إزالة بيوفيلم عن طريق بخاخات ثاني أكسيد الكربون دون النيتروجين تطهير

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. إعداد السطح لتشكيل بيوفيلم

  1. قطع 1 ملم سميكة 304 الفولاذ المقاوم للصدأ لوحات في رقائق (10 × 10 مم 2) مع قطع الميكانيكية.
  2. إجراء التنظيف بالموجات فوق الصوتية للرقائق في الأسيتون، والميثانول، ومنزوع الأيونات (DI) بالتتابع الماء لمدة 10 دقيقة لكل منهما. استخدام وعاء مقاوم للمذيب، مصنوعة من مواد مثل الزجاج، لإزالة التلوث العضوي.
  3. شطف رقائق مع المياه المتدفقة DI لمدة 3-5 ثانية.
  4. تجفيف رقائق باستخدام تدفق الغاز N 2 لمدة 3-5 ثانية.

2. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. اتخاذ P. الكريهة KT2440 (تفضلت التي تقدمها البروفيسور سونغ كوك لي، UNIST، كوريا الجنوبية) الأسهم تخزينها في -80 درجة مئوية التجميد العميق.
  2. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة بعد 1 دقيقة، والطبقة العليا من الحل المجمدة الأسهم تتحول إلى طين. تزج حلقة في الطبقة المذابة في المحلول.
  3. استخدام هذه الحلقة إلى خط البكتيريا على لوريا-Bertani (LB) لوحة تحتوي على 1.5٪ أجار.
  4. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية لنمو المستعمرات البكتيرية.
  5. اختيار مستعمرة واحدة من لوحة باستخدام حلقة جديدة.
  6. تطعيم 10 مل من مرق LB في أنبوب مخروطي 50 مل مع حلقة تحتوي على مستعمرة بكتيرية واحدة.
  7. احتضان مرق في حاضنة تهتز لمدة 16 ساعة على 30 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة.

3. تشكيل بيوفيلم على سطح الأرض

  1. التقاط كل من رقائق مستعدة مع ملاقط وتراجع لهم في الايثانول 70٪ 5 مرات لمدة 1-2 ثانية لكل منهما، لتعقيم سطح كل رقاقة. ضمان عقد رقائق مع ملاقط خلال غمس.
  2. تغمس كل شريحة في الماء DI تعقيمها وفي مرق LB بالتتابع، 5 مرات لمدة 1-2 ثانية لكل منهما، لإزالة ما تبقى من الإيثانول.
  3. ضع هذه الرقائق في لوحات ثقافة 6 جيدا مع 2 رقائق و 5 مل مرق LB لكل بئر.
  4. تمييع ثقافة البكتيرية حتى تركيز فى الروافد مرق LB8 × 10 8 خلية / مل (الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي: ~ 0.8).
  5. تطعيم كل جيدا مع 50 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف.
  6. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة 24 ساعة لتشكيل الأغشية الحيوية.

تنظيف 4. CO 2 الهباء

  1. تراجع رقائق تشكيل بيوفيلم في 10 ملي العازلة خلات الأمونيوم (الطيارة) 5 مرات لإزالة فضفاضة المرفقة والبكتيريا العوالق.
  2. تجف هذه الرقائق في خزانة السلامة البيولوجية، حيث يتدفق الهواء أقل ما يقال.
  3. مباشرة بعد التجفيف، ووضع شريحة على مكان التحميل، والتي هي 20 ملم من فوهة CO 2 على طول محور الطائرة. إمالة محور طائرة إلى زاوية 40 درجة.
  4. ضبط ضغط الركود من CO 2 و N 2 الغاز إلى 5.3 ميجا باسكال و 0.7 ميجا باسكال، على التوالي، وذلك باستخدام المنظمين الغاز الضغط.
  5. تطبيق طائرة الهباء الجوي على الجزء الأوسط من الشريحة. الهباء الجوي البيضاء بما في ذلك ثاني أكسيد الكربون الصلبة يجب 2أن تكون واضحة. تحويل "على" صمام الملف اللولبي لCO 2 لمدة 5 ثوان، ثم تشغيله "قبالة" لمدة 3 ثانية (دورة: 8 ثانية) بشكل دوري باستخدام مفتاح التحكم يدويا. إذا كان يحتاج تطهير النيتروجين لاستخدامها، تشغيل صمام الملف اللولبي لإمدادات مستمرة من N 2.
  6. علاج رقائق مع CO 2 الهباء الجوي لمدة 16، 40، و 88 ثانية مع وبدون عمليات التطهير النيتروجين. الإبقاء على رقائق من دون علاج والضوابط السلبية.

5. تحليل لكفاءة إزالة

  1. إعداد 1 ميكرومتر الأخضر مضان نوكليك وصمة عار حمض (الطول الموجي الإثارة / الانبعاثات: 480/500 نانومتر) في الماء DI إلى وصمة عار الخلايا البكتيرية على السيطرة ورقائق المعالجة الهباء الجوي.
  2. وضع رقائق في حل تلطيخ.
  3. احتضان رقائق في حاضنة دون ضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. بعد الحضانة، وشطف بلطف رقائق مع المياه المتدفقة DI لإزالة صبغة الفلورسنت المفرط.
  5. تجفيف واي رقائقال تدفق الغاز N 2.
  6. خذ مضان الصور المجهرية من 5 حقول عشوائية من عرض (321 × 240 ميكرون 2) لكل شرائح باستخدام مجهر epifluorescence، و40X عدسة الهدف، وكاميرا CCD.
  7. الحصول على كثافة مضان لكل صورة باستخدام برامج معالجة الصور مثل يماغيج. في ImageJ، استخدم وظيفة "خلفية طرح" في القائمة "عملية"، وحدد "كثافة المتكاملة" في إطار "تعيين القياسات" في قائمة "تحليل". قيام "القياس" في قائمة "تحليل" للحصول على كثافة مضان.
  8. حساب كفاءة إزالة بيوفيلم وفقا للمعادلة التالية: 100٪ × (أنا من رقائق التحكم - أنا من رقائق المعالجة) / (الأول من رقائق التحكم)، حيث I هي شدة مضان محسوبة.
  9. الحصول على كفاءات إزالة والانحرافات المعيارية المتوسط. استخدام فيأقل 4 رقائق لكل حالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمت CO 2 الهباء الجوي لإزالة P. الكريهة الأغشية الحيوية من SUS304 السطوح (الشكل 1). غطيت معظم الأسطح مع بيوفيلم بعد 24 ساعة من النمو. تمت إزالة معظم بيوفيلم باستخدام CO 2 الهباء الجوي (الشكل 2). كما هو متوقع، ويبين الشكل 3 زيادة في كفاءة إزالة بيوفيلم كوقت العلاج الهباء الجوي CO 2 زيادة. للمرة علاج 88 ثانية، تم تحديد كفاءة إزالة إلى أن تصل إلى 97.74٪ و 98.29٪ مع وبدون تطهير النيتروجين، على التوالي. وكانت درجة حرارة الهواء 23-24 درجة مئوية، وكانت الرطوبة النسبية 26-50٪ عندما أجريت التجارب التنظيف.

شكل 1
الشكل 1. تخطيطي يبين إزالة بيوفيلم باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الهباء الجوي. يتم إنشاؤها والهباء الجوي عندما يتم توسيع ارتفاع ضغط ثاني أكسيد الكربون غاز 2 adiabatically من خلال فوهة بخاخ (0.4 مم) ودرجة حرارة الغاز ينخفض بسرعة. وتطبق هذه الهباء عالية السرعة CO 2 إلى سطح مغطاة بيوفيلم. عند استخدام تطهير النيتروجين، يتم تزويد N 2 الغاز إلى 8 فتحات المحيطة المركزية CO 2 فوهة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الإسفار الصور المجهرية لنمت على مدار 24 ساعة، P. . عولجوا الأغشية الحيوية الكريهة على 304 رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ ورقائق مع CO 2 الهباء الجوي في أوقات مختلفة العلاج (0، 16، 40، و 88 ثانية) دون التطهير النيتروجين. والملونة الصور الأحادية اللون الأخضر، والحانات على نطاق وبيضاء تشير إلى 50 ميكرون.ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الكفاءة إزالة لP. وتم حساب الأغشية الحيوية الكريهة من 304 أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ مع مختلف الأوقات CO 2 العلاج الهباء الجوي، مع وبدون عمليات التطهير النيتروجين وكفاءة الإزالة على أساس كثافة مضان من الأغشية الحيوية. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats