécaniques à la fois sur mesure usinées et commerciales, comme décrit plus haut 23 et énumérés dans le tableau 1. En plus de notre configuration, le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) héberge un système qui est accessible à la communauté scientifique au Centre d'imagerie avancée au Campus Janelia Research. Pour les dessins pleins mécaniques, des schémas de contrôle, et les logiciels, les lecteurs sont invités à se renseigner auprès de Harald Hess à HHMI pour plus d'informations. Un avantage principal pour l' utilisation de iPALM ainsi que d' autres méthodes de microscopie de localisation d'une seule molécule pour la visualisation f-actine est la relative facilité de préparation de l' échantillon par rapport aux techniques EM, qui nécessitent généralement le traitement des échantillons durs, préparation laborieuse, et les praticiens hautement qualifiés 3,23 . Additionally, la fluorescence est naturellement prête à l'imagerie multicanal, qui reste difficile pour les EM. Néanmoins, comme décrit ci-dessous, il existe plusieurs limites actuelles de l'approche, à la fois en termes de préparation des échantillons et processus d'imagerie. Tout d' abord, comme cela est le cas pour la préparation d'échantillons d'EM, il faut prendre soin d'assurer une bonne conservation ultrastructurale des spécimens 35, car un protocole adéquat pour un niveau de résolution limitée par la diffraction peut provoquer des perturbations graves à l'échelle nanométrique. Pour l'imagerie de l'actine, une bonne fixation des cellules est un facteur important affectant la qualité de l'échantillon. Le glutaraldéhyde est un fixateur préféré car il préserve le cytosquelette et la membrane très bien, mais dans les cas de co-coloration avec l'anticorps, les sites d'épitopes peuvent être affectés. Dans de tels cas, le paraformaldéhyde peut offrir un compromis acceptable, car il tend à mieux préserver les sites d'épitopes d'anticorps. Il est important pour une seule molécule localisation microscopique, ces fixateurs ont tendancepour générer fond d'autofluorescence; ainsi, après la fixation par trempe borohydrure est nécessaire, en particulier dans le cas de glutaraldéhyde.

En outre, la sélection appropriée des fluorophores et des stratégies d'étiquetage sont parmi les facteurs les plus importants pour les expériences réussies. En raison de la dimension nanométrique de f-actine, de fortes densités d'étiquettes sont nécessaires pour capturer les réseaux filamenteux sous - jacents, tel que stipulé par le théorème d' échantillonnage de Nyquist 36. Pour l'actine, phalloidin permet l'étiquetage de très haute densité, avec une large gamme de fluorophores organiques disponibles auprès de nombreux fabricants. Cependant, étant donné que la phalloïdine est toxique, la fixation cellulaire et de perméabilisation est requise. Stratégies alternatives pour des cellules vivantes étiquetage de l'actine compatibles comprennent l'utilisation de la fusion des protéines fluorescentes (FP), soit avec l'actine monomère ou avec de petits polypeptides de liaison à l'actine. Cependant, nous avons constaté que ceux-ci ont tendance à donner une densité de marquage plus faible par rapport à la phalloïdine ( 37, mais cette approche devrait être coûteuse et de main-d'œuvre. En termes de fluorophores, Alexa Fluor 647 a généralement été trouvé pour offrir toujours de bonnes performances pour la microscopie de localisation. Cela peut être décrit en termes du rapport, le contraste de luminosité quotient entre le pic molécule unique , et la fluorescence de fond 38. Une densité de marquage supérieur exige un rapport de contraste plus élevé, étant donné que l'arrière-plan pourrait cumulativement dégrader la précision de la localisation. Dans notre expérience, plusieurs autres fluorophores, tels que ATTO488, ATTO520 et Alexa Fluor 568 (figure 6B), peut être utilisé pour visualiser le f-actine, mais avec des résultats moins cohérents par rapport à Alexa Fluor 647, qui offre des performances de photocommutation robustes dans une large gamme de conditions de tampon d'image.

39. Cela vaut également pour les avantages et les limites de iPALM. Par rapport à d' autres techniques nanoscope 3 dimensions, iPALM est resté l'approche optique le plus élevé à ce jour la résolution, en particulier le long de l'axe z, avec la résolution z près de 2 fois mieux que le x, y-résolution 11. Toutefois, la dépendance à l'égard de iPALM interférométrie pour une résolution z élevé impose en outre une limitation de la profondeur d'imagerie, étant donné que la courbe d'étalonnage est périodique. En d'autres termes, les coordonnées z répètent tous les 250 nm ou plus (pour ~ 700 longueurs d'onde nm d'émission de Alexa Fluor 647). En pratique, cela peut être résolu en utilisant un éclairage TIRF, ce qui limite la zone d'excitation à l'intérieur de la profondeur de champ évanescent <200 nm de la lamelle. Ainsi, fluorophores plus profondément dans l'échantillon ne sont pas excités et restent invisibles. Toutefois, cela limite également les structures biologiques qui peuvent être imagés à ceux à proximité immédiate de la lamelle, comme adhérences focales, cytosquelette cortical et la membrane plasmique ventrale, tandis que les structures intérieures sont plus hors de portée. Pour obtenir un spécimen fixe, un seul remède est d'effectuer cryosectioning 40. Cependant, une telle approche est très laborieuse et nécessite une expertise spécialisée qui ne sont pas généralement accessible.

Alternativement, iPALM peut être adapté pour un z-gamme étendue en combinant interférométrie avec le système astigmate-défocalisation 12 utilisé en 3D-STORM. Cette approche fournit des coordonnées z doubles lectures, le premier par interférométrie, qui est de haute précision, mais périodique, et le second par défocalisation astigmate, qui est moins précis mais non périodique. Ce dernier peut alors être utilisé pour «déballer» ou briser la dégénérescenceles coordonnées z interférométriques, permettant ainsi le triplement de la profondeur d'imagerie iPALM à ~ 750 nm, approchant efficacement la profondeur focale intrinsèque des hautes lentilles de l'objectif de NA. Avec la phase dépliage, iPALM a été utilisé à des structures d'image en profondeur dans les échantillons, tels que les mitochondries, quoique légèrement réduite avec précision dans les 3 dimensions à cause de la défocalisation supplémentaire 40.

Une autre limitation intrinsèque de iPALM est la vitesse d'imagerie. Étant donné qu'un grand nombre de trames sont requises pour obtenir une densité élevée de coordonnées de localisation, la vitesse de la caméra est généralement la limite du taux d'acquisition. Avec les caméras EMCCD actuelles fonctionnant à 10 - 20 MHz taux de lecture, des dizaines de minutes sont nécessaires pour un nombre suffisant de cadres. Ces échelles de temps longues exigent que le spécimen être fixés. Ici, les progrès récents dans la technologie de la caméra, comme le Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) caméra beaucoup plus rapide scientifiques, peuvent permettre à une augmentation rapide des imvitesse 41 vieillissement, même si cela n'a pas encore été mis en œuvre pour iPALM. Pour certains d'une seule molécule d' approches de microscopie de localisation, un champ unique molécule dense peut être analysée à l' aide d' un algorithme modifié 42 ou comprimé de détection 43. L'adaptation de ces stratégies peut également accélérer iPALM en permettant plus denses images d'une seule molécule et, par conséquent, moins de cadres.

Avec des limitations dans la plage de vitesse et de l' imagerie et les points forts de la résolution spatiale, une application majeure pour iPALM est comme une méthode ultrastructurale qui exploite les avantages de l' étiquetage fluorescent pour dévoiler l' organisation à l' échelle nanométrique de protéines spécifiques 14,15,44. Poursuite de l'amélioration, tant en termes de technologies de l'optique et de fluorophores, devrait permettre à améliorer encore la résolution spatiale iPALM. Par exemple, le traitement d'image iPALM emploie actuellement une approche relativement simple d'approximation de premier ordre, avec chaque molécule unique modélisé par une fonction 2D-gaussien et commeconsommée comme une isotopiquement moyenne dipôle. Cela pourrait être complétée par des méthodes récentes, qui emploient un modèle plus précis de la fonction point propagation et l'orientation du dipôle, ou le traitement explicite des aberrations optiques à travers le champ de vision pour améliorer de manière significative la résolution spatiale. De même, photocaging a été rapporté, ce qui améliore la luminosité fluorophore par des ordres de grandeur 45. En effet, étant donné que les éléments clés de leur organisation ultrastructurale ont été bien caractérisés, le cytosquelette f-actine pourrait être un système modèle très précieux pour tester de nouveaux développements méthodologiques iPALM. La capacité d'analyser l'organisation des protéines par microscopie optique avec le niveau de puissance-EM vrai résoudre devrait grandement améliorer notre compréhension des multiples aspects de la structure et la fonction cellulaire.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

YW et PK remercient le soutien financier de la Fondation de recherche national de Singapour, décerné à PK (NRF-NRFF-2011-04 et NRF2012NRF-CRP001-084). Nous remercions également les laboratoires et de base de microscopie ouvertes installations MBI pour le soutien de l'infrastructure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

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References

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