SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale
Biochemistry
 

Summary

소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC).

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Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).

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Abstract

생물학적 소각 X 선 산란 (BioSAXS)의 용액 구조, 입자 크기 및 형상, 및 고분자의 표면 대 부피 비율을 결정하는 데 사용되는 분자 구조 생물학에서 강력한 기술이다. 기술 등의 농도, pH 값, 이온 세기, 온도, 첨가제, 넓은 범위에 걸쳐 용액 상태의 매우 다양한 적용이지만, 단 분산 샘플 할 필요가있다. 이주의해야 할 점은 SAXS 빔라인에 액체 크로마토 그래피 시스템의 구현되었다. 여기서, 우리는 빔라인의 크기 - 배제 (SEC), 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC)의 상류의 통합을 설명하는 최적 배경 차감하고, 데이터 감소하는 다른 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 우리는 우리가 D5N의 헬리 케이즈 도메인으로 구성된 필수 우두 바이러스 단백질 D5의 단편에 사항을 유의 및 IEC-SAXS를 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 번째의 hexameric 구조를 보여주는 전체적인 형상 및 분자량을 결정전자 단백질.

Introduction

BioSAXS는 나노 크기의 물체 1-4의 형상을 결정하기위한 강력한 도구이다. 나노 크기 범위에서 고분자를 함유 한 용액에 의한 X 선의 산란이 매우 낮은 각도로 기록된다. 이 각도 범위는 글로벌 매개 변수에 대한 정보가 포함되어 관성 반경을; 가장 큰 입자 내 거리; 입자 형상; 및 폴딩, 변성, 또는 장애의 정도. 결정하는데 도움이되는 기술의 결정을 필요로하지 않고, 거대 분자가 이온 성 강도, pH가 이러한 요인의 지식 셀 특정 중요 파라미터를 흉내 낸 상태로 유지 될 수있다, 따라서 용액 내에서 유지하고, 예를 들면, 또는 관심의 단백질의 생리 학적으로 관련 올리고머 상태는 복잡한의 제안 된 모델의 유효성을 검사합니다. 다른 버퍼 조건에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 특성 누락 도메인 모델의 작성, 상 동성 모델을 정제하고, 디이산 접혀 펼친 상태의 종료가 빠르고 쉽게 5 행할 수있다.

유엔 해석 데이터가 발생할 수 있습니다 집계 또는 변성 샘플, 입자의 혼합물, 이기종 샘플, 방사선 손상, 버퍼 불일치 : 어떤 기술과 마찬가지로, BioSAXS는 본질적인 약점을 가지고있다. 많은 분석 방법의 경우, 묵시적 샘플을 실제로 얻는 것이 종종 어렵다 요구가 단 분산 인 것으로한다. 많은 경우에, 시료의 열화 미묘한 자체의 데이터를 검출 할 수없고, 데이터를 해석하는 시도가 부정확 또는 잘못된 결과를 제공한다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 SAXS의 조합은 데이터 품질을 보장하고 어려워 시료 6-11이 기술은 더 접근 할 수 있도록 다수의 빔라인에서 구현 하였다. 최근에, 우리는 온라인으로 이온 교환을 개발하여 레퍼토리에 새로운 방법을 추가크로마토 그래피 (IEC)는 SAXS 12 -coupled. 두 기술은 분석하기 이전에 불가능한 생물학적 입자들의 광범위한 SAXS를 개방한다. 사용되는 방법의 선택은 관심의 입자의 생물 리 학적 특성에 의존한다.

SEC는 겉보기 분자 질량의 적어도 10 % 차이가 분리된다 필요한 크기에 의해 고분자를 분리한다. 칼럼과 시료의 생리 학적 특성의 물리적 제한은 소수성 표면, 유연성, 안정성의 부족과 같이 또한 데이터 수집, 분석과 해석을 복잡.

은 IEC 칼럼, 따라서, 그들의 결합 친화도를 그 전하에 기초하여 분자를 분리하고, 이온 교환 크로마토 그래피는 대신 또는 SEC에 더하여 사용될 수있다. 총 전하를 용이하게 제어 EL 비교적 간단한 방법을 pH를 변경 또는 버퍼의 염 농도를 변화 제공함으로써 조작 될 수있다은 IEC 열에서 분자의 ution. 전하를 사용함으로써, 별도로 분리하기 어렵 유사한 종류 및 크기의 분자의 분리는, IEC에 일상적으로 수행 될 수있다. 또한, IEC 하나의 단백질을 변성의 위험을 가지고 농도 단계를 피할 수 있도록 희석하여 시료를 처리 할 수 ​​있다는 장점을 갖는다. 전하 분포가 높은 샘플에 의존 불행히도, IEC는 pH와 염 농도 (13, 14)에 대한 최적화가 필요합니다.

표현 정화, 또는 두 가지 모두 어려운 많은 단백질의 경우, 샘플의 낮은 양의 공부를 할 수 있습니다. 이는 효율적으로하고, 따라서, 손실을 정제 단계의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 이 때문에, 최종 정제 단계는 양호한 데이터 세트를 수집 할 가능성을 증가시키기 위해, 온라인 SAXS 데이터 취득 직접 종래이다.

이리우리는 선물 및 온라인 SEC-SAXS 및 IEC-SAXS를 비교합니다. 두 기술은 그르노블, 프랑스 15 유럽 방사광 시설 (ESRF)에서 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현되었다. 테스트 케이스로서, 우리는 다른 방법을 이용하여 구조적으로 분석 오히려 곤란했던 백시 니아 바이러스 단백질 D5의 D5N 및 헬리 케이즈 도메인을 사용 하였다. 백시 니아 바이러스는 Poxviridae 가족의 일원이며, 천연두 바이러스, 천연두의 원인으로 98 % 동일하다. 백시 니아 시스템을 사용하여, 우리는 필수 헬리 케이즈 - 프리 메이스의 D5에 여기에 집중 복제 장치를 연구한다.

D5는 시스테인 클러스터 영역 (입술. 240-345) (16) 다음에 N 말단 archeo 진핵 프리 메이스 (AEP) 도메인 (16) 95-kDa 단백질이다. 또한 C 말단쪽으로 D5N 도메인 (입술. 340-460)을 제공 항상 D5 형 헬리과 관련된, 그리고 마지막 세 수퍼 패밀리 (SF3) 헬리 케이즈 도메인된다 (입술. 460-785)을 17 (Figur전자 1A). D5의 헬리 케이즈 도메인 꽉 DNA에 결합하는 데 필요한 hexameric 환 구조를 구축한다. 감사 및 EM SAXS 최근 연구에 상기 프리 메이스의 저해상도 구조 및 헬리 케이즈 도메인은 이제 18 알려져있다.

여기, 우리는 D5의 (323-785 잔류 물) C- 말단 단편의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 ESRF의 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현 된 온라인 크로마토 그래피 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

D5 삭제 단백질 1. 오프라인 준비에 대한 설명 및 샘플 생성

참고 : 18 바와 같이 D5 323-785 구조 (도 1a)의 클로닝 발현 및 정제 하였다.

  1. pProEx HTB 벡터에 구조를 복제
    1. 제조자의 권고 다음 5'- GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 '와 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'프라이머 및 효소와 PCR 반응 혼합물을 사용 D5R상에서 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행한다.
    2. 제조자의 권고에 따라 스핀 컬럼을 통해 PCR 단편을 정제 하였다.
    3. 버퍼 조성물 및 배양 시간에 대한 제조자의 권장 사항에 이어 PCR 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 제한 효소로 소화 플라스미드.
    4. , 0.5X TAE 완충액 1 % 아가 로스 겔에서 단편 (20 mM 트리스, 10 mM의 아세트산을 실행0.5 mM의 EDTA) 및 DNA의 염료로 젤을 염색.
    5. 자외선에 젤을 노출.
      주의 : 개인 안전 장비를 착용! 제조자의 권고에 따라, 분해 된 PCR 단편의 밴드 분해 된 플라스미드를 절단하고 겔 정제 스핀 컬럼 키트를 사용하여 DNA를 정제.
    6. , 빠르고 라이 게이션 키트를 사용하여 제조자의 권장 사항에 따라 플라스미드로 정제 된 PCR 단편을 결찰.
    7. 플라스미드 증폭에 최적화 능력 세균에 연결 반응에서 열 쇼크를 통해 제품을 변형.
      1. 박테리아의 유리 병에 결찰 제품의 절반을 추가합니다.
      2. 얼음에서 20 분 동안 반응 튜브 인큐베이션.
      3. 30 초 동안 42 ° C에서 튜브를 품어.
      4. 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
      5. 1 루리아 베르 타니의 ㎖ (LB) 국물 (밀러) 항생제없이 추가하고 세포를 1 시간 동안 37 ° C에서 복구 할 수 있습니다.
      6. 16,100 XG FO에서 세포를 스핀 다운R 3 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 s와 매체의 대부분을 제거합니다.
      7. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 함께 LB 한천 플레이트에 세포를 확산하고 식민지 하룻밤 37 ° C에서 성장 할 수 있습니다.
    8. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 LB의 3 mL의에 식민지를 넣고 하룻밤 동안 160 rpm으로 떨고, 37 ° C에서 문화를 성장.
    9. 플라스미드를 추출 할 수있는 미니 프렙 키트의 지시 사항을 따르십시오.
    10. 시퀀싱을위한 플라스미드의 샘플을 보내 돌연변이의 부재에 대한 올바른 삽입 순서를 분석 할 수 있습니다.
    11. pProEx HTB D5 323-785 단백질 발현에 최적화 된 박테리아로 구성 (1 μL를 사용하여 단계 1.1.7의 단계를 따릅니다) 변환. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 함께 LB 한천 플레이트에 박테리아를 확산.
    12. 시작 문화를 만들려면, 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 LB 300 mL에 하나의 식민지를 넣고 160 R 진탕, 37 ° C에서 박테리아를 성장오후 하룻밤.
  2. 암피실린의 존재 LB의 12 × 1 L 접종 (50 μg의 / mL의 최종), 37 ° C에서 pProEx HTB D5 323-785 세균 스타터 문화의 20 mL를 각각 OD까지 600 = 0.3에 도달한다. 18 ° C까지 온도를 줄이고 1 mM의 IPTG와의 OD 600 = 0.5에서 발현을 유도. 160 rpm으로 18 ° C에서 밤새을 떨고, 문화를 품어.
  3. 50,000 XG에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 균체를 수확. (50mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤) 1X 프로테아제 억제제와 25 단위 (용해 완충액 약 150 ㎖의 세균 펠렛을 재현 탁 U) / 10 ㎖ DNase의. 얼음에 초음파를 Lyse 통해 박테리아 (1 인치 프로브, 50 % 전력, 0.5의 펄스, 0.5의 일시 정지, 3 배에서 5 분).
  4. 니켈 친 화성 칼럼 (니켈 열, 1.5 mL의 침대 볼륨)에 뜨는을로드하고, (b)의 10 열 볼륨 (CV)로 세척버퍼 inding (50mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤), 세척 완충액 10 CV (50mM 트리스 - 염산 [pH가 7, 1 M의 NaCl, 10 MM의 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤)과 이미 다졸 워시 10 CV (50mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 30 mM의 이미 다졸). D5 323-785 용출 (20 mM 트리스 - 염산을 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 200 mM의 이미 다졸).
  5. 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) -polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)을 통해 다른 정제 단계를 검사한다.
    1. 의로드 2-20 μL 각 정제 단계 흐름을 통해 1 배 로딩 염료와 혼합 : 10에 (배 4 % SDS, 20 % 글리세롤, 120 mM 트리스 - 염산 [pH가 6.8, 0.02 % 중량 / 블루 볼륨 브로 모 페놀) % SDS 젤 버퍼를 실행 배속 램 믈리 200 V에서 실행할 (25 mM 트리스, 0.192 M 글리신, 0.1 % SDS).
    2. 즉시 사용 쿠마시 블루 용액으로 염색 겔.
  6. EXChange 제조업체의 설명서에 따라 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼를 바인딩 용출 된 단백질의 버퍼.
  7. 단백질 용액에 담배 식각 바이러스 핵 포함-A 엔도 펩티다아제 (TEV 단백질 1 밀리그램 / 100 mg)을 첨가하여 그 태그를 절단. 실온에서 밤새 인큐베이션.
  8. SDS-PAGE를 수행하여 소화를 체크한다 (단계 1.5 참조)
  9. 바인딩 버퍼의 니켈 열 평형. 단백질 용액이 통과하여 관류를 수집하는 동안 이미 다졸 세척 완충액 2 CV으로 비드 세척하자.
  10. 0.5 ㎖의 최종 부피로 원심 농축기를 이용하여 단백질을 농축시킨다.
  11. 겔 여과 완충액으로 평형화 크기 - 배제 컬럼에 집중된 단백질을 주입 (20 mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤, 1 mM의 디티 오 트레이 톨 [DTT).
  12. 0.5 ㎖의 분획에 흐름을 모아서 연결.
  13. 피크 샘플에 ​​의해 단백질의 존재를 확인 및 순도SDS-PAGE를 수행한다 (단계 150 참조).
  14. D5 323-785의 용출 피크의 분수를 결합합니다. 20 mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT의 단백질 용액 5 ㎖에 대해 (일정 트리스 및 DTT 농도를 유지하면서 25 mM의 염화나트륨을 시료 5 % 글리세롤 묽은 제 20 mM 트리스 - 염산 [pH가 7 및 1 mM의 DTT 5 mL를 첨가 한 후 20 mM 트리스 - 염산 [pH가 7, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 20 ㎖를 추가한다.
  15. 이온 교환 컬럼에 샘플을로드합니다. 버퍼 사용 A (20 mM 트리스 [pH가 7, 25 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 및 완충액 B (20 mM 트리스 [pH가 7, 1 M의 NaCl, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 25 mM 내지 1 M.하는 염 구배를 형성
  16. 1.5 ㎖의 분획에 용출 된 단백질을 수집한다.
  17. SDS-PAGE를 수행하여 피크 샘플에서 단백질의 존재 및 순도를 확인한다 (단계 150 및도 1b 참조)
  18. 0.5 ㎖의 최종 부피로 원심 농축기에서 단백질 용액을 Reconcentrate.
  19. ReruN 겔 여과 버퍼 크기 - 배제 컬럼에 단백질 농축 (20 mM 트리스 - 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT는 단계 1.11 참조).

2. 데이터 수집

참고 : 가능한 한 빨리 요청 빔 시간. ESRF의 경우, 사용 가능한 액세스 유형에와 신청서를 제출하는 방법에 대한 가이드 라인에서 찾을 수 있습니다 :
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . 제안의 수용과 실험에 초대 한 후, 모든 참가자들은 안전 교육을 완료해야합니다. 훈련의 검증 후, 샘플에 필요한 안전 정보와 함께 실험에 대한 빔라인을 방문 연구자를 선언합니다 (ESRF 사용자 포털을 통해) "A 형"을 작성하십시오. 실험을 논의하기 위해 지역 담당자에게 문의하십시오.

  1. SEC-SAXS 데이터 수집
    참고 : ONL에 대한오프라인 정제, BM29에 설치된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인라인 탈기, 이진 펌프, 버퍼 선택 및 그라디언트, 오토 샘플러, 자외선 VIS 배열 photospectrometer 및 conductometer위한 밸브로 구성되어 있습니다. 이는 직접 SAXS 노출 부 (19)의 유출을 통해 모세관에 부착된다.
    1. 옆 겔 여과 버퍼의 1 mL를 넣습니다. 증권 거래위원회 (SEC) 시스템에 버퍼 병을 연결합니다 (기본값은 포트 A)입니다.
    2. 사용되는 컬럼에 따라 유량을 선택. 주 : 여기에서 사용되는 크기 - 배제 컬럼의 경우, 유속은 0.1 mL / 분이다. 칼럼의 최대 압력을 정의 배압을 기록해, 적어도 1.2 CV에 수집 시간을 설정합니다.
    3. 은 "자동 제거"기능을 통해 펌프 및 상류 튜브를 플래시합니다.
    4. 시스템이 버퍼로 채워질 때까지 기다렸다가 열을 연결합니다. 적어도 1.5 CV를 전달하여 열 평형.
    5. 연동송아지와 때문에 방사선 손상에 신호의 변화를 제어하는 ​​시료 교환기를 사용하여, 단계 2.1.1 방치 버퍼를 측정한다. 버퍼에는 방사선 손상이없는 경우에만 계속한다.
    6. HPLC 모드 빔라인 제어 시스템을 전환. 프레임 당 1 초에 200 프레임을 수집, 버퍼의 테스트 실행을합니다. 합산 된 강도 음모에 검출기에 의해 주어진 카운트 수를 기록합니다.
      주 : 신호가 이전에 측정 된 버퍼 일치해야하고 시간의 합산 된 세기는 일정하게 유지한다. 신호가 일치하지 않거나 일정하지 않을 경우, 시스템의 이상 평형이 요구된다.
    7. 적어도 10 분 동안 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 13,000 XG에서 샘플을 스핀 다운.
    8. (제공)을 HPLC 호환 유리 병에 시료를 입력하고 자동 분사기에 넣어. 잘 위치를합니다.
    9. 사용자 안전 교육에 설명 된대로 표준 절차를 사용하여 실험 허치을 연동.
    10. 에 로그인하고 빔라인 제어 소프트웨어를 통해 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다.
    11. "빠른 배치"기능을 사용하여 HPLC 시스템을 프로그래밍합니다. 2.1.10 단계에서 생성 된 폴더의 UV 데이터의 저장 위치를 ​​설정한다. 같은 폴더에 ASCII 파일을 저장, 자외선 데이터의 자동 ASCII 변환을 활성화해야합니다.
      1. 사출 볼륨과 잘 위치를 선택합니다. "시작"버튼을 눌러 대기열에 측정을 추가합니다. 이 소프트웨어는 일괄 처리를 저장 요청합니다. 저장하기위한 준비하지만,이 자동으로 측정을 시작으로, "저장"버튼을 누르지 마십시오.
    12. 빔라인 제어 소프트웨어에서 데이터 수집 매개 변수를 설정합니다. 총 데이터 수집 시간 단계 2.1.2에서 정의 된 획득 시간 약간 초과되도록 프레임의 수를 선택한다.
    13. 안전 셔터를 열고 빔라인 제어 소프트웨어를 사용 SAXS 데이터 수집을 시작한다. 데이터 코르 있는지 확인치구 인수했다. 단계 2.1.6에서 수집 된 데이터에 새로 수집 된 데이터를 비교하고 요약 강도 계수의 수는 최소 100 프레임에 대해 일정하게 유지 단계 2.1.6에서 값과 일치하는지 확인합니다.
      1. 단계 2.1.11 제조 같이 SEC가 "저장"버튼을 누름으로써 실행 시작하고, 사출 완료 UV 및 데이터 수집이 시작되면 camserver 소프트웨어에 표시되는 프레임 번호를 기록.
    14. 데이터 수집 후, 오픈 "데이터 수집"탭을 ISPyB 데이터베이스 (20)를 열고 데이터 세트 및 자동 분석 (21)의 결과에 액세스하려면 "이동"버튼을 누릅니다.
  2. IEC-SAXS 데이터 수집
    NOTE 대신 일반적 IEC 실험에인가되는 연속적인 선형 구배, 완충액 B의 양이 미리 설정 한 단계 씩 증가시키는 단계적 구배를 사용한다.
    1. SAMPL에 대한 HPLC 프로그램 만들기전자 무료 버퍼 실행. 단계적 구배 0 % B 완충액에서 시작하여 버퍼 (B)의 100 %에 도달 할 때까지 두 CV 후 5 % 포인트 증가하는 프로그램.
    2. 옆으로 각 버퍼의 일부를 넣습니다. 포트 A에 저염 버퍼 A와 포트 B에 높은 소금 버퍼 B와 하나 병을 연결합니다
    3. 유량을 선택하고, 컬럼의 압력 한계 아래로 유지 (본 예에서는, 1 mL / 분).
    4. 단계 2.1.3에서와 같이, "자동 제거"기능을 이용하여 펌프 상류 튜브를 세척.
    5. 저염 완충액 A에서 평형화 시스템 (단계 1.15 참조) 이온 교환 컬럼을 연결한다. 열이 완전히 (적어도 1.5 CV)를 평형 될 때까지 기다립니다.
    6. 단계 2.1.5에서와 같이, 샘플 체인저를 사용하여 방사선 손상에 대한 버퍼 A와 B를 검사하는 단계 2.2.2에서 따로 버퍼를 사용합니다.
    7. 버퍼 단계 2.1.6에서와 같이 열 나오는 확인합니다. 단계 2.2.6 기록 버퍼 (A)의 신호에 신호를 비교한다. 다시 참고합산 된 강도 음모의 카운트 수입니다.
    8. 버퍼 실행을위한 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다.
    9. HPLC 시스템 모드에서 설정 데이터 수집. 총 데이터 수집 시간이 IEC 런의 총 시간을 초과하도록 프레임의 수를 선택한다 (단계 2.2.1 참조).
    10. 안전 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작합니다. 제대로 진행되었는지 확인하고 요약 강도가 최소 100 프레임에 대해 단계 2.2.7에서 언급 한 값으로 일정하게 유지 한 번 확인.
    11. HPLC를 소프트웨어의 "단일 실행"기능을 사용하여 단계 2.2.1에 프로그래밍 된 단계적 그라데이션을 시작합니다. 주사의 경우,이 단계에서 어떤 샘플을 주입하지하기 위해 -1로 바이알 수를 설정합니다. 프로그램이 시작으로 획득 한 프레임 수를 기록합니다.
    12. 샘플 실행을위한 HPLC 프로그램을 만듭니다. (버퍼 B. 추정의 0 % 단계 1.1.5에서 오프라인 측정 된 각각의 피크 버퍼 B의 비율부터 단계적 그라데이션을 프로그램 (그림 1C) 각을 설정합니다. 2.5 CV 100 % 완충액 B에서의 마지막 단계를 추가한다.
    13. 적어도 10 분 동안 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 13,000 XG에서 샘플을 스핀 다운.
    14. 20 mM 트리스 - 염산 [pH가 7, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT로 혼합하여 완충액 A (25 mM)을의 염 농도로 희석 D5 323-785.
    15. 컬럼에 수동으로 샘플을로드합니다. 기포의 형성을 방지하기 위해 펌프를 일시 중지 한 후 희석 된 샘플의 버퍼에게 입력 튜브를 넣는다. 직접 흐름을 통해 열에서를 수집 탐지기에서 열을 분리합니다.
      1. 샘플 용기는 거의 비어있는 경우, (상기 튜브를 이동시키면서 다시 펌프 일시) 완충액 A에 입력 튜브 돌아가서 컬럼 튜브에서 샘플을 전송하는 완충액 A 펌핑 재시작. 전체 샘플되면로드 버퍼 A의 2 CV를 통과하고 검출기에 열을 다시 연결합니다.
    16. 샘플 실행을 위해, 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다.
    17. 안전 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집이 제대로 진행되는지 확인하고 합산 강도가 최소 100 프레임에 대해 단계 2.2.7에서 언급 한 값으로 일정하게 유지 한 번 확인.
    18. 단계 2.2.12에 프로그래밍 된 단계적 그라데이션을 시작 HPLC 소프트웨어의 "단일 실행"기능을 사용합니다. 주사의 경우,이 단계에서 어떤 샘플을 주입하지하기 위해 -1로 바이알 수를 설정합니다. 프로그램이 시작으로 획득 한 프레임 수를 기록합니다.
    19. 열기 ISPyB (20)의 "데이터 수집"하고 Enter 키를 눌러 데이터 세트 및 자동 분석 (21)를보고 "이동".
    20. 은 "Postrun 분석"소프트웨어를 통해 ASCII 형식으로 HPLC 시스템에서 UV 데이터를 내 보냅니다.

삼.SEC-SAXS 데이터 감소 및 분석

  1. 은 "이동"버튼을 눌러 ISPyB 데이터 수집의 데이터를 연다. SAXS 데이터 수집 프레임 개요에서 결정은 용리 피크에 대응한다. 선회 반경이 피크에 걸쳐 안정적인지 확인합니다.
  2. 자동 버퍼 보정이 제대로 수행되었는지 확인합니다. 22 파일들을 평균 SAXS 실험 데이터로 조작을 수행하는 프로그램에 피크의 중앙 부분으로부터로드 프레임. 그리고, 자동으로 생성 된 버퍼 파일을로드하고 평균 프레임의 높은 Q 지역 버퍼 프레임 일치 여부를 확인한다.
  3. 정량적 CORMAP 테스트 (23)를 사용하여 피크에 걸쳐 획득 프레임을 비교한다.
    1. 관심 영역을 덮는 프레임의 자동 생성 감산 (* _sub.dat 파일)을로드.
    2. 은 "스케일"버튼을 누름에 의해 서로 이들을 규모.
    3. 비교 예"데이터 비교"기능을 사용하여 전자. 피크에 걸쳐 프레임 사이에 체계적인 변화가 없어야합니다.
  4. 관심의 모든 * -_ sub.dat 프레임을 열고 "병합"버튼을 사용하여 병합 및 .DAT 형식으로 병합 된 파일을 저장합니다.
  5. 저해상도의 데이터 이후 자르기위한 기니 어 범위에서 첫 번째 데이터 점을 주목 프로그램의 "관성 반경"공구 선회 반경을 결정한다.
  6. 프로그램에서 "거리 배포"도구를 사용하여 한 쌍의 거리 분포 함수를 결정하고 gnom.out 같은 결과이 .out 파일을 저장합니다.

4. 순이 론적 모델링

  1. 유닉스 시스템에서, 대칭 제한없이 40 X 순이 론적 모델 재건 프로그램을 실행합니다. 새 폴더를 만들고에 gnom.out 파일을 복사합니다. 다음과 같이 프로그램을 실행합니다 :
    대한 ((I = 1; 전 = 40 <; 내가 ++)); gnom.out -ms -p dammifp1_ $ 내가 dammif 할; 디하나
  2. 유사하게, 두 번째 폴더의 6 배 대칭에 대한 대칭 제한이있는 순이 론적 모델 재건 프로그램을 실행 :
    대한 ((I = 1; 전 = 40 <; 내가 ++)); 할 일 dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ 내가; 끝난
  3. 모든 AB 론적 모델 재건 프로그램 출력 파일을 정렬 (* -1.pdb). 단계 4.1 및 4.2에서 두 개의 폴더에서 damaver -a * -1.pdb를 실행합니다.
  4. 모든 모델 (damaver.pdb)뿐만 아니라 적절한 분자 시각화 소프트웨어 (26)의 올바른 볼륨 (damfilt.pdb)에 필터링 된 모델의 조합을 열고을 비교합니다.
  5. 텍스트 편집기에서 damsel.log 파일을 엽니 다. 파일의 아래쪽의 "기준"으로 표시된 모델은 가장 대표적인 모델이다.

5. IEC-SAXS 데이터 감소, 분석 및 모델링

  1. 실험 SAXS 데이터 파일 (22) 조작을 수행하는 과정에서, 약 50 SAXS의 각각 혼합 공정으로부터 프레임로드버퍼 실행은 "AVERAGE"버튼을 눌러 결과를 저장합니다.
  2. ISPyB 통해 제공 자동 처리 결과에 기초하여, 실험의 프레임 식별 단백질의 용출에 대응하고 관성의 (예비) 반경 피크 걸쳐 안정적인지 확인.
  3. 실험 SAXS 데이터 파일 조작 프로그램 (22)에 프레임을로드하고 버퍼 프레임 (단계 5.1 참조) 수행으로,이를 평균. 다음, 단계 5.1에서 생성 된 버퍼 파일을로드하고, 피크 평균 일치 버퍼를 찾는 (4.2 내지 -1 이상) 높은 Q 영역을 비교한다.
    주 : 피크와 버퍼의 평균 사이의 오프셋 체계적인이 없어야합니다. 샘플 곡선이 두 버퍼 곡선 사이에 떨어질 것 같으면, 평균을 계산하여 곡선을 보간.
  4. 피크 분획의 평균 산란 커브의 베스트 매치로 식별되는 버퍼를 빼고 얻어진 subtr 저장행동 파일입니다. 또한, 감산 에러 마진을 추정하기 위해 이전 및 다음 단계에서 혼합 평균 버퍼 곡선을 감산하여 곡선을 생성한다.
  5. 반복 피크의 좌측 및 우측 반부에 대해 각각 5.3 및 5.4 단계 피크에 걸쳐 신호의 안정성을 확인하기 위해 단계 5.4에서 이들의 결과를 비교.
  6. 단계 단계 5.4에서 세 공제 곡선 3.5 및 3.6을 따르십시오.
  7. 세 공제 곡선의 결과를 비교한다.
    참고 : 뺄셈의 오차 한계 내에서 강력한 유지 만 결과를 신뢰할 수 있습니다.
  8. 의 단계 5.3에서 확인 된 가장 감산 4.1 및 4.2 단계로 모델링을 수행합니다.
  9. 모델을 정렬 4.5 4.3 단계로 가장 대표적인 하나를 식별하십시오.

결과 6. 비교

  1. 증권 거래위원회 (SEC)의 대표 모델 12 3D 구조를 중첩하는 프로그램을 실행 (4.5 단계)을P6 대칭 D IEC-SAXS 데이터 (5.9 단계) : supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. model_sec.pdb 및 분자 시각화 소프트웨어에 model_iec-r.pdb를 가져옵니다.
  3. modelsec.pdb의 .fir 파일 및 스프레드 시트에서 modeliec-r.pdb를 열고 실험과 계산 산란 곡선의 2 차원 그래프를 만들 수 있습니다.

Representative Results

모델없이 불변 분석의 결과는 표 1에 나열되어있다. D5 323-785 SEC-SAXS 데이터의 분석은 338 kDa의 대 345 kDa의의 (a Porod 분석)에서 분자 질량 추정을 보였다 IEC-SAXS을 사용하여 관찰 하였다. 둘 다 헥사 6 회 53.5 kDa의 (321 kDa의)의 예상 질량과 일치한다. 두 데이터 세트의 순이 론적 모델링은 더 부과 대칭으로 수행되었다 (SEC-SAXS : χ 2 = 0.88, IEC-SAXS : χ 2 = 3.1) 및 C6 대칭을 사용하여 (SEC-SAXS를 : χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ (2) = 4). 모두 복원을위한 산란 데이터 전체 맞는 두 가지 경우 (도 1DE)에 비교할 때, C6 대칭을 가정 할 수있다. 따라서, 모델 (SEC 부분적으로 차단 된 중앙 채널 표시와 육각 콘형 구조에 대응한다 :도 1 층;을 IEC : 그림 1H). 평균화 전에 개별 모델 시험이 방해가 평균화 처리의 이슈가 될 가능성이 있음을 보여준다.

그림 1
그림 1 : SAXS 데이터 분석 및 비교 D5 (323)의 -785 (그림 참조 12 및 18에서 적응). D5 단백질 및 D5 323-785의 A) 도식 도메인 구조. B)이 세 개의 피크의 표시와 함께 오프라인 이온 교환 크로마토. 오렌지 곡선 : 280 nm의 (노소), 파란색 곡선에서 흡광도 : 피크에서 버퍼 B의 버퍼 B. 백분율의 비율이 표시됩니다. C) 온라인 이온 교환 크로마토 그램. B.에서와 같은 색상 키 또한, 측정 된 강도는 녹색으로 표시됩니다. 실험 산란 곡선 AND SEC-SAXS D) 및 IEC E) 323-785 D5의 데이터 분석에 의해 얻어진 모델 곡선을 계산 하였다. SEC 데이터와 G) IEC 데이터에 기초 D5 323-785의 F) 비드 모델. 증권 거래위원회 (SEC)와 IEC 모델 H) 오버레이. F의 패널) H에)는 분자 시각화 소프트웨어 (24)를 사용하여 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 수집 매개 변수
악기: ESRF BM29
파장 (Å) 0.99
Q-범위 (A-1) 0.0032-0.49
샘플 대 검출기 거리는 2.864 m
노출 시간 (초) 프레임 당 1
농도 범위 NA
온도 (K) 293
탐지기 필라투스 1M (Dectris)
플럭스 (광자 / s의) 1 × 10 (12)
빔 크기 (μm의 2) 700 × 700
D5 323-785, 삼성 전자 구조 매개 변수
I 0 (cm -1) 기니 어에서] 0.0237
RG (Å)에서 기니 어] (48)
R의 g Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g 0.77-1.24
D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] (145)
페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1) 0.02-0.17
Porod 볼륨 V p를 (3) 분산에서] (570 ± 5) (10) (3) ×
분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] (345)
시퀀스에서 단량체 미스터 계산 (kDa의) (321)
D5 323-785, IEC에 대한 구조 매개 변수
I 0 (cm -1) 기니 어에서] 0.386
RG (Å)에서 기니 어] 46.5 ± 0.1
R의 g Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g 0.44-1.29
D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] (120)
페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1) 0.03-0.18
Porod 볼륨 V (& #197; 3) 분산에서] (577 ± 5) (10) (3) ×
분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] 339
시퀀스에서 hexameric 미스터 계산 (kDa의) (321)

표 1 : SAXS 데이터 파라미터. SAXS 표는 데이터 수집 및 분석의 파라미터를 요약 한 것이다.

Discussion

많은 고분자를 들어, 크로마토 그래피를 이용하여 최종 정제 단계는 양질의 데이터 세트를 획득 할 SAXS 데이터 수집에 앞서 요구된다. 그러나 모든 샘플은 안정적으로 유지; 그들은 올리고머 상태의 혼합물에 통합 또는 재 평형하는 경향이있을 수 있습니다. 따라서, 빔라인에 온라인 최종 정제 단계는 최고 품질 SAXS 데이터를 얻기 위해서 정제 및 데이터 수집 사이의 시간을 최소화하기 위해 요구된다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC-SAXS 또는 IEC-SAXS 최적 샘플 품질을 얻기 위해 선택 될 수있다. 여기서, 헬리 케이즈 / 프리 메이스 D5 유래의 단백질 구조에서 두 가지 기술이 설명되고 논의된다.

SEC-SAXS 데이터의 수집은 점점 더 표준화되고 많은 BioSAXS의 빔라인에 사용할 수 있습니다. 데이터 분석, 특히 배경 뺄셈은 비교적 간단하고 쉽습니다. 그러나, 안정된 버퍼 신호및 거대 분자 화학 종의 충분한 분리가 필수적 남아있다. 따라서, 충분히 열을 평형화하기에 충분한 시간을 확보하는 것이 중요하다. 이 방법의 실패이자, 낮은 농도, 방사선에 민감한 버퍼의 단백질과 유사한 크기의 영구적 인 오염 물질에 기인 할 수있다.

실제로, 초기 SEC-SAXS 대부분의 고분자 샘플 선택의 방법으로 사용될 가능성이 높다. 여전히, 많은 정제 프로토콜은 오염물 또는 응집의 존재로 인해 종래 IEC 단계를 필요로한다. 각 농도 및 크로마토 그래피 단계 (30 % ~ 50 %로 추정) 샘플 및 시간 손실과 연관되어 있음을 감안할 때, 직접 IEC-SAXS 유리하다. SEC에 의해 정제 할 수없는 샘플 인해 비슷한 크기의 "오염"의 존재 또는 필요한 농도 심각 골재 IEC-SAXS 항상 더 적합한 방법이 될 것이기 때문에 그 것이다. 또한, 높은 유속 지원많은 IEC 칼럼 정제 및 측정 사이의 전송 시간을 줄일 수있다. 여기에 제시된 실시 예에서, IEC 신중 염 농도 단계를 선택하여 오염물로부터 D5의 323-785 가까운 피크의 분리를 허용하는 단계 용출로 사용 하였다. 원칙적으로, 단계의 수는 무제한이지만, 사실상, 피크 당 적어도 한 단계가 필요하며, 너무 많은 생략 선택되어야한다. 전술 한 배경 차감 법의 경우, 매칭을 찾기 위해 다른 버퍼 조성물의 상대적으로 높은 수를 측정하는 것이 중요하다.

두 기술의 공유 단점은 정확한 단백질 농도 정보의 부족이다. 이 때문에, 앞으로 산란을 기반으로 정확한 질량 측정 할 수 없습니다. 예 D5 323-785 같은 구형 단백질의 Porod 부피는 매우 유연 또는 무질서 단백질하지만 덜 정확한 질량 추정 불구 대안을 제공한다이 방법은 유효하지 않습니다.

여기에 제시된 단계적 구배 IEC-SAXS 방법의 변형 대신에 선형 구배를 사용하는 것이다. 이 단계적인 용출을 이용하여 서브 - 피크를 분리 할 목적으로 상기 선형 그라데이션 방법에서 많은 단계에서 작동하는 것이 가능하지만, 이는 전적으로 SAXS 시작 전에 피크를 분리하기 위해 신중 구배 조건을 최적화 할 필요 실험. 이 방법에 배경 차감 프레임 현명 할 수 있고, 각각의 프레임들의 비교에 의해 확인 될 수 있지만,보다 고급 데이터 처리를 요구하고, 전용 소프트웨어는 아직 존재하지 않는다.

그것은 거대 분자 종의 분리를 결정한 적당한 컬럼의 선택은 두 가지 기술에 중요하다. 이온 교환 컬럼 종류 및 밀도에 변화하면서 크기 배제 컬럼은, 적재 능력, 분리 거대 분자의 크기 범위 및 해상도에 차이가자신의 고정 요금.

여기에 제시된 프로토콜은 간단 원칙적으로 다른 SAXS 빔라인 인에 ESRF 빔라인 BM29, 적응, 특정된다. 주요 요건은 생성 할 수있는 충분히 높은 X 선 광속 초 이하의 범위에서 합리적인 신호 - 대 - 잡음 데이터를 획득하기에 적합한 검출기 (이상적인 단일 광자 카운팅), 온라인 액체 크로마토 그래피 시스템이다 그라디언트. 정확한 구현은 물론, 로컬 빔라인 환경에 의존 할 것이다.

두 가지 방법을 사용 D5 323-785에서 얻어진 결과는 약간 다르다. 관성 반경은 SEC 데이터보다 IEC 데이터 약간 작고, 산란 곡선의 국부 최소치는 약간 큰 산란 벡터로 전환된다. 이는 IEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 약간 더 작고 SEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 이상임을 의미한다. 이 ㄱ 있습니다SEC에 정제 된 시료 중의 오염물에 덜 정제과 측정 사이의 시간에서 샘플 준비의 차이 (IEC 빠른 경우), 또는,에 의한 전자. 두 가지 방법으로 완전히 독립적으로 얻어진 비드 모델 (그림 1H) 비교할 수 있습니다. D5 323-785은 예상 중공, hexameric 구조 (18)를 보여줍니다.

결론적으로, 온라인으로 이온 교환 및 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 SAXS 6,7,9-12,25,26에 직접 결합 될 수있다 중요한 생화학 적 정제 방법이다. IEC-SAXS 데이터의 배경 차감 약간 SEC-SAXS보다 더 어려운 애매한이지만, 그럼에도 불구하고있다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC 및 IEC-SAXS 모두 고유의 장점 종 분리의 최적화를 허용한다. 유효성 검증 단계 (설명) 정확하게 관찰되어, 결과 데이터를 분석 할 수있는 재치 제공H 신뢰도 및 모델은 커뮤니티 내에서 사용 가능한 표준 도구를 사용하여 결정될 수있다. 함께, 두 가지 기술 표준 정적 측정을 통해 액세스 할 수없는 데이터를 산출, 생물학적 거대 분자의 광범위한 온라인 분리 할 수 ​​있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio model reconstruction program
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108

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References

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