मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

Developmental Biology

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Summary

यहां, हम वर्तमान मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) संस्कृति प्रोटोकॉल, CD34 में hPSCs अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया+ टेम progenitors । यह विधि या तो निश्चित या आदिम टेम प्रोग्राम करने के लिए विशेष रूप से कक्षों को निर्दिष्ट करने के लिए विहित WNT संकेतन के चरण-विशिष्ट हेरफेर का उपयोग करता है ।

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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Abstract

reअपक्षयी दवा के लिए प्रमुख लक्ष्यों में से एक पीढ़ी और टेम स्टेम सेल (HSCs) मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से व्युत्पंन का रखरखाव है । हाल ही में जब तक, HSCs में hPSCs अंतर करने के प्रयासों को मुख्य रूप से उत्पंन टेम progenitors कि क्षमता HSC कमी है, और बजाय जर्दी थैली hematopoiesis जैसा दिखता है । इन के परिणामस्वरूप टेम progenitors के लिए सीमित उपयोगिता हो सकती है इन विट्रो रोग विभिंन वयस्क टेम विकारों के मॉडलिंग, विशेष रूप से लसीकावत् वंश के उन । लेकिन, हम हाल ही में एरतरो उत्पंन करने के तरीके वर्णित है-myelo-लसीकावत् multilineage निश्चित टेम progenitors से hPSCs एक मंच का उपयोग विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल, जो हम यहां रूपरेखा का प्रयोग । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित plasticware पर hPSCs के एंजाइमी पृथक्करण के माध्यम से, embryoid निकायों (EBs) का गठन कर रहे हैं । EBs संयोजक BMP4, जो बाद में टेम अवरोध करनेवाला, GSK3β द्वारा निश्चित CHIR99021 कार्यक्रम के लिए निर्दिष्ट है द्वारा त्वक को विभेदित कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, आदिम hematopoiesis PORCN अवरोध करनेवाला, IWP2 द्वारा निर्दिष्ट है । Hematopoiesis आगे संयोजक वीईजीएफ़ और सहायक टेम साइटोकिंस के अलावा के माध्यम से संचालित है । परिणामस्वरूप टेम progenitors इस विधि का उपयोग कर उत्पन्न रोग और विकासात्मक मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, इन विट्रो में.

Introduction

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) दोनों मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) को शामिल के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, और न केवल आत्म से गुजर उचित विकास की स्थिति के तहत नवीकरण की अद्वितीय क्षमता है, लेकिन यह भी, क्षमता सभी प्रकार के कोशिका में अंतर करने के लिए तीन रोगाणु परतों से व्युत्पंन: अन्तः, त्वक, और बाह्यत्वक1। इन अद्वितीय क्षमताओं के कारण, hPSCs अपक्षयी दवा के लिए महान वादा पकड़, रोग मॉडलिंग, और कोशिका-आधारित चिकित्सा2. जबकि एकाधिक कोशिका प्रकार सफलतापूर्वक hPSCs से विभेदित किया गया है, एक महत्वपूर्ण चुनौती है विशेष रूप से वयस्क की तरह hPSC-व्युत्पंन टेम स्टेम सेल (HSCs) और निश्चित टेम progenitors के इन विट्रो विनिर्देशन में

एक hPSCs से मानव HSCs के विकास के लिए संभावना बाधा मानव भ्रूण के भीतर कई टेम कार्यक्रमों की उपस्थिति है3। पहला प्रोग्राम जो उभर रहा है, "आदिम hematopoiesis," extraembryonic जर्दी थैली ऊतक के भीतर होता है और सबसे अच्छा erythroblast progenitors (EryP-सीएफसी), मैक्रोफेज, और megakaryocytes के अपने क्षणिक उत्पादन की विशेषता है । विशेष रूप से, इस कार्यक्रम HSCs को जंम देना नहीं है, न ही यह टी और बी लसीकावत् progenitors को जंम दे । हालांकि, जर्दी थैली क्षणिक इस तरह एरतरो-माइलॉयड जनक (EMP4,5,6,7,8) के रूप में प्रतिबंधित निश्चित टेम progenitors, वृद्धि दे करता है और erythroid-आपुर्ति लसीकावत्-प्रधानमन्त्री multipotent जनक (LMPP) । हालांकि, न तो EMPs और न ही LMPPs पूरी तरह से multipotent हैं, या वयस्क प्राप्तकर्ताओं में HSC-like engraftment में सक्षम हैं । इसके विपरीत, बाद में विकास में, प्रतिष्ठित परिभाषित "निश्चित" टेम कार्यक्रम महाधमनी में निर्दिष्ट किया गया है-gonad भ्रूण के mesonephros क्षेत्र उचित, टेम सहित सभी वयस्क HSC वंश को जंम दे रही है । इन अंतर भ्रूण निश्चित टेम कोशिकाओं के विनिर्देशन एक पायदान पर निर्भर फैशन में होता है, एक endothelial के माध्यम से-टेम संक्रमण hemogenic endothelium से (वह)3,10,11 ,12,13,14. एक तरफ पुनर्गठन क्षमता, multilineage क्षमता और पायदान-निर्भरता इन कोशिकाओं की EMP और LMPP से इन निश्चित टेम progenitors भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सन्दर्भ में समीक्षित3,13 ).

तंत्र (ओं को समझना) hPSCs से आदिम और निश्चित टेम विनिर्देश शासी progenitors लाइनों की एक किस्म भर में निश्चित टेम hPSC के प्रतिलिपि उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । हाल ही में जब तक, hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अलग सकता है multipotent आदिम और निश्चित टेम progenitors मौजूद नहीं था15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. कई भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और/या stromal सह संस्कृति का उपयोग कर दृष्टिकोण पहले hPSC भेदभाव की टेम क्षमता रेखांकित, आदिम और निश्चित टेम संभावित15,16के मिश्रण के साथ, 17,19,22,23,25. इसके अलावा, कई सीरम मुक्त टेम प्रोटोकॉल hPSCs से त्वक के विनिर्देशन के लिए संकेत आवश्यकताओं का वर्णन किया है कि बंदरगाह टेम संभावित18,20,21, 24. हालांकि, इन तरीकों के रूप में अभी भी दोनों कार्यक्रमों के विषम मिश्रण को जंम दिया, नैदानिक अनुप्रयोगों में उनके उपयोग और विकास तंत्र को समझने सीमित किया जा सकता है ।

हम हाल ही में इन अध्ययनों पर बनाया गया है, ACTIVIN/नोडल और WNT से आदिम और निश्चित टेम विनिर्देशन में संकेतन के लिए मंच विशिष्ट संकेत आवश्यकताओं को रेखांकित कर-व्युत्पंन त्वक18,26 . बाद विशेष रूप से अनूठा था, मंच के अपने प्रयोग के रूप में विशिष्ट WNT संकेत हेरफेर या तो विशेष रूप से आदिम या विशेष रूप से निश्चित टेम progenitors26के विनिर्देशन के लिए अनुमति देता है । त्वक विनिर्देश के दौरान, विहित WNT के निषेध PORCN अवरोधक के साथ संकेतन CD43 के विनिर्देशन में IWP2 परिणाम+ EryP-सीएफसी और माइलॉयड progenitors, कोई जासूसी लसीकावत् क्षमता के साथ । इसके विपरीत, विहित WNT की उत्तेजना GSK3β अवरोध करनेवाला के साथ संकेतन, CHIR99021, विभेद के एक ही चरण के दौरान detectable CD43 के पूर्ण अभाव में हुई+ EryP-सीएफसी, जबकि एक साथ करने के लिए अग्रणी CD34+CD43 के विनिर्देशन । इस आबादी के पास माइलॉयड, HBG-एक्सप्रेस erythroid, और टी-लसीकावत् क्षमता । बाद में विश्लेषण इस वह CD73 की अभिव्यक्ति की कमी के रूप में की पहचान की27,28 और CD18428, और उसके टेम क्षमता पायदान पर निर्भर28था । इसके अलावा, एकल सेल क्लोनल विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि इन निश्चित टेम वंश multipotent एकल कोशिकाओं से प्राप्त हो सकता है28। एक साथ ले लिया, इन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि चरण-विशिष्ट WNT संकेत हेरफेर या तो शुद्ध आदिम टेम progenitors, या multipotent पायदान निर्भर निश्चित टेम progenitors निर्दिष्ट कर सकते हैं ।

यहां, हम अपने भेदभाव की रणनीति रूपरेखा कि पैदावार विशेष रूप से आदिम या निश्चित टेम progenitors, विहित WNT mesodermal patterning के दौरान संकेतन के हेरफेर के द्वारा, और उनके बहाव टेम वंश परख । इस प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं जो या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors के hPSCs से अपक्षयी दवा अनुप्रयोगों के लिए के उत्पादन में रुचि रखते है के लिए महान मूल्य की है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. रिएजेंट

  1. सेल लाइंस; hESCs या hiPSCs < सुप वर्ग = "xref" > 1 , माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) < सुप क्लास = "xref" > 29 , OP9-DL4 स्ट्रोमा < सुप क्लास = "xref" > 30 , < सुप वर्ग = "xref" > ३१ .
  2. रिएजेंट वडा
    1. पंजाबियों में जिलेटिन की ०.१% w/ autoclaving और स्टोर द्वारा बंध्याकरण 4 & #176; ग के बाद aliquoting.
      1. जिलेटिन कोटेड plasticware तैयार करते हैं । कोट 6-०.१% जिलेटिन समाधान की १.५ मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से व्यंजन । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन । तुरंत उपयोग करने से पहले, महाप्राण शेष जिलेटिन समाधान ।
    2. 15% वी/वी IMDM और 1x & #160; एंटीबायोटिक्स के साथ FBS बनाकर MEF मीडिया तैयार करें । 2 मिमी L-glutamine और ४०० & #181 के साथ अनुपूरक; M monothioglycerol (MTG) का उपयोग करने से पहले और स्टोर पर 4 & #176; C.
    3. 20% वी/वी नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) के साथ DMEM/F12 के समाधान के रूप में hPSC संस्कृति मीडिया तैयार, 1x & #160; गैर-आवश्यक अमीनो अम्ल (NEAA), 1x & #160; एंटीबायोटिक्स, ५५ & #181; M & #946;-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, और 10 एनजी/एमएल bFGF । फ़िल्टर 2 & #181 के साथ निष्फल करने के लिए; मीटर फिल्टर और अंधेरे में स्टोर 4 पर & #176; C.
    4. 5% वी/वी KOSR और 4 मिमी एचसीएल के साथ DMEM/F12 के समाधान के रूप में सीरम मुक्त धोने मीडिया तैयार करते हैं । एक 2 & #181 के साथ निष्फल करने के लिए फ़िल्टर करें; एम फिल्टर, aliquot, और अंधेरे में स्टोर 4 & #176; ग.
    5. एक 1 मिलीग्राम/एमएल DNase मैं DNase मैं 3-4 एच के लिए बर्फ में ठंडा, बाँझ पानी की बर्फ पर भंग द्वारा समाधान कर । एक 2 & #181 के साथ निष्फल करने के लिए फ़िल्टर; m फ़िल्टर और store aliquots पर-20 & #176; C.
    6. वॉश मीडिया के साथ स्टॉप सॉल्यूशन तैयार करें: 10% FBS और 10 & #181; g/मब DNase I STOP समाधान का उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए ।
    7. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स तैयार ( जैसे , matrigel, मेट hereon के रूप में भेजा) मिश्रण समाधान ।
      नोट: सभी कदम की तैयारी और चटाई मिश्रण का उपयोग बर्फ पर किया जाना चाहिए या पर 4 & #176; c. गल जमे हुए चटाई पर बर्फ में 4 & #176; ग रात भर । 10 मिलीलीटर बर्फ-शीत IMDM और बर्फ में 4 & #176; ग रात भर में ठंड जोड़कर 1:1 चटाई पतला । एक अतिरिक्त 20 मिलीलीटर बर्फ के साथ चटाई मिश्रण पतला-ठंडा IMDM और बर्फ में ठंडा 4 & #176; सी रात भर में । Aliquot में प्री-चिलीज ट्यूबों और स्टोर पर-20 & #176; C तक उपयोग करें । उपयोग के लिए तैयार होने पर, गल मेट मिक्सचर रात भर 4 & #176; सी.
      1. कोट चटाई सेल कल्चर प्लेट्स.
        नोट: कोटिंग चटाई प्लेटों के सभी कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । पूर्व चिल 6-अच्छी तरह से और 24-अच्छी तरह से प्लेटों पर-20 & #176; ग के लिए कम से 1 ज. जब कोट प्लेटों के लिए तैयार है, उंहें बर्फ पर जगह है । कोट 4x पतला चटाई के साथ एक अच्छी तरह से, हटाने और फिर से किसी भी अतिरिक्त समाधान का उपयोग कर । 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दो, और महाप्राण अतिरिक्त चटाई । एक ३७ & #176 में चटाई लेपित प्लेटें सूखी; C 5% सह 2 मशीन की एक ंयूनतम के लिए 3 h. कोटिंग के ७२ एच के भीतर का उपयोग करें.
    8. 10% w/वी BSA को भंग करके 10% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) का समाधान तैयार करें आइस-कोल्ड में, आसुत, जल 4 & #176; c के लिए 3-4 h. फ़िल्टर के साथ बंध्याकरण करने के लिए एक 2 & #181; मी फिल्टर एक हल्की-अवरुद्ध बोतल में और स्टोर पर 4 & #176; c.
    9. ascorbic एसिड समाधान तैयार करते हैं । धीरे से भंग एक 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर-बर्फ में ascorbic एसिड की ठंड, आसुत, बर्फ पर पानी के लिए 3-4 घंटे के भंवर के लिए कभी नहीं भंग जब तक । एक 2 & #181 के साथ निष्फल करने के लिए फ़िल्टर; m फ़िल्टर और store aliquots पर-20 & #176; C.
    10. IMDM के 75:25 का समाधान करके सीरम मुक्त विभेद (SFD) मीडिया तैयार: हैम & #39; एस एफ-12, तो ०.५% BSA, 1x & #160; B27, और 0.5 x & #160; N2 सप्लीमेंट्स जोड़ें. स्टोर पर 4 & #176; ग. Add 1x & #160; L-glutamine, ५० & #181; g/एमएल ascorbic एसिड, ४०० & #181; एम MTG, और १५० & #181; g/mL holo-कैल्सीटोनिन तुरंत उपयोग करने से पहले.
    11. तैयार सीरम मुक्त स्टेम सेल संस्कृति मीडिया ( जैसे , StemPro, SP34 hereon के रूप में संदर्भित) निर्माता & #39; एस निर्देश के अनुसार । स्टोर पर 4 & #176; ग. Add 1x & #160; L-glutamine, ५० & #181; g/एमएल ascorbic एसिड, ४०० & #181; एम MTG, और १५० & #181; g/mL holo-कैल्सीटोनिन तुरंत उपयोग करने से पहले.
    12. Collagenase द्वितीय को भंग करके ०.२% Collagenase द्वितीय समाधान तैयार करें ०.२% w/v के एक अंतिम एकाग्रता में 1:4 FBS: पंजाबियों समाधान । भंग में ३७ & #176; c जल स्नान के लिए एक 2 & #181 के साथ समाधान निष्फल करने के लिए फ़िल्टर; एम फिल्टर और स्टोर aliquots पर-20 & #176; c.
    13. प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) बफ़र 5% FBS के समाधान के रूप में तुरंत पहले उपयोग करने के लिए IMDM के रूप में तैयार करें ।
    14. & #945 के समाधान के रूप में OP9 मीडिया तैयार;-मेम, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, and 1x & #160; एंटीबायोटिक दवाओं । 2 & #181 के साथ निष्फल करने के लिए फ़िल्टर करें; m फ़िल्टर और 4 & #176 पर स्टोर; C.
    15. प्राप्त methylcellulose आधारित मीडिया ( जैसे , MethoCult, MeC hereon के रूप में संदर्भित) के रूप में पूर्व aliquoted 3 मिलीलीटर मात्रा या एक १०० मिलीलीटर की बोतल के रूप में । यदि १०० मिलीलीटर MeC का उपयोग कर, आगमन पर, 14 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में २.५ मिलीलीटर aliquots में विभाजित ।
      नोट: सभी aliquots को-20 & #176 पर संग्रहित करना चाहिए; C. MeC मध्यम aliquots का उपयोग करने से तुरंत पहले गल जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 2. hPSCs

  1. बढ़ने के त्वक विभेद hPSC पर MEFs सेल लाइनों को ७०-८०% तक प्रवाहित करना, एक ३७ & #176; ग मशीन के साथ 5% कं 2 .
    नोट: hPSCs तेज, विभेदित सीमाओं होना चाहिए ।
  2. तैयार MAT-लेपित plasticware 24 ज पहले passaging द hPSCs.
    नोट: चटाई-लेपित 6-अच्छी व्यंजन की कुल संख्या hPSC रेखाओं में भिंन होती है । आम तौर पर, तीन 6-अच्छी तरह से व्यंजन 6 के प्रति पर्याप्त है-MEFs पर धाराप्रवाह hPSCs के अच्छी तरह से पकवान ।
    1. एक परीक्षण फीडर प्रदर्शन-धाराप्रवाह hPSCs के विभिन्न अनुपात के साथ घट: मेट वेल्स (1:4, 1:3, 1:2, आदि ) पहले भेदभाव से पहले निर्धारित करने के लिए कितने चटाई लेपित 6-अच्छी तरह से बर्तन बाद के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
      नोट: 24 एच चटाई पर चढ़ाना के बाद, hPSCs के आकार में लगभग 10-20 कोशिकाओं के सेल झुरमुट के साथ ८०-९०% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
  3. महाप्राण hPSC मीडिया और जोड़ें 1 मिलीलीटर ३७ & #176; C ०.२५% Trypsin-EDTA के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1 min. महाप्राण के लिए और एक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर बंद मीडिया जोड़ें । एक सेल खुरचनी का उपयोग करना, प्लेट बंद कोशिकाओं परिमार्जन. प्रत्येक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर धोने बफर जोड़ें ।
    1. के साथ 2 मिलीलीटर सीरम प्लास्टिक, triturate 3-5 बार कोशिकाओं के बड़े झुरमुट को तोड़ने और कोशिकाओं को एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब हस्तांतरण करने के लिए । 5 min.
    2. के लिए ३३० x g पर hPSCs केंद्रापसारक
  4. hPSC मीडिया की कुल मात्रा के बराबर चटाई-लेपित plasticware के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं reसस्पैंड । plasticware के लिए hPSCs के 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से जोड़ें और एक ३७ & #176 में रातोंरात मशीन; सी मशीन के साथ 5% कं 2 .
  5. 24 ज बाद म, महाप्राण के साथ मीडिया और स्थ ३७ & #176; ग ०.०५% Trypsin-EDTA के लिए 1 min. महाप्राण Trypsin-EDTA और 1 मिलीलीटर रोक मीडिया जोड़ें । कोशिकाओं को सख्ती से एक सेल खुरचनी के साथ परिमार्जन । एक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर धो मीडिया जोड़ें । एक 2 मिलीलीटर सीरम प्लास्टिक के साथ, triturate कोशिकाओं 1-2 बार और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 5 min.
    के लिए २२० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक नोट: Trypsin-EDTA उपचार shou के समय की लंबाईld प्रत्येक hPSC लाइन के लिए जांचकर्ता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । Trypsin उपचार एकल सेल पृथक्करण के कारण के बिना संभव के रूप में लंबे समय के लिए लागू किया जाना चाहिए । यह चरण चटाई-लेपित प्लेटों से सभी hPSCs को अलग करना चाहिए, लेकिन एकल-कक्ष पृथक्करण में परिणाम नहीं । परिणामी EBs 6-10 कक्ष, औसत पर होना चाहिए.
  6. मीडिया को
  7. महाप्राण । एक 5 मिलीलीटर सीरम प्लास्टिक का उपयोग करना, धीरे 20 मिलीलीटर धोने मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड । 5 min.
  8. के लिए २२० x g पर केंद्रापसारक
  9. धीरे 0 मीडिया ( तालिका 1 ) दिन में EBs reसस्पेंड । भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर EBs युक्त एक 6 अच्छी तरह से कम अनुयाई सेल संस्कृति एक 10 मिलीलीटर सीरम प्लास्टिक का उपयोग कर पकवान के एक कुआं में बांटना । एक ३७ & #176 में जगह; ग 5% कं 2 5% O 2 (बहु गैस) मशीनी.
    नोट: दिवस 0 मीडिया: SFD मीडिया के साथ पूरक 10 एनजी/एमएल BMP4 ( तालिका 1 ) । hPSCs की हर दो प्लेटों के लिए, एक 6-अच्छी तरह से कम अनुयाई सेल कल्चर डिश का उपयोग करें ।
  10. 24 ज बाद में, 2 मिलीलीटर दिन 1 मीडिया जोड़ें ( तालिका 1 ) । एक बहु गैस मशीन में रात भर कोशिकाओं गर्मी ।
    नोट: दिवस 1 मीडिया: SFD मीडिया के साथ पूरक 10 एनजी/एमएल BMP4 और 10 एनजी/एमएल bFGF के लिए एक अच्छी तरह से ( तालिका 1 ) ।
  11. 18 ज बाद में, धीरे एक 5 मिलीलीटर सीरम प्लास्टिक के साथ EBs फसल और 5 मिनट के लिए १०० x g पर स्पिन धो और 10 मिलीलीटर IMDM के साथ पूरी संस्कृति गठबंधन । 5 मिनट के लिए १०० x g पर स्पिन मीडिया महाप्राण.
    नोट: मलबे संस्कृतियों में मौजूद होगा । एक कम गति (१०० x g) पर इस केंद्रापसारक कदम मलबे को दूर करेगा ।
  12. धीरे SFD मीडिया के दिन 2 मीडिया (तालिका 1) के साथ पूरक में EBs reसस्पेंड, और फिर 6 में अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर बांट-well कम अनुयाई सेल संस्कृति प्लेटें । एक ३७ में मशीन & #176; सी बहु गैस मशीन के लिए 30 ज.
    नोट: दिवस 2 मीडिया: 10 एनजी/एमएल BMP4, और 5 एनजी/एमएल bFGF, और उपयुक्त WNT एगोनिस्ट या विरोधी ( तालिका 1 ) ।
    1. Add 3 & #181; मी CHIR99021 निर्दिष्ट निश्चित टेम progenitors. वैकल्पिक रूप से, जोड़ 3 & #181; M IWP2 और 1 एनजी/एमएल Activin एक आदिम टेम progenitors.
    2. निर्दिष्ट करने के लिए
  13. टेम जनक विनिर्देशन के लिए धारा 3 के लिए जारी रखें ।
< p class = "jove_title" > 3. CD34 के विनिर्देशन + टेम Progenitors

  1. 30 ज के बाद, एक 2 मिलीलीटर EBs सीरम के साथ अलग अंतर के 3 दिन में प्लास्टिक । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए ३३० x g पर केंद्रापसारक । धीरे reसस्पेंड और IMDM के 10 मिलीलीटर के साथ धो लो । 5 min.
  2. के लिए ३३० x g पर फिर से कोशिकाओं को केंद्रापसारक
  3. दिन में EBs reसस्पेंड 3 मीडिया ( तालिका 2 ) और कम-अनुयाई 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुआं में 2 मिलीलीटर वितरण । एक ३७ में कोशिकाओं की मशीन & #176; सी मल्टी गैस मशीन के लिए ७२ h.
    नोट: दिवस 3 मीडिया: SP34, 15 एनजी/एमएल वीईजीएफ़ और 5 एनजी/एमएल bFGF ( तालिका 2 ) के साथ पूरक । अधिक मीडिया के प्रति अच्छी तरह से जोड़ें अगर भेदभाव के 3 दिन पर काटा मीडिया के पीएच काफी बदल गया है ( यानी , पीला ऑरेंज मीडिया) । वैकल्पिक रूप से, दिन पर अच्छी तरह से प्रति कम EBs का उपयोग करें 0.
  4. के बाद ७२, एक अच्छी तरह से करने के लिए दिन 6 मीडिया ( टेबल 2 ) के 2 मिलीलीटर जोड़ें । एक ३७ & #176 में मशीन; सी बहु गैस मशीन के लिए एक अतिरिक्त ४८ एच
    नोट: दिवस 6 मीडिया: SP34 मीडिया 15 एनजी/एमएल वीईजीएफ़, 5 एनजी/एमएल bFGF, २०० एनजी/एमएल एससीएफ, 4 IU ईपीओ, 20 एनजी/एमएल आईएल-6, 10 एनजी/एमएल il-11, और ५० एनजी/एमएल IGF-1 ( टेबल 2 ) के साथ पूरक । अधिक मीडिया चरण ३.१ में जोड़ा गया था, तो अंतिम cytokine सांद्रता समान रहते हैं ताकि चरण ३.२ में मीडिया के समतुल्य राशि जोड़ें ।
  5. अलग CHIR99021-इलाज EBs भेदभाव के 8 दिन पर । धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।
  6. IWP2-स्वास्थ्यकर्मी EBs एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में भेदभाव के 8 दिन पर काटा जाता है । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर केंद्रापसारक धीरे दिन 8 मीडिया ( तालिका 2 ) में reसस्पेंड । एक ३७ & #176 में 24 ज के लिए मशीन; C 5% सह 2 कम अनुयाई व्यंजन में मशीन । धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: दिवस 8 मीडिया: SP34 मीडिया १०० एनजी के साथ पूरक/एमएल एससीएफ, 2 IU ईपीओ, 10 एनजी/एमएल इल-6, 5 एनजी/एमएल il-11, 25 एनजी/एमएल IGF-1, 30 एनजी/एमएल टीपीओ, 10 एनजी/एमएल Flt3-एल, और 30 एनजी/एमएल आईएल-3 ( टेबल 2 ) ।
< p class = "jove_title" > 4. एंजाइमी पृथक्करण EBs और टेम जनक के अलगाव

  1. एक EBs सीरम के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अलग । supernatant.
  2. बंद 5 min. महाप्राण के लिए ३३० x g पर केंद्रापसारक
  3. को EBs के लिए ०.२५% Trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 5 एस के लिए भंवर एक ३७ & #176 में, 8 मिनट के लिए सी पानी स्नान. STOP समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें । supernatant.
  4. बंद 5 min. महाप्राण के लिए ३३० x g पर केंद्रापसारक
  5. Collagenase द्वितीय के 5 मिलीलीटर में EBs को पुनर्निलंबित । 5 एस के लिए भंवर और एक ३७ में मशीन & #176; सी जल स्नान । ६० मिनट के बाद, 5 एस के लिए भंवर और रोकने के समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर स्पिन supernatant.
  6. बंद महाप्राण FACS बफर के 1 मिलीलीटर में
  7. , कोशिकाओं reसस्पेंड । एक ४० & #181; मी सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को पारित । यह किसी भी undissociated सेल के झुरमुट को हटा देता है ।
  8. गणना कोशिकाओं । Aliquot 1 x 10 6 कोशिकाओं को एक 14 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर कोशिकाओं को स्पिन । 5 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल FACS बफर में से एक एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पैंड । Aliquot और पूल प्रवाह cytometric रंग नियंत्रण के लिए प्रत्येक स्थिति में कक्षों का 10% । बर्फ पर 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी में कोशिकाओं को गर्मी, अंधेरे में ।
    नोट: सामग्री के तालिका में सुझाए गए fluorophore संयोजन देखें । IWP2-उपचारित कोशिकाओं के लिए
    1. , एंटी-CD34 और एंटी-CD43 एंटीबॉडी का उपयोग करें.
    2. CHIR99021-उपचारित कोशिकाओं के लिए
    3. , एंटी-CD34, एंटी-CD43, एंटी-CD73, और एंटी-CD184 एंटीबॉडी का उपयोग करें ।
  9. FACS बफ़र का उपयोग करते हुए कक्षों को दो बार कुल्ला । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर स्पिन । 5 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड/
  10. का विश्लेषण करें या cytometry प्रवाह द्वारा कक्षों को अलग करें । आदिम टेम progenitors के लिए, CD34 और CD43 अभिव्यक्ति का विश्लेषण (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ). त्यात निश्चित टेम progenitors, अलग कर द वे (CD34 + CD43 & #8722; CD73 & #8722; CD184 & #8722; ) by FACS (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ). द्रुतशीतन FACS बफर युक्त ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा.
  11. के लिए अलग से निश्चित टेम क्षमता का आकलन करने के लिए, endothelial के लिए या तो धारा 5 के लिए जारी रखने के लिए टेम संक्रमण, या टी के लिए धारा 7-लसीकावत् परख । आदिम टेम सीएफसी परख के लिए, धारा 6.
  12. के लिए जारी रखें
< p class = "jove_title" > 5. Endothelial-to-टेम संक्रमण

  1. स्पिन अलग-थलग CD34 + CD43 & #8722; CD73 & #8722; CD184 & #8722; कोशिकाओं पर 5 मिनट के लिए ३३० x g. पुनर्निलंबित कक्ष में वह मीडिया में २००,००० कक्ष/एमएल & #160;( तालिका 2 ) । कक्षों को ५० में वितरित करें & #181; L aliquots एक ९६-वेल कम अनुयाई सेल कल्चर प्लेट में. एक ३७ में रात भर कोशिकाओं मशीन & #176; ग 5% कं 2 5% O 2 बहु गैस मशीनी.
    नोट: वह मीडिया: SP34 5 एनजी/एमएल वीईजीएफ़, 5 एनजी/एमएल bFGF के साथ पूरक मीडिया, १०० एनजी/एमएल एससीएफ, 2 IU ईपीओ, 10 एनजी/एमएल आईएल-6, 5 एनजी/एमएल आईएल-11, 25 एनजी/एमएल IGF-1, 30 एनजी/एमएल टीपीओ, 10 एनजी/एमएल FLT3-एल, 30 एनजी/, 10 एनजी/एमएल BMP4, 20 एनजी/एमएल श्श्श, 10 & #181; जी/एमएल एन्जियोटेन्सिन II, और १०० & #181; M लोसरटान पोटेशियम पर 2 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल ( टेबल 2 ).
  2. 24-अच्छी तरह से चटाई-लेपित प्लेटें (चरण 1.2.7.1 देखें), आवश्यकतानुसार तैयार करें ।
  3. कोशिकाओं को रातोंरात 6-10 कोशिकाओं के झुरमुट में समग्र होगा । प्रत्येक ५० के लिए & #181; L समेकित कोशिकाओं की मात्रा, धीरे अगली सुबह पर एक 24-अच्छी तरह से चटाई लेपित थाली के केंद्र में कोशिकाओं को स्थानांतरित. धीरे ३७ & #176 में प्लेट प्लेस; सी मल्टी गैस मशीन 4-6 एच के लिए, जब तक कोशिकाओं संलग्न हैं.
  4. एक अच्छी तरह से ताजा वह मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें, के बाद कोशिकाओं संलग्न हैं । एक ३७ में कोशिकाओं की मशीन & #176; ग 5% कं 2 5% O 2 बहु गैस मशीन जब तक टेम कोशिकाओं दिखाई दे रहे है (आम तौर पर 5-7 दिन; < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ). 100X आवर्धन के तहत कल्पना एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।
  5. फसल निश्चित टेम progenitors धीरे से कोशिकाओं से वह मीडिया को हटा कर । एक ४० & #181 के माध्यम से इस मीडिया को पारित; मी सेल छलनी और इकट्ठा । अनुयाई कोशिकाओं को अच्छी तरह से करने के लिए, जोड़ें ०.५ मिलीलीटर ०.२५% Trypsin-EDTA पर कोशिकाओं और मशीन के लिए ३७ & #176; C for 5 min. जोड़ें ०.५ मिलीलीटर रोक प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान । समान ४० & #181 के माध्यम से कक्षों के माध्यम से पास करें; सभी अनुयाई और गैर-अनुयाई कक्षों को एक साथ पूल करने के लिए m सेल छलनी । 5 min. के लिए ३३० x g पर स्पिन
    1. इस थोक संस्कृति की सीएफसी क्षमता का आकलन करने के लिए, धारा 6 के लिए आगे बढ़ें ।
  6. FACS बफ़र में दो बार कक्षों को धोएं । 5 min.
  7. के लिए ३३० x g पर स्पिन
  8. 5 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में FACS बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड । विरोधी के साथ कोशिकाओं दाग-CD45 और विरोधी अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए CD34 एंटीबॉडी (सुझाया fluorophores सामग्री के तालिका में हैं).
  9. FACS बफ़र में दो बार कक्षों को धोएं । 5 min.
  10. के लिए ३३० x g पर स्पिन
  11. अलग कर द CD34 + CD45 + कोशिकाओं को FACS (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2E ). कक्षों को ठंडा FACS बफ़र में सॉर्ट करें ।
  12. का आकलन निश्चित CD34 + CD45 + टेम progenitors की जरूरत के रूप में (6 धारा में सीएफसी परख, धारा 7 में लसीकावत् क्षमता, या किसी अंय अन्वेषक-परख शुरू की) ।
< p class = "jove_title" > 6. सीएफसी परख एक सीएफसी परख के लिए इस्तेमाल किया नमूना के लिए MeC के
  1. गल aliquots ।
  2. कोशिकाओं को परख करने के लिए जोड़ें (चरण ४.५, ४.७, ५.५ या ५.९) MeC में । भंवर अच्छी तरह से और चलो MeC संस्कृतियों 5-10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ जब तक हवा बुलबुले नष्ट करना, निर्माता & #39 के अनुसार; एस निर्देश । एक 16 & #189 का उपयोग करना; एक 3 मिलीलीटर सिरिंज पर गेज सुई, ध्यान से MeC के 2 मिलीलीटर निकालें.
    नोट: ठेठ चढ़ाना घनत्व रेंज से १,०००-२०,००० कोशिकाओं/एमएल, प्रत्याशित जनक आवृत्ति के आधार पर ।
  3. ध्यान से, २ ३५ मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर MeC सेल मिश्रण बांटना । समान रूप से ३५ mm व्यंजन में धीरे से दोहन और पकवान घूर्णन द्वारा MeC वितरित । एक 15 सेमी ऊतक संस्कृति पानी से भरा पकवान में ऊपर पकवानों में से प्रत्येक प्लेस । एक ३७ में मशीन & #176; ग 5% सह 2 मशीनी.
  4. MeC संस्कृतियों 40X & #160 का उपयोग कर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कल्पना; आवर्धन । विभिंन सीएफसी मात्रा में प्राप्त की । चढ़ाना के बाद आदिम सीएफसी परख 8-10 दिनों का विश्लेषण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ). चढ़ाना निश्चित सीएफसी परख 14 दिनों के बाद विश्लेषण । प्रतिनिधि सीएफसी परख कॉलोनी morphologies में देखा जा सकता है < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2F .
< p class = "jove_title" > 7. टी सेल परख निश्चित टेम क्षमता को स्थापित करने के लिए

  1. बढ़ने OP9-DL4 कोशिकाओं में धाराप्रवाह तक एक १०० mm टिशू कल्चर डिश < सुप क्लास = "xref" > 30 , < सुप क्लास = "xref" > 31 , < सुप वर्ग = "xref" > ३२ .
    1. गल द OP9-DL4 कोशिकाओं ७२-९६ एच टी सेल परख चढ़ाना करने से पहले । 10 मिलीलीटर OP9 मीडिया में OP9-DL4 कोशिकाओं reसस्पेंड और एक 10 सेमी प्लेट में बांटना । एक ३७ & #176 में वृद्धि; ग 5% कं 2 मशीन ७० तक-९०% धाराप्रवाह.
    2. एक १०० mm डिश से OP9-DL4 कोशिकाओं फसल के लिए, मीडिया को हटाने और 5 मिलीलीटर ०.२५% Trypsin-EDTA 5 मिन के लिए जोड़ें । Trypsin गतिविधि को 5 मिलीलीटर OP9 मीडिया के साथ रोकें । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर कोशिकाओं स्पिन । 1 मिलीलीटर OP9 मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड और कोशिकाओं की गिनती ।
      नोट: १ १० सेमी प्लेट ऑफ धाराप्रवाह OP9-DL4 कोशिकाओं लगभग 10 x 10 6 OP9-DL4 कोशिकाओं निकलेगा ।
    3. ४८ एच टी सेल की परख करने से पहले, प्लेट 2 x 10 6 कोशिकाओं में 12 मिलीलीटर OP9 मीडिया में एक 24 अच्छी तरह से पकवान (०.५ मिलीलीटर/ Grow in a ३७ & #176; C 5% सह 2 मशीनी.
  2. जोड़ें २,०००-१०,००० कोशिकाओं को परख (के रूप में चरणों में प्राप्त ४.५, ४.७, ५.५, या ५.९) 1 के लिए DL4 मीडिया में OP9-OP9 कोशिकाओं का अच्छी तरह से पूरक: 30 एनजी/एमएल एससीएफ (पहले 6 दिन केवल), 5 एनजी/एमएल IL-7, और 5 एनजी/एमएल FLT3-एल एक ३७ में मशीन & #176; ग 5% कं 2 इंक ubator । इस चरण में कोई मीडिया परिवर्तन नहीं हो ।
  3. हर 4-5 दिन, एक 6-अच्छी तरह से पकवान में ताजा OP9-DL4 stromal कोशिकाओं पर टी सेल progenitors बीतने । Triturate के साथ कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर प्लास्टिक और एक ४० & #181; मी फिल्टर के झुरमुट को हटाने के माध्यम से गुजरती है । 5 मिनट के लिए ३३० x जी पर स्पिन मीडिया बंद महाप्राण । ताजा OP9 मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड 5 एनजी/एमएल IL-7 और 5 एनजी/एमएल Flt3-एल, और ताजा OP9-DL4 कोशिकाओं पर जगह के साथ पूरक ।
    नोट: ४८ ज से पहले passaging, प्लेट 2 x 10 6 ताजा OP9-DL4 कोशिकाओं में 12 मिलीलीटर OP9 मीडिया, और वितरित 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से 6 व्यंजनों में ।
  4. सह-संस् कृत के कम से 21 दिनों के बाद
  5. , कोशिकाओं को सख्ती से triturate और सेल के मलबे को हटाने के लिए एक ४० & #181; m फ़ लि् टर से गुजरें । 5 मिनट के लिए ३३० x g पर स्पिन और महाप्राण supernatant.
  6. कोल्ड FACS बफर में दो बार कोशिकाओं को धो लें । 5 min.
  7. के लिए ३३० x g पर स्पिन
  8. 5 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में FACS बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड । विरोधी CD45, विरोधी CD56, विरोधी सीडी के साथ कोशिकाओं दाग, और अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए विरोधी सीडी एंटीबॉडी (सुझाव fluorophore संयोजन सामग्री के तालिका में हैं) । विश्लेषण से मलबे को हटाने के लिए एक जीवित/डेड सेल दाग (DAPI, आदि ) लागू करें ।
  9. FACS बफ़र में दो बार कक्षों को धोएं । 5 min.
  10. के लिए ३३० x g पर स्पिन T-लिम्फोसाइट progenitors की उपस्थिति का आकलन करने के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण
  11. (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ).

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Representative Results

एक योजनाबद्ध hPSCs से आदिम और निश्चित टेम progenitors की प्रेरण चित्रण चित्रा 1में सचित्र है । विहित WNT संकेतन द्वारा त्वक patterning भेदभाव के 2-3 दिनों के दौरान होता है, टेम जनक विनिर्देश द्वारा पीछा किया ।

प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण और कॉलोनी hPSC के methylcellulose परख बनाने-व्युत्पंन टेम भेदभाव संस्कृतियों में दिखाया गया है चित्रा 2। IWP2-स्वास्थ्यकर्मी विभेद संस्कृतियों एक विशिष्ट CD34+CD43 और CD34कम/CD43+ जनसंख्या निकलेगा, जबकि CHIR-स्वास्थ्यकर्मी विभेद संस्कृतियों का & #60 होगा; 1% CD43+ कोशिकाओं के 8 दिन पर विभेद (चित्र 2a, ख)26. आदिम टेम progenitors IWP2 शर्तों के तहत व्युत्पंन 9 दिन पर पृथक मुख्य रूप से आदिम erythroid (EryP-सीएफसी) और progenitors परख में माइलॉयड methylcellulose को जंम दे देंगे, जबकि CHIR-संस्कृतियों का इलाज काफी हद तक सीएफसी से रहित हो जाएगा इस स्तर पर संभावित (चित्रा 2cएफ) । इसके बजाय, CD34+CD43- CHIR99021 उपचार से प्राप्त जनसंख्या एक विषम जनसंख्या है, जिसमें endothelial progenitors है, साथ ही CD34+CD43-CD73-CD184- वह ( चित्रा 2 बी), जो जब FACS द्वारा पृथक, शुरू में endothelial की तरह कोशिकाओं (चित्रा 2d, बाएं पैनल), कि फिर एक endothelial-टेम संक्रमण, दौर में जिसके परिणामस्वरूप के एक monolayer फार्म होगा, refractile गैर अनुयाई टेम कक्ष (चित्र 2d, दायां फलक) । इन टेम कोशिकाओं को CD34 और CD45 (figure 2E) की अभिव्यक्ति के लिए फ्लो cytometry से आंका जा सकता है । टेम progenitors EHT परख से अलग methylcellulose परख में इस्तेमाल किया जा सकता है और बड़ी फट को जंम देने की तरह erythroid कॉलोनी बनाने इकाइयों (BFU-e), छोटे erythroid कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU-e), और माइलॉयड progenitors (CFU-M; चित्रा 2F).

चित्रा 3 में CHIR99021-व्युत्पन्न CD34 से टी-लिम्फोसाइट की परख क्षमता के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric िरा को दर्शाया गया है+CD43CD73CD184 टेम progenitors (फिगर3) और IWP2-व्युत्पंन (चित्र बी) CD34+CD43 टेम progenitors, OP9-DL4 सह-संस्कृति के 21 दिनों के बाद । CHIR-व्युत्पन्न progenitors में एक CD45+CD56सीडी+सीडी+ जनसंख्या की उपस्थिति इनपुट टेम+ जनसंख्या के भीतर निश्चित CD34 क्षमता का संकेत है. CD34+ और CD43+ IWP2-व्युत्पंन भेदभाव से अलग progenitors इस परख में टी-लिम्फोसाइटों को जंम देना नहीं है, इन विभेद शर्तों के तहत18,26

Figure 1
चित्रा 1: निश्चित और आदिम टेम progenitors के विनिर्देशन के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख । प्रमुख प्रयोगात्मक कदम और EBs से निश्चित और आदिम टेम progenitors से भेदभाव की समयसीमा का चित्रण । EBs दिन पर hPSCs से चटाई-लेपित plasticware पर उत्पंन होते हैं । EBs एक बहु गैस मशीन में BMP4 युक्त SFD मीडिया में बड़े हो रहे हैं । भेदभाव के 1 दिन, संस्कृतियों BMP4 और bFGF के साथ पूरक मीडिया के साथ खिलाया जाता है । 2 दिन, एक मीडिया परिवर्तन CHIR99021 के अलावा (CHIR) के माध्यम से निश्चित टेम progenitors और आदिम IWP2 टेम के लिए progenitors के लिए WNT हेरफेर के साथ होता है । 3 दिन, मीडिया SP34 के लिए बदल गया है, वीईजीएफ़ और bFGF के साथ पूरक । 6 दिन में, संस्कृतियों टेम साइटोकिंस के साथ पूरक मीडिया के साथ खिलाया जाता है । आदिम टेम विनिर्देश के 8 दिवस पर, मीडिया बदल गया है और कोशिकाओं को एक 5% सह2 मशीन के लिए 24 घंटे के लिए ले जाया जाता है, टेम जनक सेल (एचपीसी) परख द्वारा पीछा किया । निश्चित टेम विनिर्देश के 8 दिन पर, CD34+CD43-CD73-CD184- कोशिकाओं FACS द्वारा अलग कर रहे है और निश्चित hemogenic endothelial क्षमता, या टी लसीकावत् क्षमता के लिए परख (चित्रित नहीं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विभेद संस्कृतियों और आदिम टेम progenitors की पीढ़ी का विश्लेषण । () दिन ८ को IWP2-स्वास्थ्यकर्मी EBs से आदिम टेम progenitors के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric िरा. () CHIR99021-स्वास्थ्यकर्मी EBs से प्रतिनिधि प्रवाह cytometric िरा 8 दिवस पर । Hemogenic endothelium (वह) को एक CD34 +CD43-CD73-CD184 जनसंख्या के रूप में पहचाना और पृथक किया जा सकता है. () कॉलोनी बनाने की क्षमता दिन 9 टेम progenitors से IWP2-और CHIR99021-(CHIR) विभेदक संस्कृतियों का इलाज किया । n = 3, त्रुटि पट्टियां मतलब की एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं, तारों सांख्यिकीय महत्व का संकेत है, छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर * * * p & #60; ०.०००१. (D) पृथक वह कक्षों की प्रतिनिधि छायाचित्र 4 दिनों के बाद (बाएं) या 7 + दिन (दाएं) विकास की चटाई-लेपित plasticware पर । मूल आवर्धन, 100X । स्केल पट्टियां = १०० µm. (E) CD34 और CD45 व्यंजक के प्रतिनिधि प्रवाह cytometry निश्चित टेम progenitors से संस्कृति के 9 दिनों के बाद । () प्रतिनिधि तस्वीर EryP-सीएफसी (बाएं), CFU-एम (मध्य), BFU-e और CFU-e (दाएं) की आकृति विज्ञान दिखा । मूल आवर्धन, 40X । स्केल पट्टियां = १०० µm. तीरों का नाम कालोनियों इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: निश्चित टेम क्षमता का विश्लेषण । प्रतिनिधि प्रवाह cytometric िरा की T लिम्फोसाइट क्षमता का CHIR-व्युत्पन्न CD34+CD43CD73CD184 टेम progenitors (A) या IWP2-व्युत्पन्न (B) CD34+CD43 टेम progenitors, OP9-DL4 कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के 28 दिन बाद । १०० CD45+ ईवेंट्स का पता लगाया है, तो एक नमूना से T-लिम्फोसाइट संभावित धनात्मक माना जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

age = "हमेशा" > SFD मिडिया दिन 0 Day 1 दिन 2 निश्चित दिन 2 आदिम BMP4 10 एनजी/ 10 एनजी/ 10 एनजी/ 10 एनजी/ bFGF – 10 एनजी/ 5 एनजी/ 5 एनजी/ Activin एक – – – 1 एनजी/ CHIR99021 – – ३ µ मी – IWP2 – – – ३ µ मी

तालिका 1: SFD-आधारित मीडिया दिनों के लिए 0 - 2.

SP34 मिडिया Day 3 दिन 6 दिन 8 उन्होंने
वीईजीएफ़ 15 एनजी/ 15 एनजी/ 5 एनजी/
bFGF 5 एनजी/ 5 एनजी/ 5 एनजी/
एससीएफ २०० एनजी/ १०० एनजी/ १०० एनजी/
ईपीओ 4 IU 2 IU 2 IU
आईएल-6 20 एनजी/ 10 एनजी/ 10 एनजी/
आईएल-11 10 एनजी/ 5 एनजी/ 5 एनजी/
IGF-1 ५० एनजी/ 25 एनजी एमएल/ 25 एनजी एमएल/
टीपीओ 30 एनजी/ 30 एनजी/
Flt-3L 10 एनजी/ 10 एनजी/
आईएल-3 30 एनजी/ 30 एनजी/
BMP4 10 एनजी/
श्श्श 20 एनजी/
एन्जियोटेन्सिन द्वितीय 10 µ g/mL
लोसरटान पोटेशियम १०० µ m

तालिका 2: SP34-आधारित मीडिया दिनों के लिए 3 - 8 और वह.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक तेजी से, सीरम मुक्त, या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors के भेदभाव के लिए स्ट्रोमा मुक्त विधि । या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors की Mesodermal विनिर्देश मज़बूती से हमारे प्रोटोकॉल है, जो विशिष्ट विहित WNT संकेतन के छोटे अणु अवरोधकों कारनामे का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । GSK3β अवरोध करनेवाला CHIR99021३३ द्वारा स्टेज-विशिष्ट WNT सक्रियकरण निश्चित टेम त्वक को जंम देता है, जबकि WNT अवरोध करनेवाला PORCN द्वारा IWP2 निषेध३४ आदिम टेम त्वक26निर्दिष्ट करता है । नोट की, इस विधि मजबूती से एक engraftable HSC की तरह जनसंख्या को जंम देना नहीं है (नहीं दिखाया गया है) । हालांकि, निश्चित टेम progenitors इस दृष्टिकोण के साथ उत्पंन transgene-प्रेरित engraftment संभावित३५के लिए उत्तरदाई हैं, भविष्य के शोधों अनुप्रयोगों में उनकी क्षमता पर प्रकाश डाला ।

सफल hPSC भेदभाव के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक EBs कि hPSCs से गठन कर रहे है की प्रारंभिक आकार है । आदर्श रूप में, EBs आकार में 6-10 कक्षों के आसपास होना चाहिए । भेदभाव संस्कृतियों aberrantly दोनों कार्यक्रमों का एक मिश्रण निर्दिष्ट कर सकते है यदि EBs बहुत बड़े हैं, संभवतः EB के भीतर अनुचित संकेत सक्रियण के कारण । भेदभाव संस्कृतियों नेत्रहीन पहले के भीतर इष्टतम EB आकार के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए 24 भिंनता के एच । वैकल्पिक रूप से, यदि hPSCs पूरी तरह से एकल कोशिकाओं को असंबद्ध हैं, इसके बजाय hPSCs anoikis कोशिका मृत्यु३६से गुजरती हैं, जिसके परिणामस्वरूप गरीब टेम विभेद होता है ।

एक सफल भेदभाव विशेष रूप से आदिम टेम progenitors को जंम देंगे जब IWP2 mesodermal विनिर्देशन के दौरान 2 दिनों और इस भेदभाव प्रोटोकॉल के 3 पर प्रयोग किया जाता है । विभेद के 8 दिवस पर, IWP2-व्युत्पन्न संस्कृति में विशिष्ट CD34+CD43, CD34मिड/कमCD43+, और CD34CD43+ आबादी (आंकड़ा 2a) शामिल किया जाना चाहिए । CD34मिड/कमCD43+ जनसंख्या आदिम erythroid और माइलॉयड progenitors को जंम देता है; जबकि CD34CD43+ जनसंख्या मुख्यतः सीमित माइलॉयड क्षमता18के साथ erythroid progenitors को जन्म देती है । आदिम टेम क्षमता EryP-सीएफसी (धारा 6) की उपस्थिति के लिए methylcellulose परख द्वारा पुष्टि की जा सकती है, जो भ्रूण ग्लोबिन26की तुलना में भ्रूण HBE HBG व्यक्त predominately होगा, 28,३७. इसी तरह, इस स्तर पर CD43+ टेम progenitors की उपस्थिति मज़बूती से आदिम टेम progenitors18,23,26की उपस्थिति का संकेत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि CD43 अभिव्यक्ति आदिम टेम कार्यक्रम के18,23,26के progenitors के लिए अनंय नहीं है, और आदिम टेम का आकलन करने के लिए एकमात्र मीट्रिक के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता मानव EMP की immunophenotype और पायदान-निर्भरता के रूप में क्षमता, (3में समीक्षा की) चरित्रहीन बनी हुई है.

जब CHIR99021 2 दिनों के दौरान mesodermal patterning के दौरान प्रयोग किया जाता है और भेदभाव के 3, विशेष रूप से निश्चित टेम progenitors की जनसंख्या निर्दिष्ट किया जाएगा । भिंनता प्रोटोकॉल के दिन 8 पर, CHIR99021-व्युत्पन्न संस्कृतियों का एक विशिष्ट CD34+CD43 जनसंख्या का समावेश होना चाहिए, जिसमें कोई CD43 अभिव्यक्ति26से कम न हो । CD34+CD43 जनसंख्या टेम, शिरापरक, और धमनी क्षमता के साथ endothelial कोशिकाओं की विषम जनसंख्या है जो demarcated और CD73 अभिव्यक्ति के आधार पर CD184 की जा सकती है, साथ ही वह दोनों की अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाएं 27,28. जब निश्चित वह एक पायदान पर निर्भर endothelial-टेम संक्रमण (5 धारा) के दौर से गुजर के बाद अलग है28 यह CD34+CD45+ टेम progenitors कि BFU-E और माइलॉयड कोशिकाओं को जंम देंगे उपज होगा methylcellulose, लेकिन नहीं EryP-सीएफसी26,28 (चित्रा 2) । इसके अलावा, BFU-E कालोनियों ग्लोबिन विश्लेषण के लिए अलग-थलग और मूल्यांकन किया जा सकता है, जो भ्रूण ग्लोबिन HBG को भ्रूण HBE की तुलना में व्यक्त करेगा (नहीं दिखाया गया है)26,28, ३७. इसके विपरीत, लसीकावत् क्षमता सीधे पृथक वह से मूल्यांकन किया जा सकता है, के रूप में पायदान पर निर्भर endothelial-टेम संक्रमण OP9-DL4 स्ट्रोमा18,26,28पर होता है । निश्चित वह इस पद्धति के साथ निर्दिष्ट एरतरो-myelo-लसीकावत् progenitors एक क्लोनल स्तर पर28है, जो कार्यात्मक यह EMP या LMPP progenitors3के हमारे वर्तमान समझ से अलग होता है । जैसे, टी की उपस्थिति-लसीकावत् और HBG-व्यक्त erythroid क्षमता, EryP की अनुपस्थिति के साथ युग्मित-सीएफसी क्षमता, मज़बूती से टेम से निश्चित hPSCs विनिर्देश संकेत किया जा सकता है । नोट की, पूरी तरह से progenitors के लिए आकलन है कि जंम दे सकता है के लिए HBG-व्यक्त erythroblasts सही निश्चित क्षमता का निर्धारण नहीं कर सकते हैं, के रूप में, कि ऊपर वर्णित के समान, मानव EMP, और उसके संकेत आवश्यकताओं, नहीं किया गया है के लिए विशेषता-दिनांक (संदर्भ3में समीक्षित) ।

यह सरल भिंनता रणनीति बहुत शक्तिशाली है क्योंकि यह विशेष रूप से आदिम या विशेष रूप से निश्चित टेम progenitors की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, रोग रोगी से दो कार्यक्रमों के तुलनात्मक अध्ययन मॉडलिंग सक्षम-व्युत्पंन iPSCs या जीन संशोधित hPSCs । इसी तरह, मानव विकास प्रक्रियाओं पूछताछ किया जा सकता है, इस तरह की खोज के रूप में क्या अतिरिक्त संकेत मार्ग (ओं) स्व नवीकरण क्षमता प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं, और इसलिए HSC की तरह क्षमता, निश्चित टेम progenitors से ।

सारांश में, hPSCs में mesodermal patterning के दौरान WNT हेरफेर आदिम CD43+ या निश्चित CD34+CD45+ टेम progenitors, जो अलग किया जा सकता है और hPSC-व्युत्पंन hematopoiesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल निर्दिष्ट करता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम आंतरिक चिकित्सा विभाग, रुधिर के प्रभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया है । सीडी राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान से T32HL007088 द्वारा समर्थित किया गया था । सीएमएस एक अमेरिकी रुधिर विद्वान पुरस्कार के समाज का समर्थन किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

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References

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