キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します

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Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

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Abstract

Introduction

食べるが不可欠です。しかし、このような過食症、拒食症または課しを過食する一般的な傾向として、摂食障害の結果食物摂取量の規制緩和は、個人と社会1、2、3にかかります。本研究の目的は、食物摂取の調節機構を明らかにし、障害の形成を回避するための戦略を提供することにあります。哺乳類のモデル生物を用いて、多数の研究が障害4、5、6食べに回路及び信号システムの役割の新たな洞察を提供してきました。それにもかかわらず、これらの疾患の根底にある神経細胞および分子基盤の我々の知識は、完成には程遠いまま。近年では、果実はフライキイロショウジョウバエは metabolisの規制に基本的なメカニズムの洞察を解明するための貴重なモデルシステムとなっていますM 7、8、9。 キイロショウジョウバエのためのキャピラリーフィーダー(CAFE)アッセイはクロバエ10、11にデティアーによって以前の仕事に触発され、2007年にシーモア・ベンザーのラボに設立されました。 CAFEアッセイは直接キイロショウジョウバエにおいて食物摂取を測定することが可能となります。この行動試験システムでは、ハエがバイアル内部に配置された段階的なガラスキャピラリー内に設けられた液体食品を食べます。毛管メニスカスの減少は蒸発し、食料消費を経て食品液の損失を示しています。ハエなしでバイアルによって蒸発速度を決定することは、食物摂取量の正確な定量化を可能にします。

CAFEアッセイは、 キイロショウジョウバエで摂食を測定するために使用されるいくつかの行動パラダイムの一つであり、研究者が、特定のために最も適切なものを選択する必要があります質問。特定のアッセイを使用するという決定は、次の点を考慮する必要があります提供食品の性質を。摂食状態;吸気口や栄養素の摂取と調査の食料消費や食品への応答の測定。

このレポートに記載されているようCAFEアッセイは、直立の給電条件で液体食料源の食物摂取量を、以下のに最適です。あるいは食物摂取量をバイアル中またはプレート上の着色された食物源のフライグループに対して測定することができます。ハエは通常、殺されたり麻酔給餌後と摂取色素の量は、分析法または染色された腹部の目視検査によって決定されています。ハエは、摂取後わずか30分で摂取された食物を排出し始め、したがって、この方法は、連続的なより長い摂食行動の解析12、13のために使用することは困難です。

これとは対照的にハエがするとき、吸収性色素そのまま保持されています放射性トレーサーでsが使用され、放射性同位体の消費は、シンチレーションカウンター14,15で採点されます。フライ消化器系による放射性標識の吸収は、長期的な食品摂取の測定が可能になりますが、ために非吸収と排泄トレーサー分子の消費量の過小評価につながる可能性があります。 キイロショウジョウバエの食物に対する応答を測定するための別のアプローチは、通常、食物摂取16で発生口先拡張応答(PER)です。このエレガントな方法は、食品の刺激に対する初期応答を測定するが、摂取量を記録しません。食物摂取は、動的に給電17,18の調節に重要である、いくつかの後の消化フィードバック信号を使用して、供給中に調整されます。いくつかの試みがPERアッセイで半自動化データ収集に近年なされています19、20アップ。 PERは、電気パッドまたは電極の組み合わせによって検出され、コンピュータを介してカウントされます。放射性同位元素の取り込みとPERアッセイを組み合わせることにより、このアッセイは違い18の供給量を検出する低感度によって制限されることを明らかにしました。ハエは、ガラスキャピラリーを用いて手動で供給された手差しアッセイ(MAFE)21は 、最近単固定化されたハエの食物摂取量を測定するために開発されました。 MAFEアッセイは、採餌給電開始の干渉を排除し、秒の時間分解能を有し、PERおよび食物摂取の開始は、アッセイにおいて独立して監視することができます。しかし、摂食行動の特定の側面( 例えば運動、モチベーション)に影響を与えるハエのどの固定化方法はまだ調査する必要があります。 ショウジョウバエ私の中で食物消費を測定するための異なるアッセイの優れた比較レビュー用lanogasterとデシュパンデとマルクスの報告を参照して、最も適切なものを見つけるの研究者を支援します 13、22。

CAFEアッセイは、上述の他のアッセイの欠点の一部を回避し、食物摂取の信頼できる測定を使用するシンプルさを兼ね備えました。ここで、CAFEアッセイの詳細な説明が提供され、我々は、蒸発を減少させるための簡単な設定の変更を示します。 2食品の選択アッセイ(短期・長期)とハエのショ糖の取り込みを含む代表的な結果が示されています。議論では、CAFEアッセイを実行するための別の方法で私たちの説明した方法を比較し、潜在的な限界を強調表示します。

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Protocol

1. CAFEアッセイ

注:実験バイアル、特定の蓋とマイクロキャピラリ:アッセイは3つのコンポーネントで構成されています。カバー付きプラスチック箱は、準備されたバイアルを輸送するために、より効率的に湿度を制御するために使用されます。

  1. キイロショウジョウバエ培養プラスチックバイアル(オプション8センチメートル高さ3.3センチ直径)アッセイ用チューブとして使用します。
  2. Oリング( 図1A、1B)を含む製造プレキシガラス蓋付きバイアルを密封します。負荷が軽くたたくことによって、または、空気の循環と水の供給を可能にし、スポンジ栓に穴を塞ぐ蓋の中央開口部(1.5センチ径)を通じて吹管、と飛びます。シックス小さい円錐状の開口部(0.4センチメートル上部直径、0.3センチメートル内径)は中央の穴を囲むと2のピペットチップフィット - 代わりに毛細血管を保持するために、20μLのボリュームを。 (蓋の技術的な詳細については、補足図を参照してください。)
    注:使用代わりに、私たちの原稿に使用されるカスタムメイドの蓋の毛細血管のための開口部を有するスポンジストッパー可能です。私達のカスタマイズされた蓋が落ちて毛細血管のリスクを最小限に準備されたバイアルの安全な取り扱いを可能にします。
  3. 液体食品を提示するために、1μLのマークを5μLのマイクロキャピラリーを使用しています。穴(赤い縁の付いた図1B)に先端を20μLピペットチップと挿入- 2の上部を切断することにより、蓋で円錐形の開口部で毛細血管を置きます。同じ開口部に20μLピペットチップ - 逃げるのハエを防ぐために、ノーカット2を挿入します。
  4. 安全に複数準備されたバイアルを処理するには、グリッドインレイ( 図2A)とプラスチック製の箱に入れます。

ハエの調製

  1. 25℃、相対湿度60%、12時間/ 12時間の明暗サイクルで、標準的な食べ物にハエを保管してください。
  2. 、飼育条件を制御する35処女雌を導入するために、AN50 mLを含むプラスチック培養瓶(9.8センチメートル高さ4.8センチ、直径)にD各実験群のための15人の男性が食べ物を飛びます。ハエは、最初の3日間、卵を産むその後、生鮮食品バイアルに大人のハエを転送し、それらをさらに2日間卵を産むせることができます。この後、再び転送を繰り返します。さらに2日後に成虫を捨てます。
  3. 食物摂取は、フライサイズに依存しているように、2〜3日齢の大人がCO 2フライパッドを使用して飛ぶと1.5 mLのプラスチックチューブにそれらを収集し、標準で測定麻酔により100ハエ群の重量を求めます実験室規模。性別( 表1)でソートされる少なくとも4つの独立したハエ群の湿重量を決定します。 mgのフライあたりμL食品の消費量を計算するために重みを使用しています。単一のハエは、実験ごとにフィード食物の量を決定し、供給することによって毛細血管の排出を避けるために、それに応じて食品が充填された毛細血管の数を調整するには、値を使用します。
    1. 3時間アッセイの使用のため20ハエや2充填した毛細血管。長期実験(> 3時間および9日まで)については、4満たさ毛細血管(信頼性の高い結果が記載された条件の下でより少ない8ハエで得ることができない)の供給に8ハエのグループを使用します。
  4. CO 2の暴露下重量を測定した後グループに別々のハエ(8または20ハエ)。 CO 2鎮静から48時間、実験前に、リカバリを可能にするために(15 mLの標準食品を含む)新しい食品バイアルにグループを転送します。 CAFEアッセイのために4〜6日齢のハエを使用してください。
  5. 非飢えた野生型のハエは、わずか3時間の供給実験のための19、21、事前に飢えたハエを養うように。食料消費が数日間にわたって監視されているときに断食は必要ありません。断食のために、転送が優しく〜0.5 mLののddHで湿らせた唯一の45ミリメートルの直径折り畳んだろ紙を含むバイアルにそれらをタップして、試験前に16〜20時間を飛びます2 O(二重蒸留水)、およびプラグインCAFEアッセイ蓋との緊密な。

液体食品の調製

  1. 102.6グラムのスクロースを充填することによって3 M(10%、w / v)のスクロースストック溶液を準備します(C 12 H 22 O 11)を100mLのddH 2 Oピペット3μL、33μL、333μL、3.3 mLおよび6.6 mLまで15mLのプラスチックチューブ中にストック溶液。 (:;:インディゴカルミン[E132]青用のコチニール[E124]赤のため)で処理し、得られた濃度は0.001、0.01、0.1、1、および2 MスクロースあるのddH 2 Oで10mLに記入食品の色の2 mLを加え。
    注:食用色素がより容易にメニスカスを可視化することができます。しかし、染料は、食物摂取に影響を与える可能性があります。色素に食用色素を分配または実験とグループの間に食品試料への染料の使用量を無作為化によるバイアスを避けるために。
  2. 15 mLのプラスチックチューブで3 Mショ糖ストック溶液のアルコール嗜好ピペット333μLをテストします。100%のEtOH(エタノール)の1.5 mLの(2.3 ml)を加え、15%(0.25ミリモル)及び23%(0.39 mM)の作業溶液をもたらすことを10mLまでのddH 2 Oを追加します。
  3. -20℃でストック溶液を維持し、4℃でのソリューションの作業。 1週間以内に使用します。
  4. 毛管力により、着色された食品の溶液と同時に10キャピラリを埋めます。ショ糖液(溶液に対して45°の角度で毛細血管を保持)に毛細血管の端を挿入します。液体が毛細管のトップ(5μL)マークに達した場合に停止し、ティッシュペーパーで外側に、内部に余分な溶液を除去します。

4.アセンブリおよび毛細血管フィーダーアッセイを行います

  1. 断食が必要とされていない場合は、タップすることで、またはブローパイプによってアッセイの実験的なハエを転送します。蒸発を定量化するためにハエずに3つの制御バイアルを含めるようにしていることを確認します。
  2. 外openinの1を閉じている - (20μLのボリューム2)慎重にピペットチップを削除GSと、第1充填されたガラスキャピラリー、ボトムエンドを挿入します。戻って次のキャピラリーにピペットの先端を配置することにより、キャピラリを固定します。いくつかの食品ソリューションがテストされている場合は、それに応じてこの手順を繰り返します。
  3. 置き、毛細管は、食料源が異なる高さに配置された場合に発生する可能性バイアスを避けるために、同じレベルのすべてのバイアルの中で終わる(3 - ふた〜4センチ)。誤っ濾紙または食物源の異なる粘度をタッチして漏れる毛細管を防止するために、濾紙の距離を保ちます。
  4. マーカーペン(マーク始まる)を使用して着色液の上端部にラベルを付けます。別の毛細血管が識別することができることを確認するには、色やストライプのコードを使用して個別にラベルを付けます。
  5. グリッドインレイとプラスチックの箱の内側に複数用意CAFEアッセイを置き、実験室条件下で、または、温度、光-及び湿度制御CLIMに安全な位置に( 図2A)ボックスを転送実験期間( 例えば、3 Hまたは日間):室(25℃、相対湿度60%、12時間/ 12時間の明暗サイクルパラメータ)を食べました。
  6. アッセイは、数日間にわたって行われた場合に底ろ紙が乾燥したように、アッセイの内部の湿度を一定に保つためにスポンジ栓(100μL) を経由して 24時間毎に新鮮な水を適用します。湿度デバイスとして30ミリリットルのddH 2 Oを充填した4つの別々のバイアル(8センチ、高さ3.3センチ直径)を使用し、プラスチック製のボックス内のCAFEアッセイの隣に配置します。実験( 図2A)の間、湿度制御された環境を作成するために、プラスチック製のボックスのカバーを使用してください。
    注:より広範な変動は実験室条件下で発生します。しかし、室温( 例えば 、教室内)でCAFEアッセイを実行することが可能です。加湿装置(プラスチックの箱のための水のバイアルとカバーを埋め濡れたスポンジの栓を伴うまたは伴わないろ紙、、)を使用することは非常に蒸発を減少することが奨励されています(
  7. 長期間の実験ごとに24時間、新鮮に満たされたものと毛細血管を交換してください。各24時間間隔の前に死んだハエをメモして、次の期間にフライあたりの消費量を計算するために生きたハエの数を使用します。 (5.1を参照)メニスカスの低下を測定した後、古い毛細血管を捨てます。
    注:私たちはほとんど任意の死んだハエを見ない3時間の実験中。 3死んだハエ - 4日の研究の間、私たちは通常1を見つけます。
  8. CAFEアッセイは直立位置にある間に、アッセイの終わりに、またはキャピラリーを交換する前に、マーカーペンでキャピラリー(マーク )の下メニスカスをマーク。マークの端が最初マーク(マークが始まる )以下でない場合はデータを破棄します。これは、メニスカスを変更する可能性があるため、蓋を削除しないでください。
  9. 慎重に分析から毛細血管を削除し、データ収集のためにそれらを格納します。 discarない場合は、キャピラリー内部の液体が下端に達しているかどうかを確認Dデータ、食品はハエにアクセスできなかったとして。グループとして1バイアル当たりすべての毛細血管を収集します。逃げるのハエを防ぐために、すべての開口部に切断されていないピペットチップを挿入します。セットアップを解体し、更なる使用のために室温で石鹸バス、一晩乾燥にバイアル、蓋とスポンジ栓を洗います。
    注:ハエは、さらに分析した後に分析することができます。目によって、または解剖顕微鏡下で食品の摂取量を確認してください。
  10. 少なくとも三つの異なる日に同じ遺伝子型を有する繰り返し実験。

5.データの収集と分析

  1. キャリパーや定規を使用して、キャピラリー上のマークの始まりとマークの端部間の距離を測定します。スプレッドシートに直接データを転送するには、デジタルキャリパー( 図1E)接続されたUSB(ユニバーサル・シリアル・バス)を使用します。測定後の毛細血管を捨てます。
  2. 毛管サイズのアカウントは、食物摂取または蒸発を計算します。例えば、キャップを考えますそのillary 73ミリメートルの長さであり、食品溶液5μLが含まれています。メニスカスで14.6ミリメートルの減少は、1μL液の取り込みを反映しています。以下の式を使用して食物摂取を計算します。
    食品摂取量(μL)=測定距離(mm)の/ 14.6ミリメートル
  3. 食物摂取に対する蒸発の影響を排除するために、ハエのない3(最低でも)制御バイアル中の蒸発を意味計算します。ハエによって食料消費のために得られた値から、この平均値を減算します。
  4. フライあたりの総消費量を決定するには、次の式を使用します。
    食品の消費量(μL)=(食品摂取[μL] - 蒸発損失[μL])/バイアル中のハエの総数。長期的な実験のために、24時間間隔の開始前に、生きたハエの数を使用します。
  5. そのような男性と女性のハエの間のような体の大きさの違いを考慮して、体重(μL食品/ mgでハエ)に摂餌量を正規化します。
  6. データ分析のための統計ソフトウェアを使用してください。ノルムのための味方分散データは、2フライ群間の差を決定し、二つ以上のグループのための事後テューキークレーマー検定でANOVA(分散分析)を使用するスチューデントt -testsを使用しています。選択肢の状況では、ノンパラメトリック1標本符号検定を用いてランダムに選択との違いを分析します。

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Representative Results

ワット1118の遺伝子型のハエは、アッセイが行われる方法を示すために使用されています。 W 1118変異体は、一般的にトランスジェニック系統を生成し、導入遺伝子の遺伝的背景が白の遺伝子でマーク制御するために使用されます。通常、行動実験のために、すべてのトランスジェニック系統は、実験対照として使用されているのと同じワット1118株、に5世代戻し交配されています。我々は、さまざまな実験を示しています。私たちの修正されたセットアップ、短期的な食品の選択実験、長期的な食物摂取実験、および異なるショ糖の希釈での実験の蒸発損失の比較を。

蒸発は、CAFEアッセイの性能において重要な役割を果たしています。私たちは、蒸発を減少させるために我々のアッセイに追加のアプローチを含めた:i)中央スポンジ栓は、24時間ごとに水を補充されます。 ⅱ)のaddi輸送箱およびiii)湿度エンクロージャを作成するために、ボックスのカバーの使用を内的な水充填したバイアル(4.6を参照)。なしと上記機器とセットアップの間に蒸発を比較すると、蒸発の有意な減少が見られます。エタノール含有液の高い揮発性のさえ効果は新しいセットアップを使用して検出できません。

2の選択肢の食品実験では20ハエのグループを3時間供給できます。自然環境では、ショウジョウバエは、アルコール22と果物を発酵に優先的に供給し、ハエがエタノール23なし酵母のショ糖のソリューションに比べてエタノールで酵母スクロース溶液を好むことを、同様の設定を使用して、示されています。ここでは、2つの食品の選択肢が提供され、赤色の食用色素で標識された0.1 Mショ糖溶液と青の食品の色( 図1A、C)で標識された15%EtOHで0.1 Mショ糖溶液。ビジュアル元腹部のアミノ化は、ハエは両方のソリューション( 図1D)を餌にすることを示しています。フライあたりの食物消費をEtOH( 図3A)を含有するショ糖液の(ほぼ2倍)かなり大きいです。

以下の実験では、長期的な研究では、8ハエのグループが4日間、同様の食品・ソースへのアクセスを持っており、ハエは、毎日( 図3B)に対するエタノール含有食品の多くを消費します。エタノールの優先指数([のSuc +エタノール] - [のSuc] /総消費量)は、この期間(平均= 0.29、 表4)にわたって一定のままです。観察されたエタノールの嗜好は飛ぶが、26、25、24種類食料源との間を区別することができるいくつかの他の出版物やショーと一致しています。観察されたエタノールの観光スポットには、別のカロリー内容の結果であるかもしれません提供するソリューションとのエタノール24のやりがいの特性。アッセイはまた、栄養補助食品の負の効果を測定するために使用することができます。ジャらは、パラコート(酸化剤)の適用が食物消費10を減少させるこの方法の最初の出版でした。

次の実験では、男女間の食物摂取量の差を示しています。代謝要求は、雄と雌のキイロショウジョウバエの間で異なります。たとえば、男性のハエが産卵時に、炭水化物が豊富な食品を好むながら増加したタンパク質の生合成を必要とする相、雌は炭水化物が豊富なダイエット27の上にタンパク質が豊富な食生活を好みます。交配雄および雌のハエは、この実験に使用しました。 20雄と3時間供給区間内20雌ハエの間の食物摂取量の差を分析するために、CAFEアッセイはスクロースコンセントを使用して実行されます配給シリーズ。 ( 4A)2~3 Mスクロース、及び各溶液の消費量を測定した- 5つキャピラリー10の範囲のソリューションを提供しました。結果は、雌雄が食料源( 図4A)のような高濃度のスクロース溶液を、好ましいことが示されました。しかし、女性が男性(P <0.05)と比較して、2つの最低濃度のショ糖溶液の有意に多く消費します。一方、男性はより高い濃度の溶液(P <0.001)の有意に多く消費します。これらのデータは、体の大きさの違いを考慮していなかったことに注意してください。女性D.は通常男性( 表1)よりも大きく、重いメラノ 。食品の消費量は、質量を飛ぶために正規化された場合、低スクロース溶液の消費量で、男性と女性の違いはもはや重要であるありません。要約すると、男性は以前のデータと一致して交配した雌よりもショ糖溶液、REFLを消費します可能な異なる代謝要求、栄養好みや2男女間の毛細血管を餌にする機能でシンプルな違いをecting。

図1
図1: ショウジョウバエ キャピラリーフィーダーアッセイ。 A)ハエと摂食アッセイ。湿らせたろ紙は、バイアルの底に水を提供しています。 4本のキャピラリは、実験(反対毛細血管内赤と青の色の食品)の間に提供されています。毛細血管は、第2のピペットチップによって所定の位置に固定されており、未使用の位置は、ピペットチップを使用して閉じられていることに注意してください。蓋の中央に泡プラグは空気交換を可能にします。 B)蓋の詳細図。カットピペットチップ(2から20μL、赤い境界線)は、未使用の位置の円錐形の開口部、及び第二のパイの中に挿入されていますpetteの先端が穴を閉じるために切断された先端部に挿入されています。切断されたピペットチップは、マイクロキャピラリーの配置を制御するために使用され、そして未切断チップはタイト毛管を保持するために使用されます。 C) キイロショウジョウバエのハエは、キャピラリーに供給します。 D)を供給した後、食品の色はフライ腹部にはっきりと見えます。 E)は、デジタルキャリパーを開始マークとメニスカスのマークの端部間の距離を測定するために使用されます。データはUSB経由でExcelスプレッドシートに直接転送されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: キャピラリーフィーダーアッセイにおける蒸発の影響。内部に配置されたA)複数CAFEアッセイグリッドインレイとプラスチックの箱。実験中の湿度を制御するための4水充填したバイアル(赤リム)は、グリッドの内側に配置されています。蒸発制御は、これらのバイアルに直接近接して配置されています。全体のセットアップのためのカバーは、バックグラウンドで示されています。蒸発によって体積損失のB)の比較。蒸発4日以上の平均値が示されています。湿度は、(i)中央のスポンジ栓(24時間間隔)に水を適用することによって制御されます。 (ii)のグリッドに4水充填したバイアルを加えます。および(iii)全体のセットアップのためのプラスチック製のカバーを使用して。湿度が試験した両方のソリューションのために制御されている場合に蒸発が著しく低い(*** P≤0.001; N = 48)。ショ糖溶液を含有し、非含有エタノールの間のボラティリティの差異は、使用湿度デバイスで検出されません。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

図3
図3: ショ糖液の上にショ糖を含有するエタノールに対する嗜好(エタノール)。 1118ハエワット男性用A)食品の消費が示されています。男性は無地のショ糖液のよりショ糖溶液を含む15%エタノールのかなり多くを消費します。 *** P≤0.001; N = 27 B)は、4日間の試験期間中に23%エタノールを含むショ糖ソリューションを好む大幅にハエ。 *** P≤0.001; ** P≤0.01; N = 16 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:C1118 ハエ ワット男性と女性によって異なるスクロース濃度のonsumption(μL/飛ぶとμL/ mgのフライ)。 A)スクロース溶液の異なる濃度の消費量は、男性と女性の間で大きく異なります。女性のハエが低いショ糖濃度でより多くを消費し、男性のハエは、より高い濃度でより多くを消費します。 * P <0.05; *** P <0.001; N)は、20人の男性それぞれに27件の試験を=、N = 20、女性それぞれに30件の試験。質量基準でB)食品の摂取。質量を飛ぶために正規化した場合、消費の大幅な増加は、0.1 M 2へのショ糖ソリューションのための男性と女性のハエとの間で発生します。 *** P≤0.001; Nは 27人の男性、N = 30人の女性を=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
1:1118 ハエ ワット 男性と女性の体重 100ハエの四五グループを測定し、体重(ミリグラム/ハエ)を算出しました。 (STDEV(標準偏差)とSTERROR(標準誤差)との)平均値が示されています。平均値は、質量(μL/ mgのフライ)を飛行する食品の消費量を正規化するために使用されています。 このスプレッドシートをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表2
表2:CAFEアッセイにおける蒸発減量(μL)。蒸発により失われた液体の量は、4日間のために示されています。湿度が制御された(+)またはNOでありますT( - ) 図2に記載されるように。二つの異なるソリューション(ショ糖およびショ糖を加えたエタノール)のための蒸発データが示されています。平均値は、それぞれの日のためにと(STDEVとSTERROR付き)期間にわたって提示されています。ショ糖希釈実験の蒸発損失は(平均値を)下に別々に示されています。 このスプレッドシートをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表3
3:1118ワット と0.1 Mスクロース/ 15%エタノールのない男性によるの消費量は 3時間、連邦準備制度を飛びます。 20ハエのグループによる両溶液の消費量は、3日に3時間を測定しました。フライグループの消費値は、フライあたりマイクロリットルの取り込みを推定するために試験したハエの数で分割されています蒸発損失を差し引きました。 (STDEVとSTERROR付き)平均値が示されています。 このスプレッドシートをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表4
表4:0.1 Mスクロースでの消費と 1118 ハエ ワット 男性による4日間の23%エタノールなし 8ハエのグループによる両溶液の消費量は4日間24時間測定しました。 ( - 〔のSuc] /総消費【のSuc +エタノール])エタノールの優先度は、以下の式を用いて計算しました。フライグループの消費値は、蒸発損失を差し引いた後、フライあたりμLの取り込みを推定するために試験したハエの数で分割されます。 (STDEVとSTERROR付き)平均値は、それぞれの日のために示されています。.jove.com /ファイル/ ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-表-4.xlsx "ターゲット=" _ "空白>このスプレッドシートをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表5
5:1118 ハエ ワット 男性と女性によってスクロースの5つの濃度の消費 各溶液の摂取、及びショ糖摂取量の合計値が、示されています。各濃度の平均値は、(STDEVとSTERRORで)各カラムの下に与えられています。フライ質量(ハエのミリグラム当たりのマイクロリットルの取り込み)に基づいて摂取を計算するために、食物消費は(右側に示され、表1から)オスまたはメスのハエの平均重量で割ます。 このスプレッドシートをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

報告書は、技術的なセットアップと実験室での成功のパフォーマンスに焦点を当て、ステップ・バイ・ステップ方式でCAFEアッセイを説明します。 、その単純さのために、このアッセイはまた、学校の実験として、教育的に使用することができます。例としては、アッセイが短く、より長い期間(数時間から数日)にわたってキイロショウジョウバエにおける食物センシング、好みや消費の調査を可能にすることを示しています。 CAFEアッセイは、食品や薬の消費、中毒、エネルギー恒常性と給電16の神経制御、18、24、25などの科目を調査する分野で広く用いられています。

CAFEアッセイでは、実験的なハエは成功し、このような採餌、センシングおよび歩行のように、食べ物を得るために、いくつかのタスクを実行する必要があります。これらのタスクを実行できないことが減少し、消費につながる可能性があります。ために動作老化するハエの飢餓状態に主として依存し、19、21絶食によって増加させることができます。センシング、および食料源のそれによって局在化は、匂いや味するハエの能力によって影響を受ける可能性があると間接的に低い消費率28につながる可能性があります。キャピラリーの終わりに食品の表示が降り、積極的に供給するために逆さまの位置に自分自身を保持するためにフライを強制します。キャピラリー上の飲み位置を保持するために、フライは、その筋肉の収縮を調整する必要があります。加齢による歩行不備がそうであるように運動の減損または多動は明らかに、食物摂取に影響を与えるだろう。また、この操縦中に他のハエによる干渉は、食物摂取の早期終結につながります。したがって、使用するハエの数は、実験の前に決定されるべきです。この数は、すべてのハエが適切に供給することができることを確認する必要がありますと、fのために制御する必要があります(8から私たちのキイロショウジョウバエ CAFEアッセイバイアル中20ハエの最大値まで)バイアル中LY密度。供給は、食事の栄養価に影響を受け、それに応じて24、29それらの摂取を調整する動的に飛ぶされています。これは、神経伝達物質オクトパミンを欠落変異体は通常のPER応答スコアを有するが、同時に食物摂取14の有意な減少を示すことが示されました。また、給紙時に、モチベーションは、摂食減少を継続すると動作の終了につながります。

上記の考察は、彼らは、他の試験システムで測定された摂食行動に影響を及ぼす、CAFEアッセイのみならず適用されます。食物摂取を測定する場合したがって、アッセイを実行するハエの能力を考慮しなければなりません。それは技術的に困難ではありませんが、CAFEアッセイは、いくつかの潜在的な実用的な欠点を有しています。メニスカスの衰退キャピラリー内部のハエによって蒸発損失および食物摂取量に依存します。高い蒸発は、信号対雑音比についての問題であるので、最小にすべきです。私たちは、実験期間(4.6を参照)の間に湿度を制御するためにいくつかの追加の手法および装置を適用しました。これらのアクセサリは大幅に蒸発を減らすために私たちを助け、さらには私たちが使用する食料源の異なるボラティリティの影響を排除しました。いかなる気候室を使用できない場合は、それにもかかわらず、このアッセイは、欠点として、より高い蒸発値と(教室などで )、室温で行うことができます。

プロトコルで述べたように、毛細管の端部が原因食物源への異なる距離にハエの選択にバイアスを避けるために、バイアルの内部と同じレベルに配置される必要があります。これを達成するために、キャピラリの位置は、第二のピペットチップを用いて固定されています。キャピラリーの長さは、野生に供給するための基準であることはないようタイプは10を飛びます。液体のこぼれは、食品の消費量(4.3および4.9を参照)の正確な読み出しを弱体化させることができます。振動のない環境では、流出を防ぐことができます。ソリューションブロックの毛管流中の粒子と食物消費を防ぎます。食品溶液は、それが酵母を含んでいる場合は特に、完全にこのような閉塞を回避するために溶解する必要があります。水溶性酵母エキスの使用は、この問題を克服することができるが、栄養の不完全なソースとしては、追加のトレーニングコストを引き起こす可能性があります。食品のアクセシビリティは、実験前と後に評価される必要があります。分析に含まれるべきである唯一のフライデータが得られた食品へのアクセスが実験全体(4.9を参照)の間に存在していた場所ということです。逆さまの供給位置は、実験の重要な特徴です。果実は木からぶら下がると、彼らは腐った果物を降りるかもしれないとして、自然条件の下では、この供給位置は、フライに不慣れではありません。これは、比較例の実験によって支持されています(ⅰ)MAFEアッセイにおける固定化されたハエの水平食べ位置と放射性標識された食品13を用いて、(ii)の右サイドアップ供給位置、21にCAFEアッセイで逆さまの位置に供給するハエの食事のサイズをる。逆さま食品表示はハエのための問題ではないようだが、それは毛細血管の内側食品の組成に影響を与える可能性があります。酵母細胞などの一時停止のサプリメントは、毛細管の底に重力により沈む可能性があり、したがって、下部により濃縮かもしれないまたはキャピラリーを差し込むことがあります。これは、ハエの行動ので、結果に影響を与えるだろう。供給溶液の成分が完全に溶解することを確実にすること、およびしばしば長期の実験の間に新たな毛細血管を導入し、食物摂取に対するこの影響は最小限に抑えられます。

時間が及ぶの上に、ここで説明CAFEアッセイの使用は、ハエの群における食物摂取の測定を可能にします数時間または数日。より詳細な分析が必要な場合( 例えば 、単一のハエまたは行動分の範囲での動作)は、このようなMAFEアッセイのような他の摂食アッセイ、より適切です。ハエの数をさらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブとシングルキャピラリ30を用いることによって低減されることが可能であるかもしれません。

代表的な結果を得るために使用される実験の数は文献17、24に記載の実験と一致して、15から27まで変化します。アッセイは、実験者からの潜在的なバイアスを除外古典的ブラインド方式で行うことができ、それは、通常、数日ごとに少なくとも4〜5回繰り返されます。 CAFEアッセイで得られたデータは、体の大きさに関連する摂食行動の違いを説明するために、体重に正規化することができます。そのように、このアッセイを用いて得られた結果は、堅牢で再現性大学院生のための実用的なコースで成功裏に導入されています。

CAFEアッセイは広くキイロショウジョウバエにおける代謝及び味覚研究の分野で使用されています。 それが摂食行動に栄養補助食品および/または薬剤の役割を試験で複数のアプリケーションを有し、特定の食物源24の用量反応を調べるために使用することができます。 キイロショウジョウバエにおける神経回路を操作するために使用される技術の顕著な様々な組み合わせで、このアッセイはまた、研究者は、動作12、17、18供給するの補強システムの役割を調査することを可能にします。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

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References

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