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Summary

पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग के भीतर और ऊतकों या उपचार समूहों के बीच fluorescently लेबल यौगिकों के रिश्तेदार सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक तेजी से विधि है। इसके विपरीत, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति ऊतक विज्ञान, जबकि अधिक श्रम गहन, लेबल अणुओं का पूर्ण ऊतक स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है।

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McGowan, J. W. D., Bidwell, III, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. J. Vis. Exp. (118), e54987, doi:10.3791/54987 (2016).

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Abstract

फ्लोरोसेंट लेबलिंग दोनों इन विट्रो में और vivo में प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म के तहत लेबल अणुओं के भाग्य की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रिया है। फ्लोरोसेंट जांच प्रशासित बड़े अणुओं की जैव वितरण, जहां एक छोटे अणु फ्लोरोसेंट लेबल के अलावा कैनेटीक्स या यौगिक की जैव वितरण को प्रभावित करने की संभावना नहीं है निर्धारित करने में विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। तरीकों की एक किस्म जैव वितरण उस प्रयास की राशि की आवश्यकता में काफी भिन्नता है और जांच करने के लिए मौजूद है, जिसके परिणामस्वरूप माप पूरी तरह से मात्रात्मक हैं, लेकिन संयोजन के रूप में कई तरीकों का उपयोग जैव वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और प्रभावी प्रणाली प्रदान कर सकते हैं।

पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग एक तरीका है कि जल्दी से ऊतकों के भीतर और ऊतकों या उपचार समूहों के कई प्रकार के बीच फ्लोरोसेंट अणु के रिश्तेदार सांद्रता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक इमेजिंग बेनी का प्रयोगबरकरार ऊतकों के भीतर लिव-जानवर या पूरे अंग इमेजिंग, प्रतिदीप्ति के लिए डिज़ाइन किया गया प्रपत्र आगे की प्रक्रिया के बिना निर्धारित किया जा सकता है, समय और श्रम की बचत समग्र जैव वितरण की सही तस्वीर प्रदान करते हुए। यह प्रक्रिया एक परिसर के ऊतक विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए प्रयास प्रयोगों में या कई विभिन्न यौगिकों की तुलना के लिए आदर्श है। दूसरी तरफ मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान आदेश लेबल यौगिकों का एक मात्रात्मक उपाय बनाने के लिए ऊतकों की व्यापक आगे की प्रक्रिया की आवश्यकता है। सही जैव वितरण का आकलन करने के लिए, ब्याज के सभी ऊतकों, कटा हुआ होना चाहिए स्कैन, और आदेश ऊतकों या समूहों के बीच तुलना करने में मानक घटता के सापेक्ष विश्लेषण किया। मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान ऊतकों के भीतर पूर्ण यौगिक सांद्रता निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक है।

यहाँ, हम वर्णन कैसे दोनों तरीकों साथ प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न तरीकों प्रशासन एक की क्षमता का आकलन करने के लिएएन डी यौगिक संशोधनों को निशाना बनाने और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए 1 fluorescently लेबल अणुओं देने के लिए।

Introduction

फ्लोरोसेंट लेबलिंग, यौगिकों की जैव-वितरण का निर्धारण उपकरणों की एक श्रृंखला में कई प्रयोगशालाओं के लिए आम है कि प्रयोग करने के लिए एक आसानी से उपयोग किया और प्रभावी तरीका है। Fluorophores व्यापक रूप से उपलब्ध अपेक्षाकृत सस्ती हैं, और तरंग दैर्ध्य, कि इस तरह के कई लेबल अणुओं के हस्तक्षेप के बिना एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म में आते हैं। अधिकांश fluorophores लक्ष्य यौगिकों पर विभिन्न समूहों के लिए प्रतिक्रियाशील विकार के लिए chemistries की एक श्रृंखला है, और विकार की प्रक्रिया आम तौर पर प्रतिक्रियाशील साइटों के सबसे प्रकार के लिए सीधा है। इसके अतिरिक्त, उपकरण fluorescently लेबल यौगिकों के मापन के लिए आवश्यक कई प्रयोगशालाओं में आम हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, लगे, और स्लाइड स्कैनर सब अलग अलग परिस्थितियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के उपयोग अत्यधिक सुलभ बना रही है। फ्लोरोसेंट लेबल अक्सर जैव वितरण और दोनों विवो और पूर्व viv में यौगिकों के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंलाइव इमेजिंग उपकरणों, ऐसे IVIS स्पेक्ट्रम इमेजर, के रूप में और मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान 2,3 के साथ ओ।

रहते इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग के उपयोग के उपयोग और जल्दी tissues4 की आगे की प्रक्रिया की आवश्यकता के बिना लेबल यौगिकों के रिश्तेदार सांद्रता का एक सटीक तुलना की क्षमता पैदा करने के अपने आसानी के कारण समय अधिक बढ़ गया है। हालांकि, जबकि पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग आसान विश्लेषण और तुलना के लिए अनुमति दे सकते हैं, यह एक ऊतक के भीतर पूर्ण यौगिक सांद्रता के एक मात्रात्मक उपाय उत्पन्न नहीं करता है। यह बरकरार अंगों के भीतर रोशनी बिखरने प्रभाव के कारण है। प्रकाश बिखरने (और, एक हद तक कम करने, absorbance के लिए) ऊतक आकार और घनत्व से भिन्न होता है के बाद से, पूरे अंग इमेजिंग बड़े या घने अंगों में ऊतक के स्तर के मूल्यवान समझना सकते हैं। पूर्ण एकाग्रता मापन के लिए उपयुक्त मानकों को तैयार करने में भी मुश्किल है, क्योंकि एक मोटाई की नकल करना चाहिएऔर प्रत्येक व्यक्ति के अंग के घनत्व। दूसरी ओर, पूरे अंग इमेजिंग एक एजेंट के रिश्तेदार ऊतक का स्तर प्राप्त करने का एक तेजी से विधि है, और यह (जैसे दवा को निशाना बनाने के अध्ययन के रूप में) कई संबंधित अणुओं के रिश्तेदार जैव वितरण की तुलना के लिए आदर्श है। एक वैकल्पिक रणनीति, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति ऊतक विज्ञान, तकनीक एक मात्रात्मक autoradiography की विधि से निकाली गई उपयोग एक परीक्षण एजेंट 5,6 के पूर्ण ऊतक स्तर को प्राप्त करने के लिए है। एक कल्पना डिवाइस में एक पूरी जानवर या अंग रखने के बजाय, मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान की आवश्यकता है कि प्रत्येक ऊतक कटा हुआ हो, स्लाइड, स्कैन पर मुहिम शुरू की है, और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया। परीक्षण एजेंट के मानक तैयार किया है और अंग नमूने के रूप में एक ही मोटाई में कटा हुआ है। एक ही मोटाई के सभी अंगों और मानकों के काटने से, प्रकाश बिखरने या absorbance के कारण परिवर्तनशीलता समाप्त हो रहा है, और ऊतक प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक वक्र के लिए फिट हो पूर्ण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए कर सकते हैंराशन। हालांकि इस पद्धति, जब ठीक से किया है, मात्रात्मक है, यह भी श्रम प्रधान और आसानी से mishandled है। मात्रात्मक ऊतक विज्ञान और श्रम की लागत काफी अधिक से अधिक जटिल प्रकृति को देखते हुए, जब पूरे अंग इमेजिंग की तुलना में, यह जांच करने के लिए जहां प्रत्येक प्रक्रिया जब fluorescently लेबल यौगिकों की जैव-वितरण की जांच का उपयोग करने के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक है सार्थक हो जाता है। इस प्रोटोकॉल, कैसे इन तरीकों को एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता कुशलता rhodamine- लेबल Elastin तरह पॉलीपेप्टाइड (ELP) के जैव वितरण तुलना करने के लिए, के साथ या SynB1 या गूंथना सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के अलावा बिना का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है के माध्यम से intranasal (में) और नसों (चतुर्थ) प्रशासन मार्गों।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी पशु उपयोग मिसिसिपी विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु और ऊतकों का उपचार

  1. प्रशासन और बलिदान
    1. 5 मिनट के लिए 3% isoflurane का उपयोग जानवरों anesthetize और पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के अभाव को देख कर संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। आँखों के लिए पशु चिकित्सा मरहम लागू जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए।
    2. पशु वजन और एक 1.5 एमएल ट्यूब में एक 50 मिलीग्राम / या तो rhodamine- लेबल ELP, SynB1-ELP, या जैसे-ELP की खुराक किलो पिपेट। बाद के चरणों में मानक घटता के निर्माण के लिए प्रशासित लेबल यौगिकों के 100 μL बचाओ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि मानकों के आदेश फ्लोरोसेंट लेबलिंग दक्षता में परिवर्तनशीलता के कारण मतभेद से बचने के लिए जानवरों को दिलाई लेबल प्रोटीन का एक ही बैच से बनाया जा। ठीक ढंग से पृष्ठभूमि fluores हटाने के लिए आदेश मेंबाद में प्रतिदीप्ति माप से cence, एक अनुपचारित पशु इलाज जानवरों के रूप में एक ही तरीके / अभिकर्मकों का उपयोग बलिदान किया जाना चाहिए।
    3. एक चतुर्थ इंजेक्शन पहले से 1 वर्णित के रूप में या तो पूंछ नस या ऊरु नस (जो कमर में एक 1 सेमी चीरा के माध्यम से पहुँचा है) का उपयोग कर प्रशासन। पीड़ानाश के लिए, यदि एक कमर चीरा, 5 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक पर Carprofen subcutaneously प्रशासन, और एक घाव क्लिप के साथ बंद होने से पहले चीरा साइट के लिए sensorcaine लागू होते हैं। intranasal (IN) मार्ग के माध्यम से प्रशासन के लिए, लापरवाह स्थिति में जानवरों की जगह।
    4. एक 2-μL पिपेट का उपयोग करना, लेबल परिसर के एक 1-μL बूंद आकर्षित। संक्षेप में nares के लिए उपयोग की अनुमति के लिए संज्ञाहरण कॉलर से पशु के सिर स्लाइड।
    5. पिपेट की नोक एक भी Nare के उद्घाटन के लिए जगह है और धीरे-धीरे सवार दबाना, छोटी बूंद नाक गुहा में Nare नीचे चलाने के लिए अनुमति देता है। हर 1 मिनट दोहराएँ, nares हर बूंद बारी जब तक पूरी खुराक विज्ञापनसेवा करने लगी।
      नोट: अधिकतम मात्रा में के माध्यम से प्रशासित 10 से अधिक नहीं होनी चाहिए - चूहों के लिए 15 μL।
    6. लापरवाह स्थिति में जानवरों के लिए उन्हें एक एक व्यक्ति के पिंजरे में जाने से पहले अंतिम प्रशासन के बाद 10 मिनट के लिए संज्ञाहरण के तहत छोड़ दें।
      नोट: जानवरों के पहुंच से बाहर मत छोड़ो जब तक वे पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए।
    7. 1 घंटे बाद प्रशासन, जानवरों के रूप में पहले फिर से anesthetize और पीबीएस (210.0 मिलीग्राम / एल एच 2 4 पीओ, 9,000.0 मिलीग्राम / एल सोडियम क्लोराइड, 726 मिलीग्राम / एल ना 2 HPO 4 .7H 2 ओ) का उपयोग transcardial छिड़काव के माध्यम से उन्हें बलिदान 10 एमएल / 20 एमएल की कुल के लिए मिनट।
      नोट: ऊतकों से सभी रक्त को दूर करने के बलिदान पर जानवरों का छिड़काव लेबल यौगिकों के extravascular सांद्रता निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। छिड़काव अभिकर्मकों पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं और लगातार रखा जाना चाहिए। यज्ञ की विधि के अनुरूप होना चाहिएसमूहों के भीतर। बलिदान के विभिन्न तरीकों, वाहिका के भीतर रक्त के स्तर पर अलग ऊतकों की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बदलने में परिणाम कर सकते हैं।
  2. ऊतकों के संग्रह
    1. के रूप में हटा दिया ऊतकों rinsing के लिए ऊपर वर्णित पीबीएस तैयार करें।
      नोट: यदि एक और बफर छिड़काव तरल के रूप में इस्तेमाल किया गया था, एक ही बफर में ऊतकों कुल्ला।
    2. सरल विच्छेदन के द्वारा हृदय, फेफड़े, पेट, जिगर, तिल्ली, गुर्दे और निकालें। संक्षेप में पीबीएस में कुल्ला करने से पहले प्रयोगशाला का उपयोग कर शुष्क थपथपाना या अधिक नमी दूर बाती और इमेजिंग चटाई पर ऊतकों को रखने के लिए पोंछे।
    3. माउस सिर काटना और हड्डी कटर या rongeurs का उपयोग खोपड़ी के शीर्ष हटा दें। संदंश का प्रयोग, ध्यान से मस्तिष्क को हटा दें, घ्राण बल्ब बरकरार रखे हुए हैं। कुल्ला, सूखी, और प्रदान की इमेजिंग चटाई पर जगह है।
    4. तेजी से इंजेक्शन 7 के माध्यम से रीढ़ की हड्डी को दूर करने के लिए, पीबीएस के साथ एक 10 एमएल सिरिंज भरने और एक dulled 18 गेज सुई देते हैं।
      नोट: 18 गेज फिट बैठता हैकई माउस लाइनों के वयस्क स्पाइनल कैनाल। आवश्यक व्यास जानवर आकार के साथ अलग अलग होंगे।
    5. प्रवण स्थिति में पशु रखें, यह सुनिश्चित करना है कि शिरच्छेद स्थल पर स्पाइनल कैनाल के उद्घाटन सफाई से काटा जाता है और रक्त के लिए स्वतंत्र है।
    6. स्पाइनल कॉलम भर से त्वचा निकालें। तेज हड्डी कटर या कैंची का प्रयोग, काठ अनुभाग सीधे कूल्हों को व्याख्यान चबूतरे में स्पाइनल कॉलम के माध्यम से कटौती।
    7. संक्षेप में पीबीएस के साथ यह कुल्ला स्पाइनल कैनाल कल्पना करने के लिए। धीरे स्पाइनल कैनाल में सुई डालने।
      नोट: सुई सुखद महसूस करना चाहिए और कुछ धीमी रोलिंग आगे और पीछे प्रविष्टि के दौरान की आवश्यकता हो सकती है। सुई ढीला महसूस करना चाहिए, एक अधिक व्याख्यान चबूतरे कट या बनाया जा सकता है एक बड़ा व्यास सुई की जरूरत हो सकती है।
    8. अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग, डाला सुई आसपास स्पाइनल कॉलम के लिए दबाव लागू होते हैं। मध्यम और लगातार दबाव के साथ सवार दबाना। रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में व्याख्यान चबूतरे खोलने की अक्षुण्ण बाहर फेंकना होगास्तंभ।
      नोट: पूरी तरह हटाने, rinsing, और सभी प्रमुख अंगों यथोचित 5 में पूरा किया जा सकता है के सूखने - 7 मिनट। इस छोटे से समय पीबीएस में बढ़ाया भंडारण, जो प्रकाश को अत्यधिक जोखिम और ऊतकों से लेबल प्रोटीन की लीचिंग में हो सकता है के लिए जरूरत से बचाता है।

2. पूरे अंग पूर्व vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग

  1. इमेजिंग पैरामीटर
    1. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करो। अधिग्रहण के नियंत्रण कक्ष के नीचे सही में, "प्रारंभ" क्लिक करें।
    2. के तहत "इमेजिंग मोड," "फ्लोरोसेंट" चेकबॉक्स का चयन करें। के तहत "जोखिम समय," "ऑटो चयन करें।"
    3. के तहत "binning," का चयन करें "" छोटे और 2 एफ / बंद करो निर्धारित किया है।
    4. 535 एनएम उत्तेजना और 580 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें।
      नोट: यह प्रयोग किया जाता है लेबल के आधार पर अलग अलग होंगे।
    5. "देखें बी के फील्ड" का चयन करें और targe सेट0.3 सेमी करने के लिए टी ऊंचाई।
      नोट: यह ऊतकों के आधार पर imaged किया जा अलग अलग होंगे।
    6. एक बार जब तापमान सूचक हरे रंग बदल जाता है (मशीन अर्थ पूरी तरह से आरंभ), बशर्ते कि काले रंग की पृष्ठभूमि चटाई पर ऊतकों जगह है, यह सुनिश्चित करना कि ऊतकों पूरी तरह से एक दूसरे से अलग हो रहे हैं। इमेजर में चटाई प्लेस, यह सुनिश्चित करना कि सभी ऊतकों चयनित क्षेत्र ग्रिड के भीतर हैं। इस तरह पूरे जिगर के रूप में बड़ी और गैर-समरूप ऊतकों, बाहर रखा जाना चाहिए ताकि के रूप में पालियों के ओवरलैप कम करने के लिए।
      नोट: ऊतकों एक समूह में एक साथ व्यवस्थित किया जा सकता है, एक भी जानवर या एक समान प्रकार के सभी ऊतकों को समायोजित करने के लिए एक छवि की इजाजत दी। इस विश्लेषण और संगठन आसान है पर बाद में आता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता में बड़े मतभेद विभिन्न ऊतकों के बीच मौजूद हैं, तो यह उन्हें छवि को व्यक्तिगत रूप से या एक ही ऊतक प्रकार के समूहों के रूप में करने के लिए सबसे अच्छा है, के रूप में एक जोखिम समय सभी ऊतक तीव्रता के लिए आदर्श नहीं हो सकता है।
    7. "मोल" क्लिक करें।
    8. इमेजिंग के बाद, तुरंत ऊतकों को हटाने और दुकान या उन्हें, मात्रात्मक ऊतक विज्ञान के लिए फ्रीज के रूप में चरण 4 में उल्लिखित।

3. मानक और इमेज प्रोसेसिंग

  1. मानक
    1. पीबीएस में, 15 dilutions की कुल के साथ, पशुओं के उपचार में इस्तेमाल किया मूल एकाग्रता से शुरू प्रत्येक प्रोटीन की दो गुना धारावाहिक dilutions पैदा करते हैं।
      नोट: एकाग्रता रेंज की उम्मीद है और ऊतक सांद्रता शामिल करने के लिए उद्देश्य और शुरुआती एकाग्रता के आधार पर मूल नमूना के अतिरिक्त dilutions आवश्यकता हो सकती है, करना चाहिए।
    2. एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में प्रत्येक मानक के पिपेट 100 μL। शुद्ध पीबीएस में से एक अच्छी तरह से शामिल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का एक उपाय प्राप्त करने के लिए।
    3. छवि ऊतक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल एक ही मानकों के साथ मानकों।
    4. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर "उपकरण पट्टी" के तहत "रॉय उपकरण," में चयन ब्याज की "क्षेत्र (आरओआई) "सर्कल और अच्छी तरह से एक के आसपास रॉय आकर्षित। कि रॉय अन्य भरा कुओं की सभी में कॉपी और क्लिक करें "ROIs उपाय।"
    5. अन्य मानकों के मूल्यों से शुद्ध पीबीएस की औसत उज्ज्वल दक्षता में मूल्य घटाना; इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति हटा। एक तितर बितर भूखंड पर ज्ञात एकाग्रता के खिलाफ मूल्यों प्लॉट।
      नोट: रैखिक प्रवृत्ति लाइन के परिणामस्वरूप समीकरण तो रिश्तेदार प्रतिदीप्ति मूल्य की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. इमेज प्रोसेसिंग
    1. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, मुक्ताकार रॉय उपकरण का चयन करें और व्यक्तिगत ऊतकों से प्रत्येक के आसपास ROIs आकर्षित। "उपाय" क्लिक करें।
    2. औसत उज्ज्वल दक्षता माप जिसके परिणामस्वरूप के साथ, मूल्यों प्रत्येक ऊतक प्रकार के इलाज जानवर से मापा जाता घटाना और पहले से निर्मित मानक वक्र पर उन मूल्यों साजिश है।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप रिश्तेदार प्रतिदीप्ति मूल्यों की एक त्वरित और सटीक स्नैपशॉट प्रदानलेबल परिसर के biodistribution।

4. मात्रात्मक ऊतक प्रोटोकॉल

  1. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तैयार करना और ऊतकों की बर्फ़ीली
    1. बनाने के लिए या पर्याप्त आकार चुना ऊतकों फ्रीज करने के लिए और cryostat के कंटेनर खरीद इस्तेमाल किया जाएगा। लपेटकर एल्यूमीनियम एक उचित आकार और आकार की वस्तु के चारों ओर पन्नी में अच्छी तरह से काम करता है।
    2. सूखी बर्फ के साथ एक 500 एमएल बीकर के आधे भरने और isopropanol के जोड़ने ~ 350 एमएल इतना है कि वहाँ सूखी बर्फ के ऊपर पर्याप्त तरल आंशिक रूप से ठंड कंटेनर डूब रहा है द्वारा isopropanol और सूखी बर्फ का एक मिश्रण तैयार करें।
      नोट: तरल नाइट्रोजन अक्सर इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT), और एम्बेडेड ऊतकों के फ्रैक्चर में यह परिणाम है और बचा जाना चाहिए।
    3. अक्टूबर के साथ आंशिक रूप से ठंड कंटेनर भरें, यह सुनिश्चित करने के लिए कोई बुलबुले मौजूद होते हैं। बुलबुले हैं, तो संदंश का उपयोग कर समाधान से बाहर बुलबुले काम करते हैं या एक समान लागू करने।
    4. ऊतक निकालेंपीबीएस और से सूखी यह अच्छी तरह से, या तो धीरे से एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ या छू एक प्रयोगशाला में नाजुक ऊतकों के किनारों पोंछ और तरल दूर बाती करने की अनुमति देकर यह ठोक द्वारा।
    5. ठंड कंटेनर के अंदर अक्टूबर में धीरे ऊतक प्लेस, ऊतक के नीचे बुलबुले परिचय नहीं सुनिश्चित करने। एक बार ऊतक जगह में है, अक्टूबर जोड़ने जब तक ऊतक पूरी तरह से कवर किया जाता है।
    6. ठंड कंटेनर डूब के रूप में ज्यादा के रूप में isopropanol कंटेनर के अंदर अवगत कराया अक्टूबर के साथ संपर्क में आने की अनुमति के बिना संभव है। के रूप में लंबे समय के रूप में की जरूरत के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले पूरी तरह से रोक के लिए OCT और ऊतकों के लिए 90 एस (या संभावित बड़ा ऊतकों के लिए अधिक) - की अनुमति दें 30।
  2. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मानक तैयार करना।
    1. तैयार है और उचित रूप से प्रति बैरल के अंत को हटाने के द्वारा 1-एमएल एकल उपयोग सीरिंज लेबल, सिरिंज की पूरी लंबाई के एक व्यास है कि इस तरह के। इस जमे हुए सिलेंडर को बाद में बाहर धक्का दे दिया की अनुमति देगा।
    2. हमेंआईएनजी अक्टूबर, प्रशासित यौगिकों की एक 15-कदम दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के रूप में पहले से पीबीएस के साथ किया गया था, लेकिन 1 एमएल की अंतिम परिणामस्वरूप मात्रा के साथ। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्यों को हटाने के लिए शुद्ध अक्टूबर के एक नमूना शामिल करें।
    3. अक्टूबर के चिपचिपापन पर्याप्त मिश्रण कठिन बना देता है। ट्यूबों पलटना और अक्टूबर पूरी तरह से फिर से inverting से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। 20 बार एक वर्दी मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए - यह 10 दोहराएँ। मिश्रण के दौरान प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस पर और दूर मानक समाधान रखें।
    4. मिश्रण के बाद, फिर से पहले के रूप में, isopropanol और सूखी बर्फ का एक मिश्रण तैयार करते हैं।
      नोट: तरल नाइट्रोजन भी isopropanol / सूखी बर्फ के मिश्रण के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता सीरिंज जल्दी से हटा रहे हैं के बाद वे ठोस जमे हुए हैं प्रदान की है।
    5. सिरिंज में अक्टूबर मानक ड्रा, देखभाल करने के लिए संभव के रूप में कुछ बुलबुले के रूप में पेश करने का। अक्टूबर समाधान ड्राइंग के बाद, तुरंत isopropanol में सीधे सिरिंज डुबकी और समाधान पूरी तरह से फ्रीज करने की अनुमति देते हैं20 S - 10 के लिए सिरिंज के अंदर। के रूप में लंबे समय के रूप में आवश्यक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सीरिंज स्टोर।
  3. ऊतकों और मानकों का काटना
    1. दोनों ऊतकों और मानकों -20 डिग्री सेल्सियस में रखें और सभी नमूनों के तापमान में आने के लिए पर्याप्त समय देते हैं।
      नोट: आदर्श काटने तापमान आम तौर पर सबसे ऊतकों के लिए -10 डिग्री सेल्सियस सीमा के आसपास हो जाता है, लेकिन यह अंततः ऊतक आकार और वसा की मात्रा पर निर्भर करता है और अनुभव से परिष्कृत किया जाना चाहिए।
    2. एक cryostat का प्रयोग, 20 माइक्रोन मोटी स्लाइस में ऊतकों में कटौती और उन्हें स्लाइड पर माउंट, के रूप में पहले 8 का वर्णन किया। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स स्टोर और काटने के दौरान और स्कैनिंग जब तक उन्हें जितना संभव हो उतना प्रकाश से दूर रखना।
      नोट: यहाँ यह महत्वपूर्ण है कि वर्गों मापा जाना उचित रूप से ऊतक की पूरी मोटाई भर में वितरित कर रहे हैं।
    3. cryostat चक पर मानकों माउंट करने के लिए, फ्रीजर से सिरिंज ले और 3 के लिए बाहर गर्म - होल से 5 एसयह हाथ में डिंग। अक्टूबर सिलेंडर के एक छोटे वर्ग (~ 1 सेमी) तक सवार धक्का सिरिंज के बाहर है।
      1. एक razorblade का उपयोग करना, सिलेंडर के माध्यम से कट और चक पर लंबरूप जिसके परिणामस्वरूप सिलेंडर खंड जगह, अक्टूबर का उपयोग जगह में इसे धारण करने के लिए। यह विन्यास अच्छी तरह से परिभाषित हलकों में परिणाम चाहिए कटौती की जा रही।
    4. 20 माइक्रोन से कम सिलेंडरों स्लाइस, एक एकल स्लाइड पर प्रत्येक कमजोर पड़ने से एक टुकड़ा रखने, इतना है कि एक स्लाइड पूरे मानक वक्र का प्रतिनिधित्व करता है। स्कैनिंग के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर।
  4. स्कैनिंग और quantitation
    1. स्कैन सरणी सॉफ्टवेयर शुरू करें और क्लिक करें "543 लेजर" लेजर स्टार्टअप प्रक्रिया शुरू करने के लिए। 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें लेजर तैयार हो जाओ करने के लिए।
    2. एक बार लेजर तैयार है, -20 डिग्री सेल्सियस से स्लाइड्स निकालें और उन्हें एक बड़े, प्रकाश संरक्षित कंटेनर में ले जाने के तापमान में आने के लिए और 3 मिनट के लिए सूखी। इस SLI में नमी buildup को रोकने जाएगाडी स्कैनर।
    3. स्लाइड स्कैनर पर स्लाइड के गोदाम में स्लाइड लोड। 'स्कैन' पर क्लिक करें और चुनें "आसान स्कैन चलाते हैं।"
    4. 50 माइक्रोन के लिए संकल्प स्कैन सेट करें।
    5. "Fluorophore 'के तहत पहले चेकबॉक्स" का प्रयोग करें "का चयन करें और चुनें" TRITC। "80% करने के लिए पीएमटी लाभ निर्धारित।
      नोट: ये सेटिंग्स fluorophore और लेबल अणुओं की एकाग्रता पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे।
    6. बाएं हाथ की तरफ, यह सुनिश्चित करें कि क्षेत्र स्कैन पूरे स्लाइड भी शामिल है। "प्रारंभ" क्लिक करें।
    7. स्कैनिंग के बाद, "के रूप में बचाने के लिए," "फाइल" का चयन करें और फिर एक tif के रूप में छवि को बचाने के।
      नोट: ऊतकों और मानकों की स्लाइड्स में एक ही सेटिंग पर स्कैन किया जाना चाहिए।
    8. ImageJ में जिसके परिणामस्वरूप छवियों को लोड और ऊतकों और मानकों के आसपास ROIs का चयन करें। "विश्लेषण" टैब के अंतर्गत, क्लिक करें "सेट माप" का चयन करें और चुनें "ग्रे मूल्य मतलब है।"220; उपाय "।
      नोट: पिछले तकनीक के साथ के रूप में, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति सभी मापा मूल्यों से घटाया जाना चाहिए।
    9. एक मानक वक्र बनाने के लिए जाना जाता है एकाग्रता के खिलाफ मानकों से मतलब ग्रे मूल्य माप प्लॉट।
      नोट: ऊतकों से उत्पन्न माप प्रत्येक ऊतक के भीतर औसतन किया जाना चाहिए और कहा कि मानक वक्र पर साजिश रची ऊतक के भीतर एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए।

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Representative Results

एक दवा वितरण वेक्टर ELP और ELP के दो संस्करणों सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (SynB1-ELP और जैसे-ELP) 9 के साथ संशोधित रूप में जाना जाता है: नीचे डेटा तीन यौगिकों के वितरण का वर्णन है। सभी तीन यौगिकों tetramethylrhodamine-5-maleimide के साथ लेबल और दो प्रशासन मार्गों के माध्यम से वितरित कर रहे थे (और चतुर्थ)। इन प्रयोगों के लक्ष्य को निर्धारित करने के लिए जो यौगिक और प्रशासन मार्ग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 3 में अच्छी पैठ में परिणाम होता था।

चित्रा 1 ए प्रदर्शित करता प्रतिनिधि पूर्व vivo इलाज जानवरों से अंगों के पूरे अंग छवियों। गर्मी मानचित्र ओवरले ऊतकों के भीतर उज्ज्वल दक्षता में प्रतिदीप्ति स्तर को दर्शाता है। व्यक्ति के ऊतकों के आसपास है और उनके इसी मानक वक्र पर उन मूल्यों की साजिश रचने के ROIs ड्राइंग द्वारा, चित्रा 1 बी में सचित्र मानकीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों उत्पन्न कर रहे हैं। मानकीकृत fluorescenसीई मानों तो विभिन्न यौगिकों के रिश्तेदार सांद्रता का सटीक तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये आंकड़े सही विशिष्ट ऊतकों में प्रवेश पर ELP संशोधन के दोनों प्रभाव है, साथ ही प्रत्येक परिसर पर प्रशासन मार्ग के प्रभाव का वर्णन है। इन परिणामों के साथ, यह तुरंत स्पष्ट है कि प्रशासन के माध्यम से ELP वितरण सीएनएस तक पहुंचने के लिए सबसे प्रभावी संयोजन है।

जबकि इन परिणामों मदद सर्वश्रेष्ठ मर्मज्ञ यौगिक और वितरण पद्धति का निर्धारण, वे वास्तविक एकाग्रता या सीएनएस के भीतर यौगिकों के क्षेत्रीय स्थानीयकरण का वर्णन नहीं है। के रूप में यह चयनित मस्तिष्क क्षेत्रों के मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है मात्रात्मक ऊतक विज्ञान, इसलिए इन यौगिकों की जैव-वितरण का विवरण पूरा करने के लिए आदर्श है। चित्रा 2A ELP में इलाज जानवरों से एक प्रतिनिधि टुकड़ा प्रदर्शित करता है, और चित्रा 2 बी ROIs को अलग करने की मात्रा का ठहराव का वर्णनघ्राण बल्ब, गोलार्द्धों, और सेरिबैलम। इन आंकड़ों से यह स्पष्ट है, जबकि ELP प्रशासन में मार्ग द्वारा उच्च सांद्रता सीएनएस में हो सकता है, यह मुख्य रूप से घ्राण बल्ब और सेरिबैलम में इस करता है। इसके विपरीत, ELP छुड़ाया चतुर्थ कम कुल सांद्रता है, लेकिन यह भी उतना ही मस्तिष्क भर में वितरित किया जाता है। इन प्रशासित यौगिकों का लक्ष्य और अन्य अंगों में प्रभाव के लिए क्षमता पर निर्भर करता है, या तो में या चतुर्थ प्रशासन बेहतर विकल्प हो सकता है। यह मात्रात्मक ऊतक विज्ञान के अलावा बिना निष्कर्ष निकाला नहीं जा सका। तकनीकी तौर पर, मात्रात्मक ऊतक विज्ञान हर समूह के हर ऊतक में इस्तेमाल किया जा सकता था, लेकिन दोनों तरीकों को एक साथ उपयोग के द्वारा, जबकि अभी भी एक ही निष्कर्ष है, जिसके परिणामस्वरूप समय और श्रम की एक महान सौदा बचा लिया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: पूर्व विवो पूरे अंग प्रतिदीप्तिमाप। ए) ELP समूह से प्रतिनिधि छवियाँ। गर्मी के नक्शे पैमाने उज्ज्वल दक्षता के रूप में स्थापित किया गया था। बी) औसत उज्ज्वल दक्षता मूल्यों व्यक्ति ऊतकों है कि आदेश में जैव-वितरण की तुलना के लिए इस्तेमाल मानकीकृत प्रतिदीप्ति मूल्यों को उत्पन्न करने में एक मानक वक्र पर विश्लेषण किया गया चारों ओर ROIs के निर्माण से प्राप्त की। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 5 मिमी। (McGowan से संशोधित, एट अल;। नशीली दवाओं के डिजाइन, विकास, और थेरेपी; 2016) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मात्रात्मक ऊतक प्रोटोकॉल माप। ए) ELP आय या चतुर्थ इलाज टुकड़ा करने की क्रिया दिमाग 20 माइक्रोन मोटी द्वारा बनाई जानवरों के प्रतिनिधि छवि, स्लाइस ओ बढ़तेn स्लाइड, और फिर उन एक प्रतिदीप्ति स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर स्लाइड स्कैनिंग। बी), घ्राण बल्ब, गोलार्द्धों, और सेरिबैलम के आसपास ROIs के सृजन से प्राप्त मतलब ग्रे मूल्य के रूप में मापा जाता है और एक मानक वक्र के लिए फिट माइक्रोग्राम / एमएल एकाग्रता माप उत्पन्न करने के लिए औसत मूल्यों। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 5 मिमी। (McGowan से संशोधित, एट अल;। नशीली दवाओं के डिजाइन, विकास, और थेरेपी; 2016) यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

जबकि पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग आम तौर पर सीधा है, कुछ बुनियादी अवधारणाओं और तकनीकों के पालन जैव वितरण माप की सटीकता में सुधार कर सकते हैं। प्रकाश अनुभव के लघु तरंग दैर्ध्य सबसे ऊतकों में बिखरने और absorbance के एक उच्च डिग्री है, जो काफी प्रभाव डालता है लघु तरंग दैर्ध्य fluorophores की उपयोगिता। ये fluorophores गहरी ऊतक अध्ययन में आवेदन सीमित है, लेकिन वे सतह के ऊतकों में या आंख में लग प्रयोगों में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है। इसके विपरीत, प्रकाश की तरंग दैर्ध्य लंबे काफी कम बिखरने और absorbance से गुजरना है, अधिक से अधिक पैठ और मोटा ऊतकों 10 के साथ और अधिक सटीक परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप। Fluorophores जो दूर लाल और निकट अवरक्त (NIR) रेंज (उत्तेजना ~ 600 एनएम) स्पेक्ट्रम की गिरावट में आमतौर पर पूरे जानवरों या बड़ा ऊतकों के लिए चुना जाता है। इन लंबे तरंगदैर्ध्य fluorophores, विशेष रूप से आज़ादी की ऑटो प्रतिदीप्ति का उपयोग करते हुए प्रयोगों के लिएमुद्दों या सामग्री की संभावना एक महत्वपूर्ण विचार है। 600 एनएम रेंज - उदाहरण के लिए, मूषक के पित्ताशय की थैली के अंदर पित्त अत्यधिक ऑटो फ्लोरोसेंट 500 में तरंग दैर्ध्य है। क्योंकि यह बहुत जिगर मूल्यों तिरछा कर सकते हैं, यह अक्सर पित्ताशय की थैली इमेजिंग के लिए पहले दूर करने के लिए सबसे अच्छा है। वैकल्पिक रूप से, अगर बरकरार जिगर और पित्ताशय की आवश्यकता होती है, स्पेक्ट्रम की बहुत दूर के अंत में एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक fluorophore चुनने पित्त ऑटो प्रतिदीप्ति के प्रभाव को सीमित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, आम कृंतक Chows के कई unpurified अल्फला, जो स्पेक्ट्रम के मध्य और दूर-पर्वतमाला के दौरान अत्यधिक fluoresces होते हैं। चुने लेबल के उन तरंग दैर्ध्य के भीतर गिर जाते हैं और पाचन तंत्र imaged किया जा रहा है, आहार में परिवर्तन होने की संभावना सबसे अच्छा विकल्प है।

लाइव इमेजिंग सिस्टम सही मोटी ऊतकों, गैर समरूप और विशेष रूप से मोटी ऊतकों के साथ (जैसे, पूरे चूहा यकृत) को मापने के लिए तैयार कर रहे हैं, और अधिक सटीक माप बार बार कर सकते हैंएन ऊतक बाहर फैल रहा है, कि इस तरह के जिगर का पालियों जितना संभव हो कम ओवरलैप द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, के मामलों में ऊतकों ऊतक के कई पक्षों से लेबल अणुओं के एक बेहद विषम वितरण, इमेजिंग है और उन माप औसत सटीकता की वृद्धि हो सकती है, जहां। अंत में, ऊतक के प्रकार imaged किया जाना है, उन ऊतकों, और प्रशासित लेबल अणुओं के संभावित वितरण के साथ जुड़े सामग्री के ऑटो प्रतिदीप्ति ध्यान से आदेश उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है कि सीमा के साथ एक fluorophore का चयन करने में विचार किया जाना चाहिए जितना संभव हो उतना हस्तक्षेप।

जब मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान प्रदर्शन, वहाँ कई महत्वपूर्ण जानकारी को ध्यान में रख रहे हैं। विश्लेषण किया जा क्रम परिणाम सही होने के लिए, स्लाइस पूरे ऊतक या पूरे क्षेत्र में रखा जाना चाहिए। इसका मतलब यह है कि इन ऊतकों अन्य प्रक्रियाओं के लिए उपलब्ध नहीं होगा। इसे ठीक करने और दाग के बाद संभव हो सकता हैस्कैनिंग, लेकिन यह आम तौर पर सबसे अच्छा स्लाइस उन्हें स्कैनर, जो भविष्य धुंधला को प्रभावित कर सकते में डालने से पहले थोड़ा शुष्क करने की अनुमति है। इसी तरह, स्कैनिंग, तस्वीर विरंजन के कुछ स्तर के कारण होगा बाद में प्रक्रियाओं में संभावित संकेत को कम करने। नीचे की ओर माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए, बेहतर वर्गों आमतौर पर ऊतकों फिक्सिंग और सेक्शनिंग करने से पहले एक sucrose के समाधान में उन्हें equilibrating द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। हालांकि, इस प्रक्रिया का सबसे अच्छा निर्धारण और / या लंबे सुक्रोज के प्रभाव के कारण ऊपर मात्रात्मक ऊतक विज्ञान प्रोटोकॉल में बचा प्रतिदीप्ति तीव्रता पर soaks है। इसके अलावा, संकेत वर्तमान की राशि पर निर्भर करता है, स्लाइस तस्वीर विरंजन का अनुभव अगर परिवेश प्रकाश का भी निम्न स्तर को उजागर कर सकता है। स्लाइड ठंड और प्रकाश से दूर रखते हुए काफी जिसके परिणामस्वरूप माप की सटीकता में सुधार होगा। कुल मिलाकर, सावधान से निपटने की तैयारी काफी अंतिम परिणाम में सुधार कर सकते हैं।

वहाँ अन्य की एक किस्म हैतरीकों जैव वितरण और प्रशासित अणुओं है कि तकनीकी कठिनाई, throughput, सटीकता में व्यापक रूप से भिन्न की फार्माकोकाइनेटिक्स के अध्ययन के लिए कार्यरत हैं, और उपकरणों की आवश्यकता 11। मात्रात्मक immunoassays और bioactivity assays के दोनों तकनीकी रूप से जटिल हो सकता है और एंटीबॉडी या अभिकर्मकों प्रशासित अणुओं के लिए विशिष्ट आवश्यकता होती है, लागत और श्रम के लिए काफी जोड़ने कर सकते हैं। रेडियो आइसोटोप लेबलिंग पर आधारित कई तरीकों अतीत में इस्तेमाल किया गया है, सटीकता के साथ अलग है, लेकिन बड़े अणुओं को radioisotopes के एकीकरण, साथ ही डेटा खुद के संग्रह, महत्वपूर्ण तैयारी की आवश्यकता होती सकता है और अक्सर ऊतकों पूरी तरह से बेकार आगे के विश्लेषण के लिए 12 प्रदान कर सकते हैं। अंत में, पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित प्रभावी होना दिखाया अन्य तरीकों, आम तौर पर बस के लिए आवश्यक उपकरणों की कमी के कारण रोका जाता है। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित कुशलता वीं का निर्धारण करने के लिए संयोजन के रूप में दो तरीकों का उपयोग करताई आवश्यक उपकरणों की नियमित रूप से उपयोगी रूप के कारण एक त्वरित, लागत प्रभावी, सटीक, और आसानी से सुलभ तरीके से लेबल अणुओं की जैव वितरण।

इस विधि सीएनएस के लिए लेबल अणुओं के वितरण के लिए सबसे अच्छा वेक्टर और प्रशासन मार्ग की पहचान है, ऊपर डेटा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। पूर्व vivo डेटा से, ELP में प्रशासित और ELP प्रशासित चतुर्थ मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान के माध्यम से आगे लक्षण वर्णन के लिए पहचान की गई। मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान तो सीएनएस के विशिष्ट क्षेत्रों में लेबल अणुओं की सांद्रता प्रदान की इजाजत दी, अंतिम निष्कर्ष निकाला जा सके। दो तरीकों के साथ कई विशिष्ट यौगिकों की जैव-वितरण की एक विस्तृत जांच करने के लिए एक तेजी से और प्रभावी तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) Thermo Fisher T6027, A20342 Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline Sigma 1002243569 PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound Tissue-Tek 4585 Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum Perkin Elmer For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome Thermo For cryosectioning
Fluorescence slide scanner Perkin Elmer For slide scanning

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References

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