去除生物膜使用二氧化碳气溶胶没有氮气吹扫

本实验的总体目标是评估使用二氧化碳气溶胶去除生物膜而不吹扫氮气的效果。二氧化碳气溶胶可用于利用气溶胶上的动量传递和表面活性剂作用去除生物膜。这是一种在短时间内去除生物膜的有效且可靠的方法，也是一种生物膜气相清洁技术。

要开始实验，请使用机械切割的 1 毫米厚的三零四不锈钢芯片，内部为 10 x 10 平方毫米。接下来，依次用丙酮、甲醇和去离子水或去离子水对芯片进行超声波清洗。用流动的去离子水冲洗芯片 4 秒钟，然后使用氮气流干燥芯片 4 秒钟。

检索储存在 80 摄氏度的恶臭假单胞菌 KT2440 原液。在室温下解冻培养物 1 分钟，此时冷冻储备液的顶层变成泥浆。将一个环浸入储备溶液的熔化层中，然后将细菌划线到含有 1.5% 琼脂的 Luria 肉汤或 LB 板上。

将板在 30 摄氏度下孵育过夜。第二天，在 50 mL 锥形管中加入 10 mL LB。使用新鲜的环从板中挑选一个菌落并接种 LB。在摇动培养箱中孵育肉汤。

用镊子拿起每个准备好的薯片，将它们浸入 70% 乙醇中 5 次，每次 1-2 秒，以对每个薯片的表面进行消毒。接下来，用高压灭菌的去离子水或 DI 水冲洗每个芯片。然后，在 LB 中依次除去剩余的乙醇。

将芯片放入 6 个孔培养板中，每孔将 2 个芯片放入 5 毫升 LB 肉汤中。然后，稀释细菌培养物，直到 LB 肉汤中的浓度达到 8 x 10 至每毫升第八个细胞。用 50 微升稀释的细菌培养物接种每个孔。

然后，孵育板。将生物膜化的片状芯片浸入 10 毫摩尔乙酸铵缓冲液中 5 次，以去除松散附着的浮游细菌。然后，在空气流动温和的生物安全柜中干燥芯片。

干燥后，立即将芯片放在装载处，沿喷射器轴线从二氧化碳喷嘴处放置 20 毫利特。将射流轴倾斜 40 度角。接下来，使用气体压力调节器设置二氧化碳和氮气的停滞压力。

将气溶胶喷射器涂抹在芯片的中心部分。打开二氧化碳电磁阀 5 秒钟，然后使用手动控制的开关定期将其关闭 3 秒钟。如果需要使用氮气吹扫，请打开电磁阀以持续供应氮气。

设置完成后，用二氧化碳气雾剂处理木片，带和不带氮气吹扫，并比较不同气雾剂处理时间的木片。保留未经处理的芯片作为阴性对照。在 DI 水中制备一微摩尔的绿色荧光核酸染色剂，以对对照和气溶胶处理的芯片上的细菌细胞进行染色。

将染色液放入装有芯片的孔中，孵育。孵育后，用流动的去离子水轻轻冲洗芯片，以去除过多的荧光染料。然后，用氮气流干燥芯片。

使用落射荧光显微镜拍摄每个芯片的五个随机视场的荧光显微图像。最后，继续计算。用二氧化碳气雾剂处理恶臭假单胞菌生物膜的 24 小时生长荧光显微镜图像 0 秒、16 秒、40 秒和 88 秒，而不吹扫氮气。

根据没有氮气吹扫的生物膜的荧光强度计算的去除效率高于有氮气吹扫的去除效率。正如您在本视频中看到的那样，三相清洁技术可在短时间内有效去除生物膜。它可以应用于各种受生物污染的表面。