रीटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के परिभाषित सैकट्स के सिंगल-सेल आरएनए-सैक

Neuroscience

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Summary

यहां, हम अलगाव से पहले न्यूरोनल सेल प्रकारों को वर्गीकृत करने के लिए और एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टम के बाद के लक्षण वर्णन के लिए एक संयोजी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सफल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक) के लिए नमूने तैयार करने का अनुकूलन करता है और सेलुलर विविधता की बढ़ी हुई समझ के लिए विशेष रूप से तैयार की गई एक पद्धति का वर्णन करता है।

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Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (123), e55229, doi:10.3791/55229 (2017).

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Abstract

सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों की खोज सेलुलर फ़ंक्शन और सेलुलर विविधता की उत्पत्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। न्यूरोनल विविधता की बेहतर समझ के लिए हाल ही में एक धक्का के साथ, यह महत्वपूर्ण है कि जिन जीनों की अभिव्यक्ति कोशिकाओं के विभिन्न उप-प्रजातियों को परिभाषित करती है। रेटिना केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र की विविधता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है, क्योंकि यह कई प्रमुख सेल प्रकारों से बना है। कोशिकाओं के प्रत्येक प्रमुख वर्ग के अध्ययन से आनुवंशिक चिह्नक उत्पन्न हुए हैं जो इन आबादी की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं। हालांकि, कोशिकाओं के कई उपप्रकार इन प्रमुख रेटिना सेल कक्षाओं में से प्रत्येक के भीतर मौजूद हैं, और इन उपप्रकारों में से कुछ आनुवंशिक मार्करों को जानते हैं, हालांकि बहुत से लोगों को आकृति विज्ञान या फ़ंक्शन द्वारा वर्णित किया गया है। व्यक्तिगत रेटिना उपप्रकार के लिए आनुवंशिक मार्करों का ज्ञान विशिष्ट दृश्य कार्यों से संबंधित मस्तिष्क लक्ष्यों के अध्ययन और मैपिंग की अनुमति देगा और जीन नेटवर्क में अंतर्दृष्टि भी उधार दे सकता हैसेलुलर विविधता को बनाए रखें उपप्रकार के आनुवंशिक चिह्नकों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान अवसरों में कमियां आती हैं, जैसे कि क्रमशः निम्नलिखित सेल प्रकार का वर्गीकरण। यह डेटा विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है और यह सुनिश्चित करने के लिए कठोर सत्यापन विधि की आवश्यकता होती है कि समूहों में एक ही फ़ंक्शन के कक्ष होते हैं। अलगाव और अनुक्रमण से पहले सेल की आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता की पहचान करने के लिए हम एक तकनीक का प्रस्ताव करते हैं, जो उपप्रकार-विशिष्ट मार्करों की आसान पहचान की अनुमति देगा। यह तकनीक गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों के साथ-साथ मामूली भिन्नता वाले कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी तक भी बढ़ सकती है। यह प्रोटोकॉल उत्कृष्ट-गुणवत्ता वाले आंकड़ों की पैदावार करता है, क्योंकि कई पुस्तकालयों ने एकल कोशिकाओं के लिए 20 मिलियन से अधिक पढ़ने की गहराई प्रदान की है। यह पद्धति एकल-कक्ष आरएनए-सैक द्वारा प्रस्तुत कई बाधाओं पर काबू पाती है और शोधकर्ताओं के लिए सरल और उच्च कुशल तरीके से सेल प्रकार के प्रोफाइल के लिए उपयुक्त हो सकता है।

Introduction

न्यूरोनल विविधता पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में मनाई जाती है, विशेष रूप से कशेरुकात्मक रेटिना में, एक अति विशिष्ट ऊतक जिसमें 1 ग्लिलियल और 6 न्यूरोनल सेल प्रकार होते हैं जो कि रेटिना प्रजनन कोशिकाओं 1 , 2 , 3 की एक आबादी से पैदा होती हैं। कोशिकाओं के कई उपप्रकार कार्यात्मक रूप से वर्गीकृत किया जा सकता है, morphologically, और आनुवंशिक रूप से इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उनके पहचान योग्य कार्यात्मक और / या रूपात्मक विशेषताओं के लिए सेल प्रकार की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को टाई करना है। कोशिकाओं के वर्गीकरण के लिए कई जीनों की पहचान की गई है, लेकिन कई उपप्रकार अप्रभावी हुए हैं, क्योंकि वे समग्र आबादी के एक छोटे से अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विशिष्ट उपप्रकारों के भीतर जीन की पहचान ने रेटिना के भीतर न्यूरोनल विविधता की अधिक समझ के लिए अनुमति दी है और यह भी कहीं और तंत्रिका कोशिकाओं के विविधीकरण पर प्रकाश डालें। फूरथेमोर, एकल सेल अध्ययन, नए सेल प्रकारों के उजागर होने की अनुमति देता है, जो समग्र आबादी 4 , 5 , 6 , 7 के बीच उनके कम प्रतिनिधित्व के कारण अनदेखी की गई हो सकती है।

एकल सेल ट्रांस्क्रिप्टमिक्स के लाभों में से एक यह है कि अद्वितीय मार्कर या मार्करों के संयोजन जो एक विशेष सेलुलर उपप्रकार को परिभाषित करते हैं, उन्हें खोजा जा सकता है। ये तब अलग-अलग जोड़तोड़ के लिए उस सेल प्रकार पर आनुवंशिक पहुंच प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम इस प्रोटोकॉल का प्रयोग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के एक सबसेट के सेल प्रकार-विशिष्ट जीनों को चिह्नित करने के लिए कर रहे हैं जो फोटोपैग्मेंट मेलानस्पिन को व्यक्त करते हैं। मेलानोस्पिन-व्यक्त रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग इन कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है, क्योंकि वे ज्ञात जीन की अभिव्यक्ति के कारण एक साथ क्लस्टर होते हैं। दिलचस्प है, इस सेल पॉपु के पांच ज्ञात उपप्रकार हैंमाउस रेटिना 8 में लेशन इस प्रकार, प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए, हमने कोशिका अलगाव के पहले प्रत्येक उपप्रकार की पहचान करने के लिए ट्रांसजेनिक मॉडल के भीतर स्थूल संरचनाओं को स्थापित किया है। यह तकनीक ऊतक विघटन की आवश्यकता के बिना, कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के साथ-साथ रेटिना से सीधे उनके अलगाव के लिए अनुमति देता है, जो कटे हुए डेंड्राइट 9 के कारण कोशिकाओं और प्रदूषण के भीतर तनाव प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है।

पिछले कुछ सालों में आरएएनए-सैक विधि विकसित करने के लिए नई तकनीकें सामने आई हैं। ये उपकरण 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 के हाथ में प्रश्न के मुकाबले अधिक से अधिक सेल अधिग्रहण और अधिक लागत दक्षता की अनुमति देते हैं। हालांकि, जबकिये तकनीक उत्कृष्ट कदम पत्थर रही हैं, अभी भी कई बाधाएं हैं जो इस प्रोटोकॉल को संबोधित करने में सक्षम हैं। सबसे पहले, मौजूदा प्रक्रियाओं में से कई अलग-अलग ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करते हैं और सेल वर्गीकरण निर्धारित करने के लिए या तो मुख्य घटक विश्लेषण या पदानुक्रमिक क्लस्टरिंग का उपयोग करने का प्रयास करते हैं। उप-प्रकारों को वर्गीकृत करने के लिए इन उपकरणों पर भरोसा करने से विश्वसनीय परिणाम नहीं हो सकते हैं और ये किसी एक आनुवंशिक मार्कर के एक कार्यात्मक सेल प्रकार के संबंध के लिए इस डेटा को मान्य करने के नए तरीके खोजने के लिए बाध्य कर सकते हैं। अन्य प्रोटोकॉल में पृथक्करण की आवश्यकताएं कभी-कभी ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकती हैं और न्यूरोनल प्रक्रियाओं को अलग कर सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एमआरएनए का संभावित नुकसान हो सकता है। इसके अलावा, अलग-अलग कोशिकाओं की तैयारी में, तनाव की प्रतिक्रियाएं इन कोशिकाओं 14 के ट्रांसस्क्रिप्टम को प्रभावित करना शुरू कर सकती हैं। यह प्रोटोकॉल अलगाव से पहले कार्यात्मक सेल प्रकार का निर्धारण करके इन चुनौतियों का सामना करता है, और यह बेहतर एच रखता हैरेटिना ऊतक बरकरार रखकर कोशिकाओं के ईल्थ

एक तकनीक को 2014 में पेश किया गया था और लाइव कोशिकाओं 15 के ट्रांसस्क्रिप्टो के विवो विश्लेषण में शामिल किया गया था। यद्यपि यह तकनीक ऊतक को न्यूनतम यांत्रिक विघटन के साथ ट्रान्सस्क्रिप्टम की परीक्षा देने की अनुमति देती है, लेकिन इसमें विशिष्ट विशिष्ट प्रकार के कोशिकाओं को उनके विशिष्ट प्रतिलेखक माउस का उपयोग किए बिना उनके ट्रांसस्क्रिप्टमों की जांच करने से पहले ऊतक के भीतर वर्गीकृत करने की क्षमता नहीं होती है। हमारे प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट रिपोर्टर की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि हम अपने अलगाव से पहले कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए सेल भरने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करते हैं। इस पिछले प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि इसे फोटोएक्टिवेटबल तत्व को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य की आवश्यकता होती है, जबकि हमारे प्रोटोकॉल एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करने की अनुमति देता है, जो आसानी से उपलब्ध हैं या प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा अलग-अलग चुना जा सकता है। फिर भी, अन्य प्रयोगशालाओं ने विद्युत के दो तरीकों से विवाह किया हैसेलुलर विविधता के अध्ययन के लिए ओफ़िशियोलॉजी और ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल अपने अलगाव के पहले एक सेल के समारोह को चिह्नित करने के लिए अलग-अलग न्यूरॉन्स 16 पर किया गया है और, कुछ मामलों में, इन अध्ययनों के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण 17 के प्रयोग से पहले ही ऐसा किया गया है। वही जटिलताओं का सामना उन तरीकों से होता है, क्योंकि उन्हें ऊतक पृथक्करण या माइक्रोएरे तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो उपलब्ध जांचों के नमूनों के संकरण पर निर्भर करता है। सबसे हालिया अग्रिमों में से एक पैच-सैक का विकास रहा है, एक तकनीक जो पूरे-मस्तिष्क स्लाइस 18 से कोशिकाओं को समझने के लिए पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और आरएनए-सैक तकनीक का उपयोग करती है। यद्यपि इस तकनीक की यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की समानताएं हैं, फिर भी यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमारे दृष्टिकोण से कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए ऊतक को बरकरार रहने की अनुमति मिलती है। यहां, हम अनुकूलन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैंइस गठबंधन का आयन, जो उच्च पढ़ने वाली गहराई और मैपिंग कवरेज प्राप्त करने के लिए आरएनए-सैक के उपयोग के लिए उच्च-गुणवत्ता, एकल-सेल पुस्तकालयों को उत्पन्न करता है।

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Protocol

नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के समाधान की तैयारी (4 घंटे)

  1. 0.1% डीईपीसी युक्त एच 2 ओ बनाओ 1 एमएल डायथाइल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) को रिवर्स ऑसमोस-शुद्ध एच 2 ओ के 99 9 एमएल तक जोड़कर अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेवन करें। फिर, एक तरल चक्र पर 15 मिनट के लिए डीईपीसी-मिश्रित एच 2 ओ के लिए आटोक्लेव करें। आरटी पर डीईपीसी-एच एच ओ हे शांत होने पर चलो
  2. एम्स के माध्यम की एक बोतल और 1. 9 ग्राम (23 मिमी) सोडियम बाइकार्बोनेट को 1 एल एच एच 2 ओ में मिलाकर बाह्य समाधान बनाओ। बुलबुले के साथ बाह्य समाधान
    95% ओ 2 /5% सीओ 2 और 7.3-7.4 के पीएच पर इसे बनाए रखें।
  3. 125 एमएम के-ग्लूकोनेट, 2 मिमी एमजीसीएल 2 , 10 मिमी ईजीटीए, 10 एमएम HEPES, और 0.1% डीईपीसी-एच युक्त संयोजन के द्वारा इंट्रासेल्युलर समाधान उत्पन्न करें2 ओ। इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल अलिक्टूत में संग्रहीत करें प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में 10 माइक्रोन फ्लोरोसेंट ट्रेसर जोड़ें।
  4. कोलेजनज़ और 83 मिलीग्राम के hyaluronidase के 4.15 एमएल कोशिकी समाधान के लिए 10,000 इकाइयों को जोड़कर एंजाइम समाधान करें। एंजाइम समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 μL aliquots में संग्रहीत किया जाना चाहिए

2. रेटिना ऊतक की तैयारी (2 घंटे)

नोट: इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को मंद लाल रोशनी के तहत किया जाना चाहिए

  1. विच्छेदन से कम से कम 1 घंटे पहले जानवरों को अंधेरे-अनुकूल करें। मंद लाल रोशनी के तहत सभी प्रक्रियाएं करें।
  2. सीओ 2 एस्फाइक्सिएशन द्वारा जानवरों को ईथानी बनाना और नेत्रगोलक को पहले ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान के साथ एक पेट्री डिश में डाल दिया।
  3. एक सुई के साथ कॉर्निया को दबाएं और कॉर्निया और स्क्लेरा 19 की सीमा पर नेत्र कैंची के साथ काटने से इसे काट लें।
  4. लेंस का उपयोग करके निकालें# 5 संदंश धीरे-धीरे संदंश के साथ श्वेतपटल में आँसू डालें और ऑप्टिक तंत्रिका को तोड़ें जहां रेटिना और चक्कर आना। रेटिना से श्वेतपटल को हटाकर सावधानी से समाप्त करें
  5. # 5 संदंश का उपयोग करके पारदर्शी कांच निकालें; एक बार हटाए जाने पर, कांचन संदंश के लिए चिपके हुए जलीट पदार्थ के रूप में प्रकट होता है। आधे में रेटिनस (ताकि 4 टुकड़े / जानवर होते हैं) का टुकड़ा करें और उपयोग में आरटी पर ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान में उन्हें स्टोर करें।
  6. रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊतक को माउंट करने के लिए तैयार होने पर, 500 μL ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान में पतला एंजाइम समाधान में सेते रहने के लिए रेटिना का एक टुकड़ा रखें। एक प्रकार के बरतन पर आरटी पर 2 मिनट के लिए एक पेट्री डिश में सेते।
    1. ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान में रेटिना का टुकड़ा धो लें और गिलास नीचे रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊतक को रखें; टिप के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए रेटिना ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए काट दिया।
  7. के लिए उपयोगनीचे की ओर फ़ॉरेस्टेसेप्टर परत के साथ ऊतक को ध्यान से समतल करने के लिए ceps। एक विंदुक का उपयोग कर अतिरिक्त तरल निकालें। नायलॉन जाल के साथ प्लेटिनम की अंगूठी का उपयोग करके ऊतक को लंगर करें।
    नोट: इस पद्धति का इस्तेमाल आरएएन के अलगाव और बाईपॉलर कोशिकाओं से अलग होने के लिए ऊतक को तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है।
  8. ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान के साथ कक्ष को भरें और इसे एक खुर्दबीन मंच पर माउंट करें। 2-4 एमएल / मिनट में ऑक्सीजन युक्त बाह्य समाधान के साथ ऊतक छिड़कना

3. जीएफपी + रीटिनल गंगलायन कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और लक्ष्यीकरण (10 मिनट)

नोट: इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को मंद लाल रोशनी के तहत किया जाना चाहिए

  1. शुरू होने से पहले, माइक्रोप्रिपेट पुलर का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजिकल रिकॉर्डिंग के लिए ग्लास माइक्रोप्रिपेट्स (ओडी: 1.2 मिमी, आईडी: 0.6 9 मिमी) खींचें। इलेक्ट्रोड के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का प्रयोग करें (कृपया ध्यान दें कि पैरामीटर को वांछित प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए औरखींचने वाले और अलग-अलग ग्लास के साथ भिन्न): हीट: रैंप +10; खींचो: 0; वेल: 23; देरी: 1; दबाव: 500; प्रोग्राम लूप: 5 बार सुनिश्चित करें कि युक्तियाँ ~ 1 सुक्ष्ममापी व्यास हैं, छोटे कोशिकाओं को निशाना बनाने के लिए बड़े कोशिकाओं को लक्षित करने और 5-7 एम.ए. के लक्ष्य के लिए 2-4 एमए के प्रतिरोध के साथ।
  2. अवरक्त विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (आईआर-डीआईसी) प्रकाशिकी ( चित्रा 1 ए ) का प्रयोग करते हुए नाड़ीग्रन्थि सेल परत को देखें। एफेफ्लोरेसेंस (~ 480 एनएम) ( चित्रा 1 बी ) का उपयोग कर जीएफपी + रेटिनल गंगलायन कोशिकाओं (आरजीसी) को पहचानें।
  3. डीआईसी में इंट्रासेल्युलर समाधान से भरा विंदुक खोजें। थोड़ा सकारात्मक दबाव लागू करें और एम्पलीफायर पर किसी भी वोल्टेज ऑफसेट शून्य करें।
  4. एक जीएफपी + सेल के खिलाफ ग्लास माइक्रोप्रिटेस दबाएं और पिपेट और सेल झिल्ली के बीच एक जीई सील बनाने के लिए नकारात्मक दबाव लागू करें। सील प्रतिरोध की निगरानी के लिए परीक्षण वोल्टेज कमांड कदम ( जैसे, 5 एमवी) लागू करें। एक स्थिर सील बनाने के बाद, n के संक्षिप्त दालों को लागू करके झिल्ली को टूटनासंपूर्ण सेल पहुंच हासिल करने के लिए एग्जेक्टिव प्रेशर
  5. फ्लोरोसेंट ट्रेसर से भरने के लिए सेल के डेन्ड्राइट के लिए 1-2 मिनट रुको।
    नोट: सेल को morphologically epifluorescence ( चित्रा 1 सी ) में आकारिकी का परीक्षण करके टाइप किया जा सकता है। मेलेनस्पिन-व्यक्त आरजीसी के मामले में, अंदरूनी पेक्सिफ़ॉर्म लेयर में वृक्ष के समान स्तरीकरण को एपिफ्लोरोरेसेंट रोशनी के तहत फ्लोरोसेंट ट्रेसर से भरा डेन्ड्रैइट्स की जांच करके और यह पता लगाया जाता है कि क्या वे नाड़ीग्रन्थि के पास ऑफ एसूब्लामिना (एम 1 आईपीआरजीसी) में सोमा से बहुत दूर हैं। ऑन सब्लामिना (एम 2 और एम 4 आईपीआरजीसी) में सेल परत, या दोनों (एम 3 आईपीआरजीसी)। यह अवलोकन, सोमा आकार के साथ संयुक्त (एम 4 के अन्य सभी आईपीआरजीसी उपप्रकारों की तुलना में बड़े बड़े आकार के होते हैं), सेल प्रकार 20 , 21 , 22 की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। इस प्रकार, यह तकनीक आरएनए आईएसओ से पहले इन विट्रो में सेल प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देता हैआबादी। वृहद वृक्ष के समान आकार या सेलुलर फिजियोलॉजी से जुड़े अन्य सेल प्रकार पहचान प्रोटोकॉल के लिए इस विधि को संशोधित किया जा सकता है।

4. सेल अलगाव (2 मिनट)

  1. शुरुआत से पहले, टेबलटॉप माइक्रोसॉसिटरिफ़्यूज को 2,000 x ग्रा में सेट करें एक सीसी सिरिंज के साथ टयूबिंग (ओडी: 3/32 में, आईडी: 1/32 में) से कनेक्ट करके एक नमूना-निष्पादन उपकरण तैयार करें।
  2. 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों में 10 μL लसीस बफर और 1% β-मेर्कैटोटोथानॉल बर्फ पर रखें। विंदुक युक्तियों को कुल्ला करने के लिए एक 1 सीसी सिरिंज तैयार करें जिसमें डीईपीसी-इलाज एच 2 ओ होता है। नमूना संग्रह के बाद lysis बफर को स्थिर करने के लिए सूखी बर्फ का एक कंटेनर तैयार करें।
  3. 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके नकारात्मक दबाव को लागू करके सेल विंदुक के cytoplasmic सामग्री को ध्यान से निकालना; यदि संभव हो तो ऑर्गेनल्स सहित सभी साइटोप्लाजिकिक सामग्री, निकाले जाने चाहिए
    1. आकार में सेल बॉडी घटते हुए दृश्यमान करके डीआईसी में निष्कर्षण की निगरानी करें। निकालने के बाद साइटोप्लास्मिक सामग्री, ऊतक से पिपेट को सावधानीपूर्वक उठाएं और समाधान से विंदुक को तुरंत हटा दें।
  4. सिर-स्टेज धारक से विंदुक को जल्दी से हटा दें और डीपीसी द्वारा इलाज किए गए एच 2 ओ के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके विंदुक की तरफ संक्षेप में दबाएं। नमूना को निकालने के लिए पिपेट को 1 एमएल सिरिंज से तंग-फिटिंग टयूबिंग से कनेक्ट करें।
  5. 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों में 1 β-मर्कैपोटोथेनॉल युक्त 1 ℃ एलिसैस बफर 1 में कोशिकाओं को तुरंत हटा दें।
    नोट: कोशिकाओं के साथ पूरी महत्वाकांक्षा को धीरे-धीरे निष्कासित कर दिया जाना चाहिए ताकि बुलबुले को पेश नहीं किया जा सके।
    1. संक्षेप में 10 एस के लिए 2,000 xg पर एक टेबलटॉप मिनी सेंटीफ्यूज में ट्यूब को अपकेंद्रित करें सूखा बर्फ पर 5 मिनट के लिए नमूने को तुरन्त फ्लैश करें। ठंड के बाद, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए दो सप्ताह तक स्टोर करें; नमूने लंबे समय तक रह सकते हैं, लेकिन यह अनुशंसा की जाती है कि उन्हें जितनी जल्दी संभव हो उतना संसाधित किया जा सके।
ई "> आरएनए शुद्धि (30 मिनट)

  1. शुरुआत से पहले, एक उल्टे पी 20 या पी 200 टिप धारक के शीर्ष भाग को 96-अच्छी तरह से चुंबकीय स्टैंड 23 पर टैप करके एक चुंबकीय विभाजक डिवाइस सेट करें।
  2. ताजा 70% इथेनॉल (EtOH) तैयार करें - प्रति नमूना लगभग 1 एमएल पर्याप्त होगा। आरएनए चुंबकीय मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस से निकालें और आरटी पर उन्हें कम से कम 30 मिनट में पिघलना।
    नोट: इस समय 8 से अधिक नमूनों को संसाधित किया जाना चाहिए, क्योंकि इस प्रोटोकॉल में कई कदम कार्यक्षमता और त्वरित हैंडलिंग पर निर्भर करते हैं।
  3. एक बार चुंबकीय मोती आरटी पर होते हैं, भंवर 30 एस के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान अच्छी तरह मिश्रित है।
    नोट: मोती आरएनए चुनने के लिए आरएनए-विशिष्ट बफर का उपयोग करते हैं, और वे चुंबकीय प्लेट स्टैंड के साथ कार्यरत अन्य सेलुलर कचरे को हटाने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. 1 मिनट के लिए आरटी पर पिघलना कोशिकाओं, और फिर प्रत्येक नमूने के लिए 5 μL आरएनज मुक्त एच 2 ओ जोड़ें; विंदुक ऊपर और नीचे प्रत्येक ट्यूब और पिपेट को आरएनए मोती के 22 μL जोड़ेंई मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से 5 मिनट के लिए आरटी पर नमूनों को सेते हैं ताकि आरएनए को चुंबकीय मोती से बातचीत और बाँध कर सकें।
  5. एक चुंबकीय विभाजक डिवाइस पर ट्यूब रखें और 8 मिनट के लिए बैठें; आगे बढ़ने से पहले, सुनिश्चित करें कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है मोती को एक गोली से देखें और इसे पिपेटिंग के दौरान अलग न करें।
  6. नमूने से सतह पर तैरनेवाला निकालें और 150 μL 70% EtOH जोड़ें। EtOH को निकालें और दो बार धो लें दो बार।
  7. नमूनों को 6 मिनट के लिए सूखी हवा दें देखें कि क्या अधिक EtOH ने ट्यूब के निचले हिस्से में एकत्र किया है। तदनुसार इसे निकालें
  8. जबकि नमूनों को सुखाने होते हैं, तो 19 μL के लिसेशन बफर 2 और 1 μL आरएनज़ अवरोधक (40 यू / μL) के संयोजन से 10 एक्स प्रतिक्रिया बफर तैयार करते हैं। संक्षेप में इसे नीचे स्पिन और इसे बर्फ पर रखें
  9. नमूनों के सूखे होने के बाद और मनका छर्रों को अब ग्लॉसी दिखाई नहीं देता है, नलिकाओं को चुंबकीय विभाजक से निकालें और 9.5 μL आरएनज़ मुक्त H 2 O जोड़ेंनमूने rehydrate करने के लिए नमूनों को बर्फ पर रखें और प्रत्येक नमूने के लिए 1 μL 10x प्रतिक्रिया बफर जोड़ें।

6. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (10 मिनट)

नोट: शुरुआत से पहले, बर्फ पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी; एंजाइम को छोड़कर) के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को पिघलना इनमें शामिल हैं: प्राइमर द्वितीय, बफर 1, ऑलिगोनक्लियोटाइड, और आरएनएस अवरोधक।

  1. प्रत्येक ट्यूब के लिए, 2 μL प्राइमर II (एएजीसीएजीटीजीजीटीएटीसीएएपीसीसीएजीएसीएजीएसीएजीएटीएक्ट (30) एन -1 एन, ए एन, सी, या जी और एन ए, सी, जी या टी, 12 माइक्रोन हो सकता है) के लिए जोड़ें। ट्यूबों को थर्मोसाइक्लर में रखो जो कि 72 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए किया गया है।
  2. ऊष्मायन के दौरान, आरटी मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 4 μL बफर 1 (250 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.3; 375 एमएम केसीएल; और 30 एमएम एमजीसीएल 2 ), 1 μ एल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (48 माइक्रोग्राम), और 0.5 μL आरएनस अवरोधक (40 यू / μL)।
  3. ऊष्मायन के तुरंत बाद, ट्यूबों को उस पर रखें2 मिनट के लिए बर्फ
  4. रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ (100 यू / μ एल) की प्रति प्रतिक्रिया प्रति 2 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मास्टर मिक्स और विंदुक में लें। प्रत्येक ट्यूब में 7.5 मिलीलीटर मास्टर मिक्स जोड़ें और धीरे से पिपेट करके मिश्रण करें। संक्षेप में नीचे की सामग्री को इकट्ठा करने के लिए ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें और उन्हें पूर्वोत्तर में थर्मोसायक्लर में निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ रखें: 42 डिग्री सेल्सियस 90 मिनट, 70 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  5. आगे बढ़ने से पहले ट्यूब -20 डिग्री CO / एन पर स्टोर करें, हालांकि यह सिफारिश की जाती है कि नमूने लंबे समय तक संग्रहीत करने से पहले प्रवर्धन कदम के माध्यम से किया जाए; अन्य स्रोतों का सुझाव है कि ओ / एन भंडारण 4 डिग्री सेल्सियस भी इस चरण 24 में स्वीकार्य होगा।

7. सीडीएनए प्रवर्धन (2.5 एच)

नोट: शुरू होने से पहले, पीसीआर बफर और पीसीआर प्राइमर को बर्फ पर पिघलना और पीसीआर मास्टर मिश्रण बनाने से पहले टेबोरटॉप मिनी सेंटीफ्यूज में ट्यूबों को स्पिन करें।

  1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, पीPCR बफर के 25 μL, पीसीआर प्राइमर (12 माइक्रोन) के 1 μL, डीएनए पोलीमरेज़ के 1 μL, और 3 μL के एनयूकेले-फ्री एच 2 ओ युक्त पीसीआर मास्टर मिश्रण का समर्थन करें, इससे पहले केवल डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें मास्टर के मिश्रण से नमूने
  2. ट्यूब के नीचे सामग्री को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 30 μL मास्टर मिक्स और 10 एस के लिए 2,000 xg पर स्पिन करें।
  3. निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ एक प्रीहेटेड थर्मासायक्लर में ट्यूबों को रखें: 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 34 चक्र, 30 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, और 3 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 72 मिनट के लिए 10 मिनट; और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पकड़
    नोट: सुझाए गए निर्माता के निर्देशों से भिन्न, इस पीसीआर के चक्रों की संख्या 34 से बढ़ा दी गई है। पुनरावृत्ति परीक्षण के बाद, इस चक्र संख्या को लगातार विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करने के लिए मिला।
  4. आगे बढ़ने से पहले एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को स्टोर करें।

8. प्रवर्धित सीडीएन के शुद्धिए (30 मिनट)

  1. शुद्धिकरण शुरू करने से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी के डीएनए मोती और अलौकिक बफर लाओ। ताजा 80% एटओएच तैयार करें; प्रति नमूना 1 एमएल पर्याप्त होना चाहिए। प्रत्येक नमूने के लिए 1 μL 10X lysis बफर जोड़ें।
  2. 30 एस के लिए डीएनए मोती भंवर करें और प्रत्येक नमूने के लिए डीएनए मोती के 50 μL जोड़ें। Pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर उन्हें संक्षिप्त रूप से 10 एस के लिए 2,000 xg पर स्पिन करें 8 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूबों सेते हैं
  3. 5 मिनट के लिए चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर ट्यूब रखें धीरे से सतह पर तैरनेवाला दो बार ऊपर और नीचे पिपेट और नमूनों को 2 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें। जबकि नमूने चुंबकीय डिवाइस पर हैं, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और त्यागें।
  4. प्रत्येक नमूना में ताजा बनाए गए 80% एटोहा के 150 μL को जोड़ें और उन्हें 30 एसटी के लिए आरटी पर बैठने दें। EtOH निकालें और एक बार EtOH धो लें।
  5. संक्षेप में नमूनों को स्पिन करें और उन्हें 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर वापस रखें। किसी भी शेष EtOH निकालें और 5 मिनट के लिए नमूनों को हवा में सूखने दें।
  6. एक बार मनका गोली अब चमकदार नहीं दिखता है, लेकिन दरारें दिखाई देने से पहले, ट्यूब को चुंबकीय विभाजक से हटा दें और 17 μL अलौकिक बफर जोड़ें। धीरे-धीरे मोतियों को पूरी तरह से रीसेट करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
  7. 2 मिनट के लिए आरटी पर resuspended नमूनों को सेते
  8. संक्षेप में नीचे के सभी तरल एकत्र करने के लिए नमूनों को स्पिन करें और उन्हें 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर रखें। 1.5 मिलीलीटर आरएनसीई-फ्री ट्यूब के 15 μL को स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरित करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  9. सीडीएनए के 1 μL का उपयोग करके उच्च संवेदनशीलता वाले बायोएनिलाइज़र चिप के साथ सीडीएनए पुस्तकालय की गुणवत्ता और आकार की जांच करें। सीडीएनए पुस्तकालय का आदर्श आकार 0.3-2 केबी है, कम से कम 10 एनजी / μ एल ( चित्रा 2 ) की एकाग्रता के साथ।
    नोट: नमूना प्रॉप के साथ आगे बढ़ने से पहले ज्ञात मार्करों की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए आप पीसीआर को नमूने स्क्रीन करने के एक तरीके के रूप में काम करना चुन सकते हैं।eparation।

9. सांद्रता और टैगमेंट सीडीएनए निर्धारित करें (20 मिनट)

  1. शुरुआत से पहले, 30 मिनट के लिए आरटी के परख अभिकर्मक, कमजोर पड़ने वाले बफर और मानकों को ले आओ। प्रति घंटा अभिकर्मक के 1 μL युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रतिक्रिया के प्रति कमजोर पड़ने वाले बफर के 199 μL तैयार करें। इस मिश्रण के 199 μL को 500 μL परख ट्यूबों में विभाजित करना। 1 μL नमूना जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करें।
  2. विभाज्य 1 9 1 के लिए गुरु मिश्रण की 1 μL ट्यूब और ट्यूब 1 के लिए मानक 1 के 10 μL और मानक 2 के 10 μL जोड़ें 2. भंवर 5 नमूने के लिए सभी नमूना ट्यूब और मानक ट्यूब; 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं
  3. एक उच्च संवेदनशीलता फ्लोरामीटर के साथ नमूने की एकाग्रता का निर्धारण करें। सुनिश्चित करें कि सही नमूना राशि "स्टॉक समाधान की गणना करें" विकल्प को चुनकर और "1 μL" को उजागर करके इनपुट किया गया है। प्रत्येक नमूना को एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में 0.2 एनजी / μ एल के अंतिम एकाग्रता में आरएनसी मुक्त एच 2 ओ में डालना।
    ध्यान दें:जबकि निर्माता के निर्देश बताते हैं कि 1 एनजी / μL कुल डीएनए से शुरू होना चाहिए, हमने एक छोटे से प्रारंभिक राशि का इस्तेमाल किया है और इस संशोधन के लिए खाते में प्रोटोकॉल को भी समायोजित किया है।
  4. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब्स में, बफर के 2.5 μL की पिपेट। कुल 250 पीजी के लिए उपयुक्त ट्यूब में 1.25 μL सीडीएनए को जोड़ें। अंत में, मिश्रण के लिए प्रत्येक ट्यूब और पिपेट को टैगमेंटेशन मिश्रण का 1.25 μL जोड़ें; टैगमेंटेशन मिश्रण के भीतर transposase छोटे किस्में डीएनए टुकड़ा और एडेप्टर प्रत्येक कतरा के अंत करने के लिए, sequencing साधन द्वारा बाद में उपयोग के लिए अंतराल होगा।
    नोट: टैगमेंटेशन और इंडेक्स युग्लेशन के लिए इस्तेमाल होने वाले वॉल्यूम निर्माता के निर्देशों द्वारा सुझाई गई राशि का अंश है। यह न केवल अभिकर्मकों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है, बल्कि यह हमारे अनुभव में लगातार नमूने वाले नमूने बनाए हैं।
  5. 1 मिनट के लिए एक काउंटरटॉप माइक्रोसेंट्रिफ्यूज पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें
  6. ट्यूब रखेंएक प्रीहेटेड थर्मासायक्लर में निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ: 55 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: निर्माता के निर्देशों से प्रस्तावित 5 मिनट के विरोध में, इस ऊष्मायन की लंबाई 10 मिनट है।
  7. इस कार्यक्रम के पूरा होने के तुरंत बाद, ट्यूबों को हटा दें और प्रत्येक के लिए बफर को निष्क्रिय करने के लिए 1.25 μL टैगमेंटेशन को जोड़ दें। 5 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण और सेते हुए अच्छी तरह पिपेट इस कदम को तत्काल पूरा करें, क्योंकि ट्रांसपोझ सक्रिय रहता है जब तक कि बफर ने एंजाइम को निष्क्रिय नहीं किया और प्रतिक्रिया रोक दी है।

10. सूचकांक युग्मन और शुद्धि (1 घंटे)

नोट: शुरुआत से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी के डीएनए मोती और रिसासपेंशन बफर लाओ। तय करें कि प्रत्येक नमूने के लिए किस इंडेक्स का उपयोग करना है

नोट: इन सूचकांक अनुक्रमित निम्नलिखित नमूनों की पहचान के लिए विखंडित डीएनए के संबंधित 5 'और 3' के अंत तक संलग्न किए जाएंगे। सुनिश्चित करें कि कोई दो नहींजोड़ी एक साथ अनुक्रमित किया जा सकता है कि नमूनों के लिए एक ही हैं। उदाहरण के लिए, यदि नमूना 1 सूचकांक सफेद 1 और नारंगी 1 का उपयोग करेगा, नमूना दो को सफ़ेद 1 और नारंगी 2 या सफेद 2 और नारंगी 2 का उपयोग करना चाहिए, लेकिन इंडेक्स के समान संयोजन कभी नहीं। इस किट में 4 भिन्न सफेद और 6 भिन्न नारंगी इंडेक्स हैं। विभिन्न संभावित संयोजनों में से सभी एक नमूने लेन में जमा किए जाने वाले 24 नमूनों की अनुमति देते हैं। हालांकि हम आम तौर पर केवल लेन में 10 नमूनों को पूल करते हैं, एक किट का उपयोग 24 इंडेक्सों में भी हो सकता है, जो क्रमशः एक सिंगल लेन में 96 नमूनों को जमा करने की इजाजत देता है, अगर वांछित।

  1. प्रत्येक ट्यूब के लिए, उस विशिष्ट नमूने के लिए 1.25 μL बाएं सूचकांक और सही सूचकांक के 1.25 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 3.75 μL पीसीआर मास्टर मिक्स और पिपेट को अच्छी तरह से जोड़ें।
  2. 1 मिनट के लिए एक काउंटरटॉप माइक्रोसॉसिटरिफ़ में अपकेंद्रित्र
  3. निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ एक प्रीहेटेड थर्मासायक्लर में ट्यूब रखें: 72 मिनट के लिए 3 मिनट; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 95 के 12 चक्र76; सी के लिए 10 एस, 50 डिग्री सेल्सियस 30 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पकड़
    नोट: पहले 95 डिग्री सेल्सियस कदम 98 डिग्री सेल्सियस से बदल दिया गया था, जिसे निर्माता के निर्देशों से सुझाया गया था। साथ ही, चक्र के विवरण को समायोजित किया गया ताकि तापमान और समय की लंबाई हमारे नमूनों के अनुकूलतम टैगमेंटेशन के लिए अनुमत हो। अंतिम 72 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन हमारे प्रोटोकॉल में भी जोड़ा गया था और निर्माता के निर्देशों में शामिल नहीं किया गया था।
  4. संक्षेप में नीचे की सामग्री को इकट्ठा करने के लिए ट्यूबों को स्पिन करें। भंवर 30 एस के लिए डीएनए मोती, और फिर प्रत्येक ट्यूब 30 μL जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
  5. 5 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं
  6. 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर नमूने रखें सतह पर तैरनेवाला पिपेट ऊपर और नीचे दो बार और 1 मिनट के लिए नमूने सेते हैं
  7. निकालें और स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला त्यागें। प्रत्येक नमूना में 150 μL 80% एटॉएच जोड़ें और निकालें। एक बार फिर EtOH धो लें।
  8. वें अनुमति देंई नमूनों में 10 मिनट के लिए सूखी हवा यह देखने के लिए कि क्या किसी एटोह ने ट्यूबों के तल पर एकत्र किया है और आवश्यकतानुसार निकालें, अंतर से जांच करें।
  9. एक बार डीएनए मनका गोली में एक दरार दिखाई देने लगते हैं, तो नमूना को चुंबकीय विभाजक से हटा दें और गोली को पुनः संयोजित करने के लिए 27.5 μL resuspension बफर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से रिसासपेंडेंट है, और फिर 2 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    नोट: resuspension बफ़र के लिए इस्तेमाल किया मात्रा हमारे प्रोटोकॉल में शुरू सामग्री की छोटी राशि के लिए खाते में संशोधित किया गया था और निर्माता के निर्देशों में सुझाव मात्रा से अलग है।
  10. 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर ट्यूब रखें आरएनसी मुक्त ट्यूब में 25 लीटर स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण करें।
    नोट: लाइब्रेरी सामान्यकरण को पूरा करने के लिए निर्माता के निर्देशों के साथ आगे बढ़ना न करें। नमूनों को सफलतापूर्वक इस चरण के बाद तैयार किया गया है और यह क्रम के लिए तैयार है जैसा कि है।
  11. टी का विश्लेषण करेंएक बायोएनिलाइज़र चिप का उपयोग करने वाले नमूनों का एकीकरण और प्रत्येक नमूने के 1 μL।
    नोट: स्मीयरों का विश्लेषण पहले के रूप में किया जाएगा; हालांकि, अब सीडीएनए को 0.2-1 Kb ( चित्रा 3 ) की एक आकार सीमा पर पता होना चाहिए। इस बिंदु के नीचे स्मीयर संभवतः नमूनों की गिरावट का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि बड़े स्मीयर अधूरे टैगमेंटेशन का सुझाव देते हैं।

11. नमूनों का पुलिंग (10 मिनट)

  1. उच्च संवेदनशीलता फ्लोरोमीटर के साथ टैगमेंटेशन नमूनों की सांद्रता पहले से प्राप्त करें और एनएम में एकाग्रता का पता लगाएं।
    नोट: यह गणना एक इंटरनेट रूपांतरण उपकरण के उपयोग के साथ गणना की जा सकती है और बायोएनिलाइज़र ट्रेस से औसत टुकड़े की लंबाई पर निर्भर करती है। औसत टुकड़ा लंबाई निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए अलग-अलग निशान का निरीक्षण करें और औसत डीएनए टुकड़ा के आकार का निर्धारण करें। यह भी गणना की जा सकती है जब धब्बा की सीमा को उजागर करके और जांच की जा रही है, तो बायोएनिलाज़र ट्रेस की जांच कर रहा हैकार्यक्रम द्वारा गणना की गई ई मल्लिरिटी
  2. नमूनों को मिलाएं जैसे कि पूल में प्रत्येक नमूने का एक ही एकाग्रता होता है। नमूने पतला न करें; पूल केवल सबसे कम-सांद्रित नमूने के रूप में पतला होना चाहिए और आदर्श रूप से कम से कम 15 एनएम की कुल एकाग्रता होनी चाहिए।
  3. अनुक्रमण से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा किए गए नमूनों को स्टोर करें; यह सुझाव दिया जाता है कि नमूने पूलिंग के 1 सप्ताह के भीतर अनुक्रमण कर लेते हैं। हायसेक मंच के साथ युग्मित-अंत, 100 बीपी अनुक्रमण करना

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Representative Results

डाई इंजेक्शन के बाद सेल प्रकार को आसानी से वर्गीकृत किया जाता है

चित्रा 1 फ्लोरोसेंट ट्रेसर भरने से पहले और बाद में जीएफपी + आरजीसी का एक उदाहरण दिखाता है। ट्रांसजेनिक लाइन ( चित्रा 1 ए ) में जीएफपी की अभिव्यक्ति के आधार पर इस सेल की पहचान की गई थी। इस सेल के सोमा पर एक तंग सील का निर्माण ठीक-टिप, खींचा गया ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ किया गया था। उपप्रकार को चिह्नित करने के लिए, फ्लोरोसेंट डाई सोमा में इंजेक्ट किया गया था और सभी संबद्ध प्रक्रियाओं ( चित्रा 1 बी ) भरने की अनुमति दी गई थी। एम 4 आईपीआरजीसी के रूप में वर्गीकरण को इस अवलोकन के माध्यम से सक्षम किया गया था कि यह कोशिका बहुत बड़ी सोमा है और इसकी प्रक्रियाएं अंदरूनी पेक्सिफ़ॉर्म लेयर ( चित्रा -1 सी ) के ओब्लामिना के भीतर समाप्त हो जाती हैं। स्तरीकरण में अंतर के एक उदाहरण के रूप में, जिसे पृथक रेटिना की तैयारी में देखा जा सकता है, हमने एम 1 (OFF-stratifyinजी), एम 3 (बिस्ट्रेटिफाइड), और एम 4 (ओएन-स्ट्रेटिफाइंग) आईपीआरजीसी एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर के साथ, उन्हें तय किया, और ऑन और ऑफ एसब्लामिना ( चित्रा 1 डी ) के confocal इमेजिंग का प्रदर्शन किया। कॉन्फोकल इमेजिंग के माध्यम से डेंड्राइट्स का यह दृश्य बहुत ही समान होता है कि कैसे डेंड्राइट इन विट्रो ऊतकों में अस्थिर होता है जब कोशिका फ्लोरोसेंट ट्रेसर (श्मिट और कोफुजी 2009, 2010, 2011) से भर जाती हैं।

एकल कोशिकाओं से सीडीएनए पुस्तकालय

ओलिगो डी (टी) प्राइमर के उपयोग से एमआरएनए का चयन रिवर्स प्रतिलेखन और प्रवर्धन की अनुमति मिलती है। प्रत्येक सेल से सीडीएनए पुस्तकालयों को सृजन और प्रवर्तन करने के बाद, पुस्तकालयों की गुणवत्ता और आकार का आकलन करने के लिए बायोएनिलाइज़र चिप्स का उपयोग किया गया। इस विश्लेषण के परिणाम बताते हैं कि आदर्श सीडीएनए स्मरियां एक अच्छे नमूने ( चित्रा 2 ए ) में 0.5-2 केबी हैं। कुछ नमूने कुछ बैंड या 300 बीपी मार्क के नीचे स्मीयर दिखाते हैं, सूगGesting है कि ये लाइब्रेरी खराब गुणवत्ता के हैं (समस्या निवारण के लिए तालिका 1 देखें)। एक अच्छी गुणवत्ता वाले जैवइलाइज़र ट्रेस का उदाहरण 300bp से कम या कोई डीएनए बैंड नहीं दिखाता है और 500bp और 2kb (चित्रा 2 बी) के बीच एक मजबूत धब्बा है। रिक्त नियंत्रण लेन क्रमशः 35 और 10380 बीपी पर कम और ऊपरी मार्कर प्रदर्शित करती है, साथ ही एक स्थिर आधार रेखा जो अस्थिर नहीं होती है विभिन्न पुस्तकालय गुणवत्ता आंकड़ों का उत्पादन कर सकते हैं, जैसा कि चित्रा 2 बी और 2 सी दोनों के द्वारा देखा जा सकता है, जो उत्कृष्ट पढ़ने की गहराई और उच्च मैपिंग दरों का उत्पादन करती है। अपेक्षित आकार के मजबूत सीडीएनए पुस्तकालयों के साथ ही उन नमूने को टैगमेंटेशन (समस्या निवारण के लिए तालिका 1 देखें) के माध्यम से किया जाना चाहिए।

कम-इनपुट टैगमेंटेशन अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले नमूने तैयार करता है

इस प्रोटोकॉल को शुरू करने वाली माटीरिया की एक छोटी राशि के साथ टैगमेंटेशन के लिए अनुकूलित किया गया है एल। सिर्फ 250 पीजी एक सफल टैगमेंटेशन के लिए सबसे अच्छा काम करता है, क्योंकि कम मात्रा ठीक से बढ़ेगी और अधिक मात्रा में पूरी तरह से टुकड़ा नहीं होगा। टैगमेंटेशन और पीसीआर प्रवर्धन / नमूना साफ-सफाई को पूरा करने के बाद, एक जैवइलाइज़र चिप पर फिर नमूने का विश्लेषण किया गया। इस बिंदु पर आदर्श सीडीएनए स्मीयर 0.2-1 केबी ( चित्रा 3 ए ) होना चाहिए। यह निशान चिकनी और समान रूप से उन दो आकारों ( चित्रा 3 बी ) के बीच वितरित होना चाहिए; यह ट्रेस लेन 1 में नमूने से मेल खाती है। चित्रा 3C एक अपूर्ण टैगमेंटेशन दिखाता है, जिसे आसानी से सुलझाया जा सकता है (समस्या निवारण के लिए तालिका 1 देखें)। हमने नमूने पर डेटा विश्लेषण किया है और पाया है कि इस प्रोटोकॉल ने उत्कृष्ट पढ़ा गहराई वाले नमूनों का उत्पादन किया है, अक्सर प्रति नमूना 12 मिलियन पढ़ता है; 69.1% मैपिंग के औसत; और 5000 से अधिक व्यक्त जीन

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चित्रा 1: मेलानोस्पिन में व्यक्त जीपीपी अभिव्यक्ति के आधार पर आरजीसी प्रकार की पहचान आईपीआरजीसी और आकृति संबंधी गुणों पर। ( ) रेटिना के नाड़ीग्रन्थि-सेल परत, पूरे-माउंट रेटिना तैयारी में आईआर-डीआईसी का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किया गया। ( बी ) जीएफपी-व्यक्त नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक समान तैयारी epifluorescence (~ 480 एनएम) में देखी गई। ( सी ) पैड क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित एक जीएफपी-व्यक्त सेल और एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर से भरा। सेल को एम 4 आईपीआरजीसी के रूप में पहचाना जा सकता है जिसका आकार बहुत बड़ा सोमा आकार और डेरेड्रेट्स 25 , 26 पर केंद्रित है। ( डी ) आईपीएल (एम 4) के ओन सब्लामिना में और आईपीएल (एम 3) के दोनों ओएनएफ ऑफ़ सब्लामिना में, आईपीएल (एम 1) की ओएनएस / ओफ़ ऑफ सब्लामिना में आईपीआरजीसी डेंड्रिट की छवि को कन्फोकल छवि के रूप में दिखाया गया है। आईआर-डीआईसी: इन्फ्रारेड अंतर हस्तक्षेप विपरीत.jove.com / files / ftp_upload / 55229 / 55229fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सीडीएनए लाइब्रेरी क्वालिटी का बायोएनाइलाइज़र ट्रेस के साथ विश्लेषण। ( ए) कई नमूने के लिए बायोएनिलाइज़र आउटपुट का उदाहरण जो रिवर्स, लिपिक, प्रवर्धित और शुद्ध किए गए हैं। 1-3 लैन के आदर्श डीएनए स्मीयर दिखाते हैं, जिसमें अधिकांश डीएनए 300 बीपी से अधिक है। इस श्रेणी में स्मीयर के साथ पुस्तकालय ने लगातार उत्कृष्ट अनुक्रमण डेटा प्रदान किया है, जो प्रति सेल में 5,683 जीनों की औसत दर्शाता है। लेन 4 एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है जो कि असफल तरीके से संसाधित हो गया था और इस तरह सीडीएनए का उत्पादन नहीं किया गया था। सफल नियंत्रण लेन में निरंतर आधार रेखा और 35 और 10,380 बीपी पर दो साफ चोटियां हैं। ( बी ) लगभग 2 केबी के सीडीएनए की एक उच्च तीव्रता के साथ एक सफल बायोएनिलाजर ट्रेस का उदाहरण यह एस गियर 1 लेन में नमूने से मेल खाती है। ( सी ) सीडीएनए के साथ सफल बायोएनिलाइज़र ट्रेस का उदाहरण 500 बीपी के आसपास केंद्रित है। यह ट्रेस लेन 3 में नमूने से मेल खाती है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: टैग किए गए नमूनों को मजबूत स्मीयर 0.2 और 2 केबी के बीच दिखाएं ( ) एक प्रतिनिधि उदाहरण bioanalyzer आउटपुट निम्नलिखित टैगमेंटेशन, प्रवर्धन, और पीसीआर सफाई। ( बी ) लेन में 1 ए (ए) के अनुरूप एक सफलतापूर्वक टैग किए गए नमूने का ट्रेस ( सी ) 1 केबी के आसपास चोटी की तीव्रता से स्पष्ट, अपूर्ण टैगमेंटेशन के साथ एक नमूने के लिए ट्रेस का उदाहरण"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2 "> 0.4 एनजी / μL की एकाग्रता के नमूने को पतला करें और फिर से दोबारा टैगमेंटेशन करें
मुसीबत संभावित कारण उपाय
चरण 3.3) GΩ सील का निर्माण नहीं किया जा सकता सेल की सतह पर्याप्त नहीं है आगे सकारात्मक दबाव का उपयोग कर साफ करें
चरण 3.3) सेल डिफ्लेट / मरने के लिए प्रतीत होता है नई पिपेट तैयार करें और एक नए सेल को लक्षित करें
चरण 3.4) डेंड्राइट का टर्मिनल स्थान निर्धारित नहीं किया जा सकता है एलेक्सफ्लौर को सेल में फैलाना या एलेक्सफ्लौर की एकाग्रता के लिए पर्याप्त समय नहीं था, पर्याप्त नहीं है सुनिश्चित करें कि कैमरा पर लाभ और एक्सपोजर का समय काफी अधिक है। डेंड्राइट देखने के पहले एक अतिरिक्त 5 मिनट की प्रतीक्षा करें। यदि डेन्ड्रैक्ट्स अभी भी दिखाई नहीं दे रहे हैं, तो एलेक्सफ्लौर के साथ उच्च समाधान तैयार करेंएकाग्रता।
चरण 4.1) सभी साइटोप्लाज्म की इच्छाशक्ति करने में असमर्थ
चरण 5.5) 8 मिनट के बाद सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट नहीं है धीरे-धीरे पूरे समाधान को दो बार दोहराएं, जबकि अभी भी चुंबकीय विभाजक पर, और एक और 5 मिनट के लिए बैठें
चरण 5.5) पिपेटिंग के दौरान गोली फैलती है नमूना चुंबक से बहुत दूर है सभी pipetting के दौरान चुंबकीय अलग डिवाइस पर ट्यूब रखें। समाधान निकालना और मोती 5 मिनट के लिए पुन: गोली के लिए अनुमति दें
चरण 5.7) 5 मिनट के बाद, नमूने अभी भी चमकदार दिखाई देते हैं एटोओएच की अधिकतम राशि हटाई नहीं गई है सुखाने के दौरान नमूनों की निगरानी करना जारी रखें। हर 2 मिनट, एक पी 10 विंदुक का उपयोग करें और ट्यूब के नीचे सभी EtOH को हटा दें
चरण 8.9) रीलेट करने से पहले प्लेटलेट में दरारें आईं नमूना को पुन: दर्ज करने की अनुमति देंकुल 4 मिनट के लिए दर, 2 की बजाय (चरण 8.10)
चरण 8.11) सतह पर तैरनेवाला के साथ मोती की छोटी मात्रा लाई गई थी पूरे नमूना वापस ट्यूब में और 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर जगह निकालें; पाइप को धीरे से ऊपर रखें और गोली से बचने के लिए सुनिश्चित करें
चरण 8.12) डीएनए स्मरियां असंगत हैं और प्रतिदीप्ति पैमाने लगातार बदलते हैं एचएस चिप के लिए बहुत अधिक डीएनए एकाग्रता नमूना की एकाग्रता की जांच करें और 1 - 10 एनजी / μL के बीच कमजोर पड़ें पुनरोन बायोएनलिज़र
चरण 8.12) कम आणविक भार स्मीयर आरएनए डिग्रेडेशन संग्रह के तुरंत बाद फ्रीज सेल को फ्लैश करना सुनिश्चित करें इस सीडीएनए पुस्तकालय को त्यागें
चरण 8.12) नियंत्रण लेन में मार्कर बेसलाइन में उतार चढ़ाव संदूषण या पुराने अभिकर्मक डीएनए मार्कर को त्यागें और बायोएनलिज़र रन के लिए नई ट्यूब का इस्तेमाल करें
चरण 8.12) कोई डीएनए धब्बा नहीं सेल निष्कासित करने में विफलता एक छोटे से बड़े टिप के साथ नई सुई खींचें
आरएए मनका विफलता सुनिश्चित करें कि मोती का उपयोग करने से पहले पूरी तरह पुन: पेश किया गया है और चुंबकीय विभाजक पर रखने से पहले नमूनों को सेते हैं
चरण 8.12) कमजोर डीएनए धब्बा पर्याप्त प्रवर्धन नहीं अधिक पीसीआर चक्रों को रोजगार दें
चरण 8.12) 500bp-2Kb रेंज से बाहर डीएनए धब्बा डीएनए 0.5 से नीचे और 2 केबी से ऊपर की तरंगें संभावित संदूषण हैं। नमूना छोड़ें
चरण 8.12) डीएनए ट्रेस पर नियमित रूप से स्थान पर spikes नमूना का संदूषण हमेशा ताजा दस्ताने पहनें और रिक्सेस के लिए नया इथेनॉल बनाओ; फ़िल्टर युक्तियाँ हर समय उपयोग की जानी चाहिए
चरण 9.3) फ्लोरामीटर पर नमूना की एकाग्रता का पता लगाने में असमर्थ पता लगाने के स्तर के नीचे नमूने टैगमेंटेशन के लिए बहुत कम डीएनए हैं और इसका इस्तेमाल नहीं किया जा सकता
चरण 10.10) नमूने 10 मिनट के बाद सूखी नहीं हैं अतिरिक्त एटीओएच को हटाने के लिए जारी रखें नमूनों को लंबे समय तक एयरड्री करने की अनुमति दें, हर मिनट उन पर जांच करें
10.13 कदम) 2Kb की तरफ झुकना अपूर्ण विखंडन 0.2 एनजी / μL की बजाय 0.15 एनजी / μ एल की एकाग्रता के लिए नमूना फिर से पतला; फिर से दोबारा टैगमेंटेशन
चरण 10.13) 200 बीपी की तरफ झुकना बहुत कम डीएनए इनपुट कम नमूना पतला, 0.4 एनजी / μL की एकाग्रता का प्रयास करें; फिर से दोबारा टैगमेंटेशन
टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया बहुत लंबा है 8 मिनट तक टैगमेंटेशन के प्रतिक्रिया समय कम करें
चरण 10.13) कमजोर स्मीयर डीएनए का अनुचित प्रवर्धन
चरण 11.2) अधिकतम प्राप्य पूल एकाग्रता 5 एनएम नीचे है पहचानें कि कौन सी नमूना (ओं) में काफी कम सांद्रता है और नए कमजोर पड़ने के साथ टैगिंग पुनर्रचना

तालिका 1: प्रोटोकॉल में संभावित हिंदुओं के समाधान और सुझाव। यह तालिका इस प्रोटोकॉल के दौरान हो सकती है जो संभावित कठिनाइयों को सूचीबद्ध करती है और जिन चरणों में कोई उन्हें सामना कर सकता है यह तालिका इन समस्याओं में से कई के लिए संभावित कारणों को सूचीबद्ध करती है, साथ ही समाधान जो किसी भी समस्या को हल करने में मदद कर सकते हैं।

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Discussion

हमारे प्रोटोकॉल एक त्वरित और आसान उपयोग मार्गदर्शिका के माध्यम से दर्शाता है, नमूना की छोटी चोट के साथ, उच्च गुणवत्ता वाली अनुक्रमण के लिए पहचाने गए आकृति विज्ञान कक्षाओं के एकल कक्षों को तैयार करने की एक विधि। वर्तमान पांडुलिपि में, आंतरिक रूप से संवेदी रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को morphologically विशेषता, पृथक और आरएनए-सैक के लिए तैयार किया जाता है। रेटिनल हैंडलिंग के दौरान सेलुलर तनाव हो सकता है; इस कारण से, हम उपयोग के 4 घंटे से अधिक नहीं के बाद ऊतक के प्रत्येक टुकड़े को प्रतिस्थापित करते हैं। हम इन कोशिकाओं से रिकॉर्ड करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग का उपयोग करके कोशिकाओं की स्थिति का आकलन कर सकते हैं और उनकी प्रतिक्रियाओं की निगरानी कर सकते हैं, जिससे हमें यह सुनिश्चित करने की अनुमति मिलती है कि कोशिकाएं अच्छे स्वास्थ्य के हैं। हमारे प्रोटोकॉल द्वारा सफल सीडीएनए पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए संसाधित 23 नमूनों में से 15 नमूनों की अनुमति दी गई, जिससे 65% की सफलता दर प्राप्त हुई। इसके अलावा, हमारे अनुक्रमण आंकड़ों की गुणवत्ता उत्कृष्ट थी, क्योंकि हमारे कोशिकाओं द्वारा व्यक्त जीन की औसत संख्या 2,316-10,353 से लेकर 5,683 के औसत के साथ थीगैर-शून्य FPKM मान के साथ जीन दर्ज करना। ये संख्याएं न्यूरॉन्स 5 के अन्य अध्ययनों से मिली व्यक्त जीन की संख्या के समान हैं, जो दर्शाती है कि हमारा डेटा अच्छी गुणवत्ता का भी है।

हालांकि इन विशिष्ट न्यूरॉन्स के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ हमें सफलता मिली है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तकनीक में मामूली संशोधन कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है। एक अलग माउस मॉडल के भीतर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर (एफएसीएस) का उपयोग करते हुए हमने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से जीएफपी मार्कर के साथ लेबल की गई छोटी कोशिकाओं (1,000 -25,000) को अलग कर लिया है। इन आबादी से आरएनए अलग था, और इस आरएनए के 1 μL (या उससे कम 12 एनजी / μL नीचे) चरण 6.1 पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस चरण के बाद प्रोटोकॉल में केवल एक ही समायोजन चरण 7.4 पर होता है, जिस पर कोई भी कम पीसीआर चक्र को नियोजित करने का विकल्प चुन सकता है। हमने शुरुआती नमूने में जी के मामले में 1 9 चक्रों का प्रयोग किया है10,000 कोशिकाओं की तुलना में थियेटर और पाया कि यह अच्छी-गुणवत्ता वाले सीडीएनए पुस्तकालयों का उत्पादन करता है। उदाहरण के लिए, सेल के नमूनों को एक एफएसीएसएटेड आबादी से तैयार किया गया था, और 12,340-14,052 से लेकर जीन की संख्या, एक गैर-शून्य एफपीकेएम मूल्य वाले 13,265 जीनों की औसत के साथ। यह तकनीक विभिन्न माउस मॉडल पर लागू किया जा सकता है जिसके लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मौजूद है। इस संशोधन के कारण, शोधकर्ताओं ने संभावित रूप से किसी भी सेल आबादी का अध्ययन कर सकते हैं, जिसके लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस उपलब्ध है, न्यूरोनल विविधता के क्षेत्र के अतीत से अध्ययन बढ़ाता है।

एक दूसरे समायोजन को सिर्फ आकृति विज्ञान के बजाय कार्यक्षमता पर आधारित कोशिकाओं के लिए बनाया जा सकता है। यह परियोजना ट्रांसजेनिक मॉडल पर निर्भर करती है, लेकिन यह तकनीक न्यूरॉन्स के लिए लागू की जा सकती है, जिसमें कोई ज्ञात आणविक पहचानकर्ता नहीं है। उदाहरण के लिए, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के 30 से अधिक कार्यात्मक उपप्रकार हैं जो वर्तमान में 27 की पहचान कर चुके हैं, जिनमें से बहुत कुछ अद्वितीय मार्कर हैं। इस तकनीक के रूप मेंपहले से ही कोशिका भरने के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर निर्भर करता है, एक व्यक्ति अपने स्पाइकिंग पैटर्न के आधार पर प्रत्येक कोशिका के कार्यात्मक प्रतिक्रिया प्रोफाइल की पहचान करने के लिए पैच को क्लैंपिंग कर सकता है। प्रकाश-विकसित स्पाइक रिकॉर्डिंग का उपयोग करते हुए, रेटिना न्यूरॉन्स का वर्गीकरण सेल अलगाव से पहले निर्धारित किया जा सकता है। यह तकनीक रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं पर काम करती है, लेकिन इसे अन्य रेटिना न्यूरॉन्स की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यदि इस प्रोटोकॉल को आंतरिक परमाणु परत में रेटिनल द्विध्रुवी या अमाइनलाइन कोशिका टाइप करने के लिए प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, किसी को कोशिकाओं से संपर्क करने से बचने के लिए इलेक्ट्रोड की नोक पर लगातार सकारात्मक दबाव प्रदान करने के लिए सावधान रहना चाहिए इलेक्ट्रोड नाड़ीग्रन्थि सेल परत और अंदरूनी कशेरुका परत के माध्यम से गुजरता है। आंतरिक परमाणु परत के भीतर रेटिना न्यूरॉन्स के लिए, सेलुलर रिकॉर्डिंग से पहले रेटिना वर्गों की तैयारी संभवतः प्रदूषण से बचने के लिए सबसे अच्छा काम करेगी। प्रत्येक कोशिका को पृथक और तैयार किया जाएगा जैसा कि यहां वर्णित हैSsification कदम इसके अलावा, हम न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं, लेकिन इस तकनीक को किसी भी प्रकार के सेल पर लागू किया जा सकता है जो किसी ट्रांसजेनिक मॉडल के उपयोग के जरिए आकृति विज्ञान की विशेषता हो या अलग हो सकता है।

इस तकनीक को पहले से तैयार सीडीएनए पुस्तकालयों के साथ काम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसा कि हम अतीत में माइक्रोएरे संकरण 28 के लिए जेनरेट कर चुके हैं। अलग से तैयार की गई पुस्तकालय के साथ, सीडीएनए की मात्रा 50-150 एनजी की सीमा से शुरू होती है और चरण 8.4 पर प्रोटोकॉल शुरू होती है; उच्च और निचले सांद्रता का प्रयास नहीं किया गया है, हालांकि वे भी काम कर सकते हैं। डीएनए मोती का उपयोग कर सीडीएनए की शुद्धिकरण पहले होगी, इसके बाद टैगमेंटेशन और पीसीआर प्रवर्धन होगा। हमने पुस्तकालय की तैयारी से सीडीएनए के साथ इस समायोजन का परीक्षण किया है, जैसे माइक्रोएरे संकरण 29 के लिए , और सफलतापूर्वक आरएनए-सैक के लिए टैग किए गए पुस्तकालयों का निर्माण किया है।

पंखसहयोगी, इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल प्रेरक प्लेटिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससीएस) से सेल आबादी के एक विशेष प्रेरण की सफलता के आकलन में किया जा सकता है। इन फिर से क्रमादेशित प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं के भेदभाव के पीछे प्रेरणा शक्ति प्रतिलेखन कारकों की समझ पर निर्भर करती है जो कोशिका प्रकारों को एक-दूसरे से अलग-अलग विकसित करने का नेतृत्व करती हैं। न्यूरोनल विविधता का अध्ययन करने के लिए विशेष सेल भाग्य की दिशा में iPSCs ड्राइविंग एक नई विधि है, क्योंकि यह चुनिंदा सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को इस मॉडल से विभेदित कोशिकाओं के बीच विविधता की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जैसा कि पहले बताया गया है, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के 30 से अधिक कार्यात्मक उपप्रकार हैं, और आईपीएससी से कार्यात्मक आरजीसी उत्पन्न करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। आरजीसी के उपप्रकारों के लिए मार्करों की पहचान - हमारे मामले में, आईपीआरजीसी - आरजीसी के विभिन्न उपप्रकारों के उत्पादन में शोधकर्ता को अपने प्रोटोकॉल की सफलता का मूल्यांकन करने की अनुमति देगा। सेल प्रकार के मूल्यांकनइन न्यूरॉन्स के बीच इस प्रोटोकॉल से लाभ होगा और उपप्रकार-विशिष्ट मार्कर की लगातार जांच के लिए एक उपकरण के रूप में भी काम कर सकता है क्योंकि यह मॉडल प्रणाली आसानी से उपलब्ध हो जाती है।

वर्तमान पांडुलिपि में, हम अलगाव के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन करते हैं और ट्रांस्क्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं की तैयारी करते हैं। इसके अलावा, हम प्रोटोकॉल को संपादित करने के तरीकों का सुझाव देते हैं जिससे कि यह तकनीक कई तरह के लक्ष्यों को ध्यान में रखते हुए प्रयोगों के लिए इस्तेमाल की जा सके। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल Trombetta एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था 24 कम इनपुट आरएनए-सैक के लिए अनुशंसित किट निर्देशों के समायोजन के रूप में प्रमुख अंतर सेल अलगाव के भीतर होते हैं और हमने इस परियोजना की जरूरतों को पूरा करने के लिए चुना है। यह इस बात को उजागर करना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम रेटिना ऊतक से कोशिकाओं का अलगाव है। यह प्रोटोकॉल डुरिन में एक बिंदु हैजी जो अधिकतर त्रुटियां उत्पन्न हो सकती हैं, और यह सबसे सावधानीपूर्वक ध्यान के साथ किया जाना चाहिए संदूषण के किसी भी प्रकार के परिणामस्वरूप अनुपयोगी नमूनों का परिणाम हो सकता है, जबकि कोशिका द्रव्य के नुकसान से एमआरएनए अणुओं की गंभीर कमी हो सकती है। यह कदम सावधानी से और उसी व्यक्ति द्वारा प्रयोग से प्रयोग करने के लिए किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूनों को ठीक से संभाला गया है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल उच्च-गुणवत्ता वाली आरएनए-सीक के वर्गीकरण, अलगाव, और कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है। यह एकल कोशिकाओं से डेटा की गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए एक कुशल, अपेक्षाकृत कम लागत वाला तरीका है। यह तकनीक बहुमुखी है और विभिन्न अध्ययनों के लिए आवेदन के लिए न्यूनतम रूप से संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम नमूने तैयार करने और प्रबंधित करने में उनकी सहायता के लिए जेनिफर बेयर और ईनाट स्निर, साथ ही साथ आइवा इंस्टीट्यूट फॉर ह्यूमन जेनेटिक्स को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ames' Medium Sigma Aldrich A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S8875
K-gluconate Spectrum Chemical PO178
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide Invitrogen A10442
Collagenase Worthington Biochemical  LS005273
Hyaluronidase Worthington Biochemical  LS002592
Petri dish (35 mm diameter) Thermo Fisher Scientific 153066
Ophthalmologic scissors Fine Science Tools 15000-00
#5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
Microplate Shaker Fisher Scientific 13-687-708
Glass Micropipette Sutter BF120-69-10
Micropipette Puller Sutter P-1000 horizontal pipette puller
1 mL syringe Fisher Scientific 14-823-2F
Flexible tubing Fisher Scientific 14-171
TCL lysis buffer Qiagen 1031576 Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
RNase-free Water Qiagen 129112
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 30124359
Ethyl Alcohol, Pure Sigma Aldrich E7023 Ethanol
Analog Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215365 Vortex
Mini Centrifuge Thermo Fisher Scientific 05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads Beckman Coulter A63987 RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator Promega V8351 Magnetic stand
1.5 mL MCT Graduated Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Clontech 634888 Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10x Lysis Buffer Lysis Buffer 2
5x Ultra Low First-strand Buffer Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase Reverse Transcriptase (RT)
2x SeqAmp PCR Buffer PCR Buffer
PCR Primer II A PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase DNA Polymerase
Mastercycler pro S Eppendorf 950030020 Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881 DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents Agilent Technologies 5067-4626
Qubit HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer Buffer 2
ATM Tagmentation Mix
NT Buffer Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001 Indices for Tagmentation
N501 White 1
N502 White 2
N701 Orange 1
N702 Orange 2
HiSeq 2500 Illumina SY-401-2501 For completing sequencing of samples

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References

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