הסרת biofilm באמצעות אירוסולים פחמן דו-חמצני ללא חנקן טהר

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. הכנת השטח ליצירת biofilm

  1. חותכים 1 מ"מ בעובי 304 צלחות נירוסטה לתוך שבבים (10 × 10 מ"מ 2) עם חותך מכני.
  2. בצע ניקוי קולי של שבבי אצטון, מתנול, ו ללא יונים (DI) ברצף מים במשך 10 דקות כל אחד. השתמש מיכל ממס עמיד, עשוי חומרים כגון זכוכית, להסיר זיהום אורגני.
  3. שוטף את השבב עם מים זורמים DI במשך 3-5 שניות.
  4. ייבש את השבב באמצעות זרימת גז N 2 למשך 3-5 שניות.

2. הכנת תרבית חיידקים

  1. קח פ putida KT2440 (בתנאי בחביבות על ידי פרופ 'סונג קוק Lee, UNIST, דרום קוריאה) מניות מאוחסנים -80 ° C עמוק במקפיא.
  2. להפשיר בטמפרטורת החדר לאחר 1 דקות, ואת השכבה העליונה של פתרון המניות קפוא הופך לבוץ. לטבול לולאה לתוך השכבה המומסת של פתרון המניות.
  3. השתמש לולאה זה פס החיידקים על גבי לוריאצלחת -Bertani (LB) המכילה אגר 1.5%.
  4. דגירה את הצלחת לילה ב C 30 ° לגדל את מושבות חיידקים.
  5. פיק מושבה אחת מהצלחת באמצעות לולאה טריה.
  6. לחסן 10 מ"ל של מרק LB צינור חרוטי 50 מ"ל עם לולאה המכילה את מושבת חיידקים אחת.
  7. דגירה מרק חממת רעד במשך 16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 160 סל"ד.

3. היווצרות biofilm על פני השטח

  1. תרים אחד של השבבי המוכן עם פינצטה לטבול אותם 70% אתנול 5 פעמים במשך 1-2 שניות כל אחד, כדי לעקר את פני השטח של כל שבב. ודא שבב מוחזק עם פינצטה במהלך הטבילה.
  2. טובלים כל שבב במים DI autoclaved וב ברצף מרק LB, 5 פעמים במשך 1-2 שניות כל אחד, כדי להסיר אתנול הנותרים.
  3. מניחים שבבי אלה צלחות תרבות 6 היטב עם 2 צ'יפים 5 מ"ל מרק LB לכל טוב.
  4. לדלל את תרבית החיידקים עד הריכוז בדרגים מרק LB8 × 10 8 תאים / מ"ל (צפיפות אופטית באורך גל 600 ננומטר: ~ 0.8).
  5. לחסן כל טוב עם 50 μl של תרבות חיידקים המדוללת.
  6. דגירת הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס ללא רעד במשך 24 שעות עבור היווצרות של biofilms.

4. ניקוי תרסיס CO 2

  1. טובלים את שבבי-נוצר ביופילם ב 10 מ"מ אמוניום אצטט חיץ (נדיפים) 5 פעמים להסיר מחוברת באופן רופף וחיידקים planktonic.
  2. לייבש את השבבים הללו בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שבו האוויר זורם במתינות.
  3. מיד לאחר הייבוש, למקם שבב על המקום הטעינה, המהווה 20 מ"מ מלוע CO 2 לאורך ציר של סילון. הטה את ציר הסילון לזווית 40 מעלות.
  4. הגדר את לחצי הקיפאון של CO 2 ו- N 2 גז 5.3 מגפ"ס ו -0.7 מגפ"ס, בהתאמה, באמצעות רגולטורים בלחץ גז.
  5. החל הסילון אירוסול על החלק המרכזי של השבב. אירוסולים לבן כולל CO מוצק 2 צריךלהיות גלוי. הפעל "על" שסתום סולנואיד עבור CO 2 למשך 5 שניות ולאחר מכן הפעל אותו "off" במשך 3 שניות (מחזור: סעיף 8) באמצעות מעת לעת מתג נשלט באופן ידני. אם טיהור חנקן צריכה לשמש, להדליק את שסתום סולנואיד עבור אספקה רציפה של N 2.
  6. פנקו את שבבי עם CO 2 אירוסולים במשך 16, 40, ו -88 שניות עם ובלי הטיהורים חנקן. שמור שבבי ללא טיפול שולטת שלילית.

ניתוח 5. עבור יעילות הסרה

  1. הכן 1 כתם חומצה פלואורסצנטי ירוק מיקרומטר גרעין (גל עירור / פליטה: 480/500 ננומטר) במים DI להכתים תאים חיידקיים בשלט וצ'יפס שטופלו בתרסיס.
  2. מניחים את שבבי בתמיסה מכתים.
  3. דגירה שבבי באינקובטור ללא אור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. לאחר הדגירה, לשטוף בעדינות את השבבים עם מים זורמים DI להסיר צבע ניאון מוגזם.
  5. ייבש את wi השבביזרימת N 2 גז ה.
  6. קח קרינת תמונות מיקרוסקופיות של 5 שדות אקראיים של תצוגה (321 × 240 מיקרומטר 2) עבור כל שבב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, עדשה 40X אובייקטיבית, מצלמת CCD.
  7. השג את עוצמת הקרינה עבור כל תמונה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כגון ImageJ. ב ImageJ, השתמש בפונקצית "רקע פחת" בתפריט "התהליך", ובחר "צפיפות משולבת" בחלון "מדידות גדר" בתפריט "לנתח". האם "המדידה" בתפריט "נתח" כדי להשיג את עוצמת הקרינה.
  8. חשבתי את היעילות ביופילם ההסרה פי הנוסחא הבאה: 100% × (אני שבבים מלאי - אני שבבי מטופלים) / (אני שבבים שליטים), שבו אני נמצא את עוצמת הקרינה חושב.
  9. להשיג את הממוצע ויעילות הסרה וסטיות תקן. השתמש ב4 שבבי לפחות עבור כל מקרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אירוסולים 2 CO שימשו כדי להסיר את פ putida Biofilms מ SUS304 משטחים (איור 1). רוב המשטחים היו מכוסות עם ביופילם לאחר 24 שעות של צמיחה. רוב ביופילם הוסר באמצעות CO 2 אירוסולים (איור 2). כצפוי, איור 3 מראה על עלייה יעילה ביופילם הסרה כזמן טיפול אירוסול CO 2 המוגבר. בפעם טיפול של 88 שניות, ליעילות ההסרה היה נחוש בדעתו להיות גבוה ככל 97.74% ו 98.29% עם ובלי טיהור חנקן, בהתאמה. טמפרטורת האוויר הייתה C ° 23-24 והלחות היחסית הייתה 26-50% כאשר ניסויי הניקוי נערכו.

איור 1
איור 1. סכמטי המציג את הסרת biofilm באמצעות אירוסולים CO 2. לאווירוסולים נוצרים כאשר גז בלחץ CO 2 גבוה מורחב adiabatically דרך נחיר ונטורי (0.4 מ"מ) ואת טמפרטורת הגז יורדת במהירות. אירוסולים במהירות גבוהה CO 2 אלה מוחלים על משטח מכוסה ביופילם. כאשר טיהור חנקן משמשת, גז N 2 מסופק באמצעות 8 חרירים סביב הנחיר המרכזי CO 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטי עבור 24 שעות תוצרת פ biofilms putida על 304 שבבי נירוסטה. השבבים טופלו אירוסולים 2 CO לזמני טיפול שונים (0, 16, 40, ו -88 שניות) ללא הטיהורים חנקן. תמונות בשחור-לבן נצבעו ירוק, ואת ברים סולם לבן עולה 50 מיקרומטר.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
יעילות הסרת איור 3. עבור פ biofilms putida מ 304 משטחי נירוסטה עם זמני טיפול אירוסול CO 2 שונים, עם ובלי הטיהורים חנקן. הנצילות הסרת חושבו בהתבסס על עוצמות הקרינה של biofilms. הברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats