毛喉素诱导在肠组织体溶胀:一个

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Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., Beekman, J. M., Clevers, H. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

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Abstract

Introduction

CF是通过在编码上皮阴离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因的突变引起的。 CF影响全世界约1 85000人。超过2000 CFTR突变已经确定( www.genet.sickkids.on.ca )。这种多样性也部分解释观察到的疾病表型(的广泛www.CFTR2.org )2,3。六类CFTR突变是基于其对CFTR蛋白表达和功能作用定义的:(I)中没有的合成,(II)中受损的贩卖,(Ⅲ)有缺陷的通道门控,(IV)中改变的电导,(V)的降低的正常水平功能CFTR,和(VI)受损细胞表面稳定性4。虽然常见CFTR突变很好的研究,CFTR功能和临床状态的关系保持poorlŸ了解在个人的水平,特别是对于大集团的罕见的“孤儿”突变( www.CFTR2.org )1,3。

最近,药物已经开发了靶向特定突变的方式CFTR蛋白。两个班的CFTR蛋白,靶向药物,目前在临床上使用,并有行动不同的模式。增效剂,例如VX-770,增强顶部本地化突变体CFTR的开放概率和在他们除了细胞5直接作用。校正,如VX-809,恢复内质网本地化错误折叠的CFTR的贩运和要求预孵育的影响细胞前观察到6。该CFTR增强剂,VX-770,已注册的G551D突变的7,8学科,以及为其他八位CFTR突变门控,包括S1251N 9;一起,这些突变通过所有CF患者的5%进行。其它的临床试验已经表明VX-770,与校正的VX-809相结合,限制对肺功能尚未显著影响,并导致恶化率在受试者纯合的患者10 45-50%承载的F508del突变降低 11。

常规的临床试验,以CF患者的剩余的50%的范围内确定药物响应受试者是昂贵和费时的,并且不与非常罕见的CFTR基因型的个体是可行的。新颖,具有成本效益的,个性化的方法是,以匹配于携带任何类型的CFTR突变的个体数量的增加CFTR调节剂的关键。到现在为止,承载特定的CFTR突变的患者群体的审判列入遵循了使用H CFTR突变基因转染的研究eterologous细胞系统,随后电生理学研究中尤斯灌流室5,6,12。由于缺乏足够的CF动物模型中,在从CF肺外植体材料来源的空气-液体界面分化支气管上皮细胞的药物的功效研究已用于药物开发13,14,15。然而,肺组织外植体和侵入性操作的使用限制,以获得无疾病终末期患者支气管细胞阻碍不太常见CFTR突变的分析和预防药物测试的个性时尚。为了克服这些限制,“绿色通道”的组织,例如结肠组织体,鼻气道细胞,和从诱导的多能干细胞衍生的气道细胞,目前正在探索的个性化的药物治疗。

16,17的形式建立的协议,以培养上皮干细胞从任何胃肠器官。为人类结肠/直肠中,培养条件包括限定生长因子(表皮生长因子(EGF),胃泌素,的Wnt-3A,R脊椎蛋白3(Rspo3),和头蛋白)结合的小分子(烟酰胺,A83-01,和SB202190)在基底膜基质。在这些条件下,单个干细胞或小组织片段生长出到由高度偏振光上皮朝向外侧面向其基部侧形成封闭,囊状,三维结构。所有类型的细胞通常出现在他们正常的比例和位置。组织体可以在由每周机械破碎和再镀长时间周期进行扩展。它们是遗传和表型稳定,可以进行储存,从而允许长期扩增和生物银行17。他们是服从所有标准的细胞生物学/遗传操作和分析技术的二维细胞系18开发的。

我们最近证明CFTR功能可以在大肠癌组织体可容易地测得在毛喉素诱导肿胀(FIS)测定19,20。当暴露于毛喉素(FSK)或者,霍乱毒素,类器官迅速增加其环磷酸腺苷(cAMP)的水平,这在CFTR通道19的开口又导致。类器官来自健康个体,或从与剩余功能相关CFTR突变,受试者将随后溶胀离子和水输送到组织体腔,分泌性腹泻的体外等效的结果。大肠组织体的FIS响应以前证明是完全的CFTR相关的,通过从CFTR空个人取得组织体所指示的一个通过使用特定的药理CFTR抑制剂19次。大型主题特定数据集可以在几个星期内采取活检后得到。

在这里详细描述的FIS测定中,类器官是从可以在任何年龄和只有有限的不适21得到直肠活检中培养。类器官是由机械破碎每周传代成单隐窝,可以轻松地重新密封,并形成新的类器官。用于运行FIS测定中,〜这些扰乱小组织体30-80铺板在96孔板19的每个孔中。在测定的当天,将组织体染色用钙黄绿素绿色,它被保持活细胞内,便利实时成像的荧光细胞渗透性染料。然后,FSK,这引起了细胞内cAMP,从而激活CFTR,是为了刺激类器官肿胀加入。在心尖CFTR充当增效剂同时W¯¯添加第i个毛喉素,而认为CFTR恢复贩卖校正器加FSK之前所加的24小时。的器官样肿胀是由计算用于在福斯克林除了各时间点的所有荧光物体的总面积的相对增加的自动图像分析进行定量。

三维类器官溶胀提供了超过在2D培养的气道细胞现有电CFTR读数在尤斯灌流室的优点和缺点。一个主要优点是溶胀测定的吞吐量。细胞进行培养,并使用单一类型的培养基的测定,和一个有经验的技术人员可以培养多达25类器官样本每周,而在12患者样品定量每周约1,200个数据点。我们通常通过键入每板重复或三次测量单个实验条件,并在三个独立的孵化时间点重复这种测量。在总计约300-500小号英格尔类器官结构,则每个实验条件下,从而导致有限的技术可变性CFTR功能的非常精确的测量进行测定。这种精度使我们清楚地界定残留的功能和应对CFTR调节差异,并允许我们随手拿起携带相同的CFTR突变19,22,23,24,25例患者的遗传背景的影响。数据质量可以从显微镜图像容易地评估。而FIS是充分CFTR依赖性,它是CFTR功能的间接的测量结果,所造成的离子输送的流体传输的耦合其读出。与此相反,在尤斯灌流室直接CFTR功能测量,测量跨膜离子流26。尤斯灌流室心尖允许基底或C的选择刺激ompartments(其类器官测定不允许);由透基底膜,心尖CFTR依赖性阴离子分泌可以有选择地测量27。

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Protocol

使用本文中描述人类组织的所有试验批准在乌德勒支大学医学中心的伦理委员会(UMCU; TcBio#14-008)。从病人威廉敏娜儿童医院(WKZ)-UMCU获得用于组织收集,生成,存储和使用的组织体的知情同意。

设备 耗材 工具
层流罩 15和50毫升锥形管中蔡司LSM 800 - 禅2(蓝色版),用于测量图像软件
CO 2培养箱离心管微软Excel程序
细胞培养显微镜(光/光学显微镜) 0.22微米的过滤器
离心分离机血清移液器
滚动振荡微量过滤嘴
4℃的室温或4℃冰箱孵化器冷冻管
CoolCell细胞冷冻集装箱
血清学移液器
Micropippette(1,000,200和20微升)
Viaflo重复吸管
(活细胞)共聚焦显微镜
电脑
液氮罐
多信道(200微升)

1.准备试剂文化

  1. 基础培养基的制备
    注:基础培养基(BM)是指高级的Dulbecco改良的Eagle培养基补充有4-(2- hydroxyethil)火腿的营养混合物F-12(广告-DF)-1piperazineethanesulfonic磺酸(HEPES),谷氨酰胺和青霉素/链霉素(笔/链球菌)。
    1. 在500毫升的Ad-DF培养基瓶中,加入5毫升200 2mM谷氨酰胺,5毫升的1M HEPES和5毫升青霉素/链霉素溶液(10,000单位/毫升10,000微克/毫升)。
    2. 商店的BM中在4℃冰箱中的至少4周。
  2. 的Wnt-3A条件培养基的制备
    注:的Wnt-3A条件培养基是由内部全光照克细胞系,根据制造商的说明,L-的Wnt-3A。
    1. 用于收获的Wnt-3A条件培养基,收集暴露于细胞一周培养基并在450 xg离心旋转下来为5分钟,除去漂浮细胞。
    2. 通过0.22微米的过滤器过滤的Wnt-3A条件培养基,并将其划分成40毫升分装在50毫升锥形管中。在4℃下保存它们至少4个月无活性的损失。
    3. 使用人胚肾(HEK)测试的Wnt-3A条件培养基的活性在TOP / FOP测定与顶部和FOP荧光素酶和TK- 海肾转染,并用海肾测定-293细胞根据萤光素酶测定试剂盒制造商的说明。
      注:TOP荧光素酶是含有野生型TCF结合区域记者质粒。如果的Wnt-3A条件培养基是活动的,经典Wnt信号被激活。 β-连环蛋白易位到核中,以机智关联ħTCF / LEF转录因子和激活荧光素酶报告的转录,加入底物时诱导相对萤光素酶活性的增加。在FOP荧光素酶作为阴性对照,因为TCF结合区的荧光素酶基因的上游发生突变。
  3. 结肠介质制备工艺
    注:准备和稀释根据制造商的建议所有的生长因子和试剂。使用小尺寸的等分试样的避免冻融。官能生长因子是对结果至关重要。
    1. 通过用1×B27,1.25毫N-乙酰半胱氨酸,50纳克/毫升的hEGF,为5nM胃泌素,10毫烟酰胺,300纳克/毫升hRspo3,100纳克/毫升hNoggin,500μM的A83-01补充的BM准备结肠培养基(CM) ,10μMSB202190,和100微克/毫升为初级细胞的抗微生物的。
    2. 划分成CM等分,并在-20°C冻结他们长达4个月。解冻等分准备全结肠介质(FCM)通过加入50%的Wnt-3A所决定介质到CM。商店FCM多达4°C 7天无活性的损失。
    3. 从直肠活检建立类器官培养的,补充的FCM用50微克/毫升万古霉素,50微克/毫升庆大霉素,和10μMRho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(RhoKi)。使用该培养基,称为隔离介质(IM),仅用于在培养的第二至三天。
  4. EDTA储液的制备
    1. 制备的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA),pH为8,在超纯H 2 0,用0.22μm过滤器灭菌。
  5. 基底膜基质的操作
    1. 准备根据制造商的建议,基底膜基质(BMM)。
    2. 解冻BMM隔夜冰上。
    3. 当从瓶子转移BMM到15毫升锥形管,使用5毫升吸管和15毫升在-20℃的锥形管预冷却。
    4. 一旦解冻,存储BMM在冰箱4℃,并在冰上孵育使用前至少30-60分钟。
      注:为了取得最好的效果,必须BMM是冷和嵌入隐窝或类器官之前适当地混合。

(二)建立结肠类器官从病人的CF活检

注:组织收集后,将其保持在冰上的样品在盐水中是重要的,Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+(DPBS),或BM。建议在活检快速处理,但它已被证明可以从存储在冰上至7天活检建立类器官培养物。

  1. 让活检沉降在一个15毫升的锥形管的底部,并去除上清。
  2. 使用10毫升吸管10毫升DPBS添加到活检和吸管向上和向下的10-20倍。
    注:移液器需要与BM吹打活检前预润湿。
  3. 让活检收于底部,去除上清。
  4. 重复步骤2.2和2.3 4-5次直至上清液是明确的。
  5. 加入10 mL DBPS和200微升EDTA(0.5M)到活检并放置在管上的摇摆管平台在4℃60-120分钟。
    注:孵育时间可能每个病人不同。如果墓穴被释放,DPBS变得混浊。当隐窝可在显微镜下观察EDTA孵化才能最后确定。
  6. 允许隐窝定居。弃去上清液。
  7. 拿起2毫升BM,并把它添加到一个新的15 mL锥形管。在这样的内部覆盖有BM的方式手动摇动该新管中。
  8. 用吸管预先润湿的BM,加2ml的DPBS到包含活检和移液器上下10-20倍管。
  9. 允许活检沉降并与隐窝转移DPBS到新含有2 mL萃取的BM被在步骤2.7制得管。
  10. 重复步骤2.8和2.9,直到没有更多的隐窝被释放。
  11. 旋转隐窝下来在130 XG 5分钟在8°C。
  12. 在此期间,即时消息传送到在室温(RT)下的安全柜。
  13. 弃上清,加入10 mL BM向隐窝颗粒和重复步骤2.11。
  14. 悬浮颗粒在1毫升骨髓。需要5-10微升并在显微镜下用肉眼计数隐窝数。
  15. 旋转隐窝下来在130 XG 5分钟在8°C。
  16. 去除上清,悬浮颗粒在55%BMM(V BMM到v IM)。
    注:隐窝悬浮在55%BMM的相应体积为每微升1隐窝。如果没有足够的隐窝,BMM的最小体积是40微升。
  17. 对于播种,每孔吸管35微升(在24孔板)。分35微升BMM成3-5以提高GRO的扩散分别滴相机连因素纳入BMM。不要产生气泡。
  18. 放置并离开该板在培养箱颠倒,在37℃下至少20分钟的BMM固化。
  19. 加入500微升的IM每孔,并保持它在培养箱中在37℃和5%的CO 2。
  20. 刷新中每2-3天。通过与P1000吸管吸取出来,留下BMM下降完好卸下旧媒体。仔细吹打它在井的侧面,而不是直接在BMM滴添加FCM。
    注意:如果不隐窝在隔离协议释放,离心上清液,用BM洗涤沉淀2-3次,并在BMM悬浮它。就拿吃剩的组织切成小块,用剃刀。收集这些入15ml锥形管中,离心它们,并在相同的BMM重悬。如果任何上皮干细胞存在,这些也将产生类器官。

3.结肠类器官的维护,冻结,并为传代skolin诱导溶胀测定(FIS)

注意:每个类器官的文化都有自己的倍增时间。通常情况下,结的CF类器官可以扩展1:3-1:5次,每次7-10天。这是如果观察到出芽结构的好兆头。结的CF类器官较少囊性( 图2A - 2C)比大肠正常组织体( 图2D)。对于建立和维护,组织体都在24孔板中培养;对于冷冻,在6孔板;和用于FIS测定中,在96孔的酱。

  1. 组织体传代
    1. 在使用之前保持BMM冰上至少30-60分钟。
    2. 保持FCM在室温至少1小时使用它之前。
    3. 标签1个15毫升的锥形管的样品名称,另一个管作为“洗白”。
    4. 小心吸使用P1000的吸管孔中的介质,而不会干扰BMM下降。
    5. 1毫升BM添加到1井和break了BMM滴用P1000吸管。转移产品1 ml接种入与样品名称15毫升锥形管中。
    6. 与另一1毫升BM的洗井,并将其转移到相同的15ml试管。
    7. 重复步骤3.1.5和3.1.6用5更多的井(最多为24孔板的6个孔将在一次的15毫升锥形管中洗涤)。
    8. 填充管可达12毫升骨髓。移液器上下使用预润湿5毫升吸管。
    9. 旋转在85 XG 5分钟在8°C。
    10. 弃去上清液和1ml的BM添加到粒料。具有相同P1000枪头,占用一个P10前端未经过滤,并吸取上下20次。同时废弃P1000和P10的提示。
    11. 添加4毫升的BM用5毫升吸管并保持在约70℃倾斜从垂直一侧的管。预润湿新P1000尖端和与P1000(1毫升体积)混合剧烈的2-3倍。
    12. 数到10的倾斜位置其余一段时间,仔细收集最上层W¯¯第i个的P1000吸管和传输4×1 ml接种入标为管“洗白”。
    13. 观察组织体沉降在倾斜管的底部;不间断的组织体和更大的块将沉到水底。在85 XG和8℃下离心15 ml“是洗涤”管5分钟。
    14. 弃去上清液以及所需的介质和BMM的量添加到类器官沉淀到55%BMM的终浓度。不产生气泡( 图3B)吹打向上和向下混合。
      注:良好的密度由10微升的BMM播种25-30类器官来实现的。
    15. 按照步骤2.17-2.19。
  2. 传代冷冻
    1. 保持BM冰上使用前至少30-60分钟。保持FCM在RT使用前至少1小时。
    2. 准备FCM辅以RhoKi(步骤1.3.3)。
    3. 从冰箱中取胰蛋白酶和离开它在RT使用前至少30分钟。
    4. 按照步骤3.1.5-3.1.10。
    5. 除去尽可能多的上清液越好,加入4 ml胰蛋白酶,以及涡旋30秒。
    6. 放管中的温水浴在37℃下1分钟和涡流剧烈30秒。
    7. 检查管内的溶液中。如果完整的组织体仍然可见,在显微镜下,重复步骤3.2.7。
    8. 当组织体被破坏,加8毫升BM的以中和胰蛋白酶和吸管10倍。
    9. 自旋为在8℃下以450 xg离心3分钟。
    10. 弃去上清液以及所需的介质和BMM的量添加到该组织体以达到55%的BMM溶液。不产生气泡吹打向上和向下混合。
      注:胰酶消化后的比例为1:冷冻,必须类器官在1接种。
    11. 种子250微升的预热6孔组织培养板的单个孔,产生〜10微升的微小的,分离的液滴。放置板倒置在培养箱中在37℃和离开BMM巩固20-30分钟。
    12. 加入2.5倍毫升的新鲜FCM + RhoKi在每6孔板孔和板转移到孵化器( 图3C)。
  3. 传代类器官的FIS分析
    注意:根据所述组织体4和6个孔24孔板的之间的数量和大小,都足以播种27孔96孔板的。
    1. 从步骤3.1-3.1.13描述过程中的类器官。
    2. 悬浮颗粒在120微升50%BMM的。
    3. 确认在显微镜下一个3微升BMM降组织体(30-50)的数目。
    4. 板使用的3微升放置于96孔颈部的各孔的中间单滴的类器官。
    5. 放置在37℃培养箱的板15分钟的BMM固化;进一步的步骤步骤6.1.1中描述。

4.冻结结肠CF类器官

注:器官OID是准备胰蛋白酶和培养后1-2天被冻结了,所以组织体仍然会很小,这解冻后增加了生存的效率。

  1. BM添加1毫升,并打破了BMM滴用吸管P1000。转移到15毫升锥形管中。
  2. 与另一1毫升BM和转让给同一15ml试管洗井。
  3. 重复步骤4.1和4.2的所有井。
    注意:为了避免过量BMM,一个6孔板的3个孔汇集在一个15ml试管。
  4. 填充含有用12ml冷的BM和移液器上下用5毫升吸管的组织体15毫升管。离开在冰上管5分钟。
  5. 旋在450 xg离心3分钟,8℃,并除去上清液。
  6. 溶解组织体的沉淀,有冻介质和移液器上下正确悬浮类器官。
    注:将500μl冷冻介质的用于每个100μl的BMM的。
  7. 使用5毫升吸管,转移0.5毫升悬浮在冷冻介质类器官无菌低温瓶。
  8. 转移小瓶至细胞冷冻容器,并把它在-80℃。
  9. 24小时后,在液氮中传送小瓶贮存。

(五)建立从冷冻类器官培养

注:在冰上解冻的BMM,并保持在冰上。让BM达到RT,并开始解冻1离心管的过程之前预热10ml的等分至37℃。

  1. 在37℃水浴迅速解冻小瓶中进行搅拌,直到还有一个小的冷冻材料。
  2. 转移解冻组织体使用P1000的吸移管15毫升锥形管中。
  3. 后,立即通过滴加入1毫升温的BM下降一边摇动管的底部。一旦1ml培养基中添加,混合仔细移液器向上和向下几次稀释冻结网上平台。
  4. 慢慢地(逐滴)11毫升温的BM添加到锥形管CONTA寄存器中类器官。颠倒几次。
  5. 旋转细胞悬浮液3分钟,在85 XG和8℃。
  6. 小心弃上清而不干扰沉淀。重悬FCM的90微升辅以RhoKi(步骤1.3.3)的组织体。然后,添加110微升BMM的。
  7. 添加35微升到预温热24孔板的每个孔中,使得微小的,分离的液滴。
  8. 板转移到37℃培养箱,在离开板倒置20-30分钟。
  9. 与RhoKi加入500微升的FCM至各孔并传送板回培养箱( 图4A - 4C)。
  10. 一旦类器官已经从解冻正确恢复,稀更多的BMM因此每10微升BMM包含25-30类器官。这个程序可以做2-3天解冻( 图4D - 4G)之后,并确保类器官的正常生长。

6.毛喉素诱导肿胀说(FIS)

注:FSK滴定允许CFTR残余函数的测量。对CFTR调节,组织体暴露于一个给定的校正( 例如,VX-809)和/或增强剂( 例如,VX-770),这取决于基因型。通常情况下,VX-809增加了测量前18-24小时,而VX-770和FSK的右侧开始测量前加入。要知道,有些调制器(校正/增效剂)可以绑定到检测板的塑料表面。

  1. 电镀的测定
    注:VX-809股为20mM等分并储存在-80℃。解冻后,在离开RT和避光。
    1. 3.3节中描述过程中的类器官。
    2. 如果测试VX-809校正,准备在一式三份的剂量 - 响应曲线与下列浓度:0.0003,0.003,0.03,0.3,3.0和30微米。在准备的FCM稀释。
    3. 到96孔板中,添加任一100μ; l FCM与FCM各自的VX-809浓度或100微升只和孵化板。
  2. 测量分析
    注:VX-770库存预计​​为20毫米分装,而FSK为10毫米;两者都储存在-80℃。解冻后,留在室温和避光。
    1. 采取钙黄绿素和DMSO的小瓶中并在RT留15分钟。
    2. 添加5.1微升DMSO中,以其中的钙黄绿素的,如果未开封提供为粉末,小瓶。否则,使用含有2.5微升钙黄绿素已经悬浮钙黄绿素瓶中。
    3. 加入2.5微升至钙黄绿素580微升BM的在1.5毫升管,并贴上标签。
    4. 加10μl这种染料溶液(BM +钙黄绿素),每孔用吸管重演。
    5. 用多通道悬浮一次,以保证染料混合。
    6. 孵育在37℃培养箱的板30分钟。
    7. 在孵化钙黄绿素,开始准备FSK和VX-770溶液,如果需要的话。
    8. 如果使用VX-770增效剂,以一式三份制备剂量 - 响应曲线与下列浓度:0.0003,0.003,0.03,0.3,3.0和30微米。在一个FSK滴定的情况下,该浓度是:0,0.008,0.02,0.05,0.12,0.32,0.8,2.0和5.0μM。在准备的BM稀释。
      注:对于FSK,VX-770,或在第二天添加的任何其他药物,稀释液必须在2倍终浓度制备,因为100微升的FSK /药物滴定溶液将被加入到各孔中,其中已含有100μl的流式细胞术。
    9. 转移FSK和VX-770解决方案,一个P200移液器和技巧,在显微镜室。
    10. 成像FIS的测定中,使用配有自动阶段,加热室,和CO 2的流程的活细胞成像的共焦显微镜。
      注意:下面的步骤是指一个特定的显微镜。不同的设置应适用于其它显微镜按照生产商的说明。
    11. 把96孔平板在板保持器。
    12. 成像输入共聚焦设置。
      1. 预设实时成像工具至37℃和5%的CO 2,并让该室预孵育最少测量前30分钟。
      2. 使用“智能设置”选项中选择的Alexa Fluor-488轨道。
      3. 将5X镜头和扫描区域为0.6X缩小并捕获整个井。
      4. 适应激光功率和检测器灵敏度,以使在背景钙黄绿素 - 绿标记的组织体的最佳检测。针孔可提高到130微米,图像平均可以在2进行设置。
      5. 设定在8位深和帧大小为512×512。
      6. 使用时间序列选项设置测量时间,频率和时间间隔。
        注:建议定期测量:1小时10分钟的时间间隔:周期= 7(第1周期为T = 0)。为了降低肿胀,奥尔加的测量noids可以成像达3小时。
      7. 使用平铺选项,手动确定单井位置。
    13. 添加100微升FSK和/或VX-770溶液到相应井,以下顺序相同的测定。开始添加拍摄之首很好的解决方案,并继续成像顺序。
    14. 开始测量。
    15. 实验结束后,保存文件。
  3. FIS化验数据分析
    1. 创建用于使用在识别通过的Alexa-488轨道成像的所有结构并填充所识别的结构,以计算总类器官面积的比增加的图像分析软件的分析工具中的FIS测定的数据分析的“类器官分析”宏不同的时间点。
    2. 在图像分析程序所获取的图像中打开该数据文件。
    3. 选择器官样分析宏。
    4. <li>设置阈值,以平衡在一个信噪比以及在时间点1,并确保所有器官样结构被识别和填充。
      1. 检查在4-6井,以查看是否所有的结构都在时间点7还认识稍微修改阈值,以确保在时间点7的背景信号不被识别为结构(具体阈值可以实验之间有所变化)。
    5. 设置识别出的对象的最小面积大小的标准,以1000微米2。
    6. 按“分析”开始。分析大约需要3分钟,这取决于所使用的软件。
    7. 当软件完成后,进入“创建表”,并选择以下数据:好数字(表应该按照这个顺序增加),时间点,总面积每孔。
    8. 将文件保存为一个.xlm工作导出到电子表格程序。
    9. 在这个方案中,计算出每WEL面积相对增加升,在100%设定时间点1的面积。计算从时间点1-7每种条件的曲线(AUC)下的面积;的区域(Y值)的下限被设定为100%。 FSK或药物滴定(X轴)作图对AUC(Y轴)。

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Representative Results

图1A显示嵌入BMM隐窝代表新鲜隔离。隐窝是从CF受试者的结肠活检。通常情况下,从每个地穴( - C 图1A)生成的类器官。由于CFTR的功能障碍,大部分结肠的CF类器官的不囊状,而是结构紧凑,有突起和buddings( 图2A - 2B)。然而,一些CF类器官培养物,尤其是具有高的残留功能,具有与囊性形状( 图2C),像野生型类器官培养物( 图2D)几类器官。

传代的组织体扩大的培养物或接种一个FIS测定前,重要的是,组织体具有多个buddings一个大尺寸, 如图3A所示 。如果类器官都很小,不施氮umerous buddings当传代处理,则类器官培养受到负面影响。根据基本生长因子像EGF,的Wnt-3A和Rspo3质量和活性,所述类器官达到7和12天( 图3A)之间的期望的大小。机械破碎后,将buddings被破坏,并用于产生在下面的通道( 图3B)的新类器官。如果在处理组织体冻结,重要的是,它们是胰蛋白酶的小尺寸, 如图3C所示。胰蛋白酶消化后,类器官是为了让他们从操纵的压力中恢复镀1〜2天。此步骤中,用类器官的小尺寸一起,确保解冻( 图4A)之后,98%的细胞回收。

当组织体解冻,它有他们在高密度是很重要的,因此,通常情况下,它们在一个解冻小体积(Figure4A)。的组织体稀释在每10微升BMM 20-30组织体的比例,提供正确的密度-在培养一天或两天,并观察该组织体都在增加尺寸(4C比较图4B 图4A)之后成长为一个更大的尺寸。如果类器官过于稀释,它们可以缓慢增长,甚至可以分化和死亡。如果组织体过于拥挤,空间不足或生长因子的短缺也减慢了组织体的生长,并减少buddings的数量。

从有限的细胞碎片活培养组织体的电镀应导致在将组织体> 95%溶胀时FSK刺激条件,条件是足够的CFTR功能的情况下( 图5A - 5B)。类器官膨胀的基因型和药物依赖的方式,如通过用两个F508del等位基因( 图5A)和组织体化合物杂F508del和S1251N( 图5B),与一些残余的功能相关联的CFTR门控突变类器官的代表性图像示出。

定量肿胀,总钙黄绿素绿色表面区域被选择用于每个时间点并表示为T = 0的百分比(设定为100%; 图6A)。碎片和小的,非膨胀结构通常低于总面积的5%。的相对面积增加的每10分钟的时间间隔表示的,和AUC(任意单位)测量每个条件(T = 0至60分钟,基线阈值设定为100%; 图6B)中产生。我们发现AUC是最稳健的,因为它包含在膨胀开始的一些变化,以及在高CFTR功能水平超出FSK 30-40分钟的曲线关系。

图6C)。与CFTR残留功能相关组织体可之后在没有CFTR调节(预FSK条件200-220%的表面面积)的5微米FSK刺激60分钟达到高达4500 AUC单元。类器官膨胀达到在约4500 AUC单位,大概是由于类器官的结构,基底外侧离子迁移的速率限制的影响的物理限制上限,和“延伸”的条件下建立离子和流体转运动态平衡。 FSK可滴定进一步扩大在这些高的CFTR的残留功能水平的测定的动态范围,以更好地定量残留的功能或高度有效化合物治疗( 例如,通过VX770对在与下部FSK浓度刺激S1251N组织体的膨胀的较高的活性所指示的; 图6D)。

图1
图1:CF活检大肠癌组织体的建立。 (A)从被嵌入在BMM在隔离天(传代0 0天)后,直肠活检分离的材料的代表性图像。指定隐窝放大显示在右下角面板上。 (B)中相同的隐窝后在培养7天(通道0,第7天),随后。在A组提出的相同隐窝扩大所示。 ( )同一类器官文化的形象代表被拆分后第11天(第1代,第11天)。比例尺= 100微米。
159fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:来自用不同CFTR突变受试者衍生的CF结肠组织体的代表性的图像。从与F508del / F508del(A)中,F508del / R117H-7T(B)和F508del / S1251N(C)的突变受试者CF结肠组织体的代表性图像。 (D)从野生型CFTR的受试者的结肠类器官培养的代表性图像。比例尺= 100微米。没有FSK刺激获得这些图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

5159 / 55159fig3.jpg“/>
图3:处理CF结肠类器官进行维修检测,或冻结。 (A)一个CF冒号化培养的代表图像准备传代任(B)或冷冻(C)进行处理。 (B)中的机械破坏后,小片形成的,这将产生在下一通道的新类器官。 (C)的胰蛋白酶处理后,产生非常小的,圆组织体,在冷冻过程中有利于它们的生存能力。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:从冷冻类器官建立CF结化培养。 (<STRONG> A - C)解冻在第0天(A一CF结化培养的代表图像)。从同一井图像拍摄酮(B)和两个(C)的天。 (D - G)第5.9节中描述的稀释步骤的代表图像。一旦组织体已经从解冻(解冻后第3天)正确恢复,它们稀释,这样他们有空间成长(D)。从相同的图像以及拍摄六(E),(F)和解冻后十五(C)天。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5:CF的毛喉素诱导肿胀类器官。 (AB)F508del / F508del(A)或F508del / S1251N(B) - 770 VX之前或之后与FSK(5微米)在没有或存在刺激的60分钟大肠癌组织体的代表图像(3微米])或VX-770与VX-809(3微米)的组合。比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6:量化毛喉素诱导肿胀。 (A)在F508del / S1251N的图像分析软件类器官之前(0分钟)和之后用FSK(5微米)和VX770(3μM)刺激60分钟类器官区域选择的代表性图像。比例尺= 200微米。 (B)RepresFSK在VX770的不存在或存在(3微米)和/或VX809(3微米)(5微米)刺激60分钟期间F508del / F508del或F508del / S1251N组织体的相对面积增大的entative图像。下的(B)中(T = 60分钟,基线阈值= 100%)表示的条件的曲线测量(C)的面积。在不同浓度FSK的F508del / F508del或F508del / S1251N组织体曲线测量(D)区。数据代表平均值±从单一的代表性实验的SD。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里,我们提供了用于产生,膨胀,凝固,和人大肠组织体的解冻一完整的协议。虽然我们已经建立了人类器官样的文化前段时间17,它有时被证明很难建立在其他实验室的技术,而无需实际操作培训。我们预计,这些协议将取代这种培训。

的Wnt-3A条件培养基是为了在建立和维护长期化培养成功最关键的试剂之一。事实上,器官样的文化可能“撞车”暴露在低活性的Wnt-3A所决定网上平台。自的Wnt-3A条件培养基是在内部制成,有必须产生活性介质时必须考虑几个方面。活性的Wnt-3A只能与高品质的胎牛血清(FBS),其提供合适的生长信号为L细胞和的疏水稳定化介质来制造的Wnt-3A分子。当的Wnt-3A活性低( 低TOP / FOP比率,见下文),它通常是导致问题的FBS。

商业重组Wnt运作不佳,因此我们不建议你使用它的TOP / FOP的Wnt报告基因检测为阳性对照。 TOP /海肾和FOP /海肾之间的比率的条件培养基的Wnt信号活性的指示,所以好的批处理的Wnt-3A条件培养基的赋予高于25的顶/ FOP比率,比起从TOP / FOP值阴性对照:介质不暴露的Wnt-3A产生细胞。重组头蛋白和R脊椎蛋白可以通过头蛋白替换和R脊椎条件培养基28,29。

当前协议还描述了用于CFTR-FIS的测定法的功能性测试。我们最近展示了CFTR基因型和FIS以及如何体现发表CFTR genoty之间的关系从临床记录(www.CFTR2.org)25获得PE-表型关系。采用此法,以极为罕见的CFTR突变的两个人被鉴定的组织体都响应ivacaftor(VX-770)25。这种药物的处方随后导致了明确的临床反应,彰显FIS测定值与患者在没有临床试验数据的稀有突变匹配特定的药物。必不可少的FIS的定量是最佳生长和测定条件下,只有由非溶胀组织体的一个有限部分(通常低于5%)来表示。的碎片铅高水平肿胀的低估,因为非存活的,非膨胀结构的比例较大通过图像分析软件识别。

体外 FIS反应和先前建立的CFTR相关的生物标志物(汗氯化物浓度和INTEST之间的相关性INAL电流测量)的个性化水平明显在我们以前的研究19,25容易证明的。此支持的概念,即与CF患者使用FIS残余函数测量可以补充目前的方法如在个性化的方式诊断或预后标志物。相比CFTR功能的其他生物标志物,如在体内汗液氯化物浓度测量,并在体外直肠活检肠电流测量FIS测定的吞吐量,可以更好地控制技术可变性。它也提供了一个完全的CFTR依赖性的读出,并通过使用FSK的滴定准确类型残留CFTR功能的大的动态范围。

然而,FIS测定反映药物疗效的变异性的个别基因型的唯一的影响,而CF疾病的调制是通过比仅CFTR功能更多的影响。对于DRUg反应,该测定是反射一个潜在的组织反应。虽然在CFTR测量非常精确,在药动学人类变化不掺入,如在体内 7,8或直接离体的CFTR测量32相对于其他。如前面所讨论的,非CF改性剂(包括遗传和环境)也影响表型,导致在体外观察或CFTR生物标志物与临床表型2之间的脱节。此外,使用的细胞系33潜在响应的突变的识别与关于谁需要得到建立组织体的直肠活检的患者的影响较小相关联。

多CFTR靶向药物是目前正在开发1。可以预料,临床试验将不允许临床功效为b的正确预测ASED单单CFTR突变状态。作为FIS测定测量CFTR功能和药物反应功能,它可能成为选择,以确定哪些药物最适合该患者的方法。对于被包括在注册试验和对新药方式的发展的患者群体的鉴定FIS测定也可能是有用的。治疗前和治疗过程中的等离子大肠癌组织体的刺激可能有助于进一步定量血液循环CFTR调节,可能有利于个性化的剂量和药物剂量的临床试验30选拔,31功能数额。最后,FIS可能是CFTR功能以及它与它的功能的其他的大量反弹 - 远在很大程度上unknown-遗传修饰相互作用的更好的基本理解是有用的。

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Acknowledgements

这项工作是由荷兰CF基金会(NCFS),ZonMW(40-00812-98-14103)时,威廉敏娜儿童医院研究基金和CZ和Zilverenkruis / Achmea的HIT-CF项目的支持。我们要感谢S.哈大 - 米歇尔,M. Geerdink,KM去冬德格鲁特和G Berkers(小儿呼吸科,威廉敏娜儿童医院,UMC乌得勒支系)和RHJ厚文(小儿消化内科,威廉敏娜的部儿童医院,UMC乌德勒支)对接近患者获得活检为CF生物资料库的产生。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

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References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

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