Biofilmentfernung Kohlendioxid Aerosols Verwendung ohne Stickstoffspülung

1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
Published 11/06/2016
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Environment

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Hong, S., Jang, J. Biofilm Removal Using Carbon Dioxide Aerosols without Nitrogen Purge. J. Vis. Exp. (117), e54827, doi:10.3791/54827 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Vorbereitung der Oberfläche für die Bildung von Biofilmen

  1. Cut 1 mm dicken 304 Edelstahlplatten in Chips (10 × 10 mm 2) mit einem mechanischen Schneider.
  2. Führen Ultraschallreinigung der Chips in Aceton, Methanol und deionisiertem (DI) Wasser nacheinander für jeweils 10 min. Verwenden, um einen lösungsmittelbeständigen Behälter, die aus Substanzen wie Glas, organische Verunreinigungen zu entfernen.
  3. Spülen Sie die Chips mit DI-Wasser für 3-5 sec fließt.
  4. Trocknen Sie die Chips N 2 Gasfluss für 3-5 sec verwenden.

2. Herstellung der Bakterien-Kultur

  1. Nehmen Sie einen P. putida KT2440 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Südkorea) Lager gelagert in einem -80 ° C Gefrierschrank.
  2. Tauen Sie nach 1 min bei Raumtemperatur und die obere Schicht der gefrorenen Stammlösung wird zu Matsch. Tauchen Sie eine Schleife in die geschmolzene Schicht der Stammlösung.
  3. Verwenden Sie diese Schleife zu Streifen, die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Platte, die 1,5% Agar.
  4. Die Platte über Nacht bei 30 ° C, um die Bakterienkolonien wachsen.
  5. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte eine frische Schleife.
  6. Beimpfen von 10 ml LB-Brühe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit der Schleife die einzelnen Bakterienkolonie enthält.
  7. Inkubieren Sie die Brühe in einem Schüttel-Inkubator für 16 Stunden bei 30 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.

3. Bildung von Biofilmen auf der Oberfläche

  1. Pick-up jeder der hergestellten Chips mit einer Pinzette und tauchen sie in 70% Ethanol 5 mal für 1-2 sec je, um die Oberfläche jedes Chips zu sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass die Chips mit einer Pinzette während des Eintauchens gehalten werden.
  2. Tauchen Sie jeden Chip in autoklavierten DI-Wasser und in LB-Brühe sequentiell, 5-mal für 1-2 sec je, um die verbleibenden Ethanol zu entfernen.
  3. Legen Sie diese Chips in 6-Well-Kulturplatten mit 2 Chips und 5 ml LB-Medium pro Vertiefung.
  4. Verdünne die Bakterienkultur, bis die Konzentration in der LB-Brühe Lauf8 × 10 8 Zellen / ml (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge: ~ 0.8).
  5. Impfen jede Vertiefung mit 50 ul der verdünnten Bakterienkultur.
  6. Inkubiere die Platten bei 30 ° C ohne von Biofilmen für 24 h zur Bildung Schütteln.

4. CO 2 Aerosol Reinigung

  1. Tauchen Sie die Biofilm-gebildeten Chips in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (flüchtig) 5-mal zu entfernen lose befestigt und planktonischen Bakterien.
  2. Trocknen Sie diese Chips in einem Bio-Sicherheitsschrank, wo die Luft mild fließt.
  3. Unmittelbar nach dem Trocknen, stellen einen Chip auf dem Ladeplatz, der sich entlang der Achse des Strahls 20 mm von der Düse CO 2 ist. Kippen Sie die Strahlachse auf einen Winkel von 40 °.
  4. Stellen Sie die Staudrücke von CO 2 und N 2 -Gas auf 5,3 MPa und 0,7 MPa bzw. Gasdruckregler verwendet wird .
  5. Wenden Sie den Aerosolstrahl auf den zentralen Teil des Chips. Weiß Aerosole einschließlich der festen CO 2 solltesichtbar sein. Schalten "auf" das Magnetventil für CO 2 für 5 Sekunden, und schalten Sie es "off" für 3 sec (Zyklus: 8 sec) in regelmäßigen Abständen einen manuell gesteuerten Schalter. Wenn eine Stickstoff - Spülung verwendet werden muss, schalten das Magnetventil für eine kontinuierliche Zufuhr von N 2.
  6. Behandeln Sie die Chips mit CO 2 Aerosole für 16, 40 und 88 sec mit und ohne Stickstoffspülungen. Bewahren Sie Chips ohne Behandlung als negative Kontrollen.

5. Analyse für Abscheideleistung

  1. Bereiten 1 uM grüne Fluoreszenz Nukleinsäurefarbstoff (Anregungs- / Emissionswellenlänge: 480/500 nm) in DI-Wasser zu Bakterienzellen an der Steuerung und Aerosol behandelten Späne färben.
  2. Legen Sie die Chips in der Färbungslösung.
  3. Inkubieren der Chips in einem Inkubator ohne Licht bei 37 ° C für 30 min.
  4. Im Anschluss an die Inkubation spülen Sie vorsichtig die Chips mit DI-Wasser fließt übermäßige fluoreszierenden Farbstoff zu entfernen.
  5. Trocknen Sie die Chips with N 2 Gasstrom.
  6. Nehmen Sie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von 5 zufällige Sichtfelder (321 × 240 & mgr; m 2) für jeden Chip ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer 40 - fach Objektivlinse und einer CCD - Kamera.
  7. Besorgen Sie sich die Fluoreszenzintensität für jedes Bild eine Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ. In ImageJ und nutzen die "Subtract Background" -Funktion im Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Integrierte Dichte" in der "Set Messungen" Fenster in der "Analyse" -Menü. Haben die "Messung" im "Analyze" Menü, um die Fluoreszenzintensität zu erhalten.
  8. Berechnen Sie die Biofilmentfernungseffizienz nach der folgenden Formel: 100% × (I Kontrolle Chips - ich der behandelten Chips) / (I von Kontroll - Chips), wo ich die berechneten Fluoreszenzintensität ist.
  9. Besorgen Sie sich die durchschnittliche Abscheidegrade und Standardabweichungen. Verwenden Sie beimindestens 4-Chips für jeden Fall.

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Representative Results

CO 2 Aerosole wurden verwendet , um die zu entfernen , P. putida Biofilme aus SUS304 Flächen (Abbildung 1). Die meisten der Oberflächen wurden mit dem Biofilm nach 24 h Wachstum bedeckt. Der größte Teil des Biofilms wurde mit der CO 2 Aerosole (Abbildung 2) entfernt. Wie erwartet, 3 zeigt einen Anstieg der Biofilm - Entfernungseffizienz als die erhöhte Aerosolbehandlungszeit CO 2. Für die Behandlungszeit von 88 sec wurde die Entfernungseffizienz so hoch wie 97,74% und 98,29% mit und ohne Stickstoffspülung, jeweils bestimmt. Die Lufttemperatur betrug 23-24 ° C und die relative Luftfeuchtigkeit betrug 26 bis 50%, wenn die Reinigungsversuche durchgeführt wurden.

Abbildung 1
Abbildung 1 Schematische die Entfernung eines Biofilms unter Verwendung von CO 2 Aerosolen zeigt. Die Aerosole erzeugt bei Hochdruck - CO 2 -Gas wird adiabatisch durch eine Venturi - Düse (0,4 mm) expandiert und die Gastemperatur fällt schnell. Diese Hochgeschwindigkeits CO 2 Aerosolen auf eine Oberfläche aufgetragen mit einem Biofilm bedeckt. Wenn eine Stickstoffspülung verwendet wird, N 2 -Gas durch 8 Düsen rund um das zentrale CO 2 Düse geliefert wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Fluoreszenzmikroskopische Bilder für 24-Stunden-grown P. putida Biofilm auf Edelstahl 304 Chips. Die Chips wurden für verschiedene Behandlungszeiten mit CO 2 behandelt Aerosolen (0, 16, 40 und 88 sec) ohne Stickstoffspülungen. Monochrome Bilder wurden grün gefärbt, und die weißen Skala Balken zeigen 50 & mgr; m.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Entfernungseffizienzen für die P. putida Biofilme von den 304 rostfreien Stahloberflächen mit unterschiedlichen CO 2 Aerosolbehandlungszeiten mit und ohne Stickstoffspülungen. Die Entfernungseffizienzen wurden auf der Basis der Fluoreszenzintensitäten der Biofilme berechnet. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
304 stainless steel Steelni
(South Korea)
Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner Branson
(USA)
5510E-DTH
Luria-Bertani (LB) Becton, Dickinson and Company
(USA)
244620 500 g
Agar Becton, Dickinson and Company
(USA)
214010 500 g
6-well culture plate SPL Life Sciences
(South Korea)
32006
Ammonium acetate buffer Sigma-Aldrich
(USA)
667404 10 mM
Dual gas unit Applied Surface Technologies
(USA)
K6-10DG One nozzle for CO2 gas
& 8 nozzles for N2 gas
SYTO9 Thermo Fissher Scientific
(USA)
Invitrogen Excitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope  Nikon (Japan) Eclipse 80i
40X objective lens Nikon
(Japan)
Plan Fluor NA: 0.75
CCD camera  Photometrics
(USA)
Cool SNAP HQ2 Monochrome

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References

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24, (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21, (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51, (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100, (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86, (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87, (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41, (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28, (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28, (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19, (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25, (1), 37-57 (2007).

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