خلايا الثدييات التغليف في أحجار الجينات باستخدام سفينة أثارت بسيطة

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

هذا الفيديو ومخطوطة تصف طريقة مستحلب لتغليف خلايا الثدييات في 0.5٪ إلى 10٪ الخرز الجينات التي يمكن أن تنتج في دفعات كبيرة باستخدام وعاء أثارت بسيطة. يمكن زراعة الخلايا المغلفة في المختبر أو زرعها لتطبيقات العلاج الخلوي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hoesli, C. A., Kiang, R. L., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M., Piret, J. M. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد استخدمت تغليف الخلايا في الخرز الجينات لثقافة الخلايا يجمد في المختبر وكذلك ل إمونوسولاتيون في الجسم الحي . وقد تم دراسة تغليف جزيرة البنكرياس على نطاق واسع كوسيلة لزيادة بقاء جزيرة في زرع خيفي أو زينوجينيك. ويتحقق تغليف الألجينات عادة عن طريق قذف فوهة والهلام الخارجي. باستخدام هذه الطريقة، قطرات الجينات التي تحتوي على الخلية تشكلت في غيض من الفوهات تقع في محلول يحتوي على الكاتيونات ثنائي التكافؤ التي تسبب الجيلاتين المؤلمة الاجهاد كما أنها تنتشر في قطرات. شرط تشكيل الحبرية في طرف فوهة يحد من الإنتاجية الحجمي وتركيز الجينات التي يمكن تحقيقها. يصف هذا الفيديو طريقة استحلاب قابلة للتغليف خلايا الثدييات في 0.5٪ إلى 10٪ الجينات مع 70٪ إلى 90٪ البقاء على قيد الحياة الخلية. بواسطة هذه الطريقة البديلة، يتم استحصال قطرات الجينات التي تحتوي على خلايا وكربونات الكالسيوم في الزيوت المعدنية، فولمنخفضا بانخفاض في درجة الحموضة يؤدي إلى الإفراج الداخلي عن الكالسيوم و الجيلاتين المؤلمة. الأسلوب الحالي يسمح لإنتاج الخرز الجينات في غضون 20 دقيقة من الاستحلاب. المعدات المطلوبة لخطوة التغليف تتكون من سفن مقلوبة بسيطة متاحة لمعظم المختبرات.

Introduction

وقد تم دراسة تغليف الخلايا الثدييات على نطاق واسع كوسيلة لحماية الخلايا المزروعة من الرفض المناعي 1 أو لتوفير دعم ثلاثي الأبعاد لثقافة الخلايا يجمد 2 ، 3 ، 4 . وقد تم استخدام تغليف جزيرة البنكرياس في الخرز الجينات لعكس مرض السكري في خيفي 5 ، 6 أو زينوجينيك 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 القوارض. التجارب قبل السريرية والسريرية من زرع جزيرة البنكرياس مغلفة لعلاج مرض السكري من النوع 1 مستمرة 13 ، 14 ، 15 . لتطبيقات زرع أو أكبر حجماه في المختبر يجمد إنتاج الخلايا، وتستخدم عموما مولدات حبة مقرها فوهة. عادة، يتم ضخ مزيج من الجينات والخلايا من خلال فوهة لتشكيل قطرات التي تقع في محلول محرض يحتوي على الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مما أدى إلى هلام الخارجي للقطرات. تدفق الغاز المحوري 16 ، 17 ، فوهة الاهتزاز 18 ، كهرباء التنافر 19 أو الدورية الأسلاك 20 تسهيل تشكيل قطرة في طرف فوهة.

العوائق الرئيسية لمولدات حبة التقليدية هي إنتاجية محدودة ومجموعة محدودة من اللزوجة الحل الذي سيؤدي إلى تشكيل حبة كافية 21 . في معدلات تدفق عالية، والسوائل الخروج من فوهة يكسر في قطرات أصغر من قطر فوهة، وانخفاض حجم السيطرة. مولدات متعددة فوهة حبة يمكن استخدامها لزيادة الإنتاجية، ولكنوالتوزيع الموحد للتدفق بين الفتحات واستخدام الحلول> 0.2 باس هو مشكلة 22 . وأخيرا، من المتوقع أن نقل بعض الأضرار التي لحقت الجزر، لأن قطر الفوهات المستخدمة ما بين 100 ميكرون و 500 ميكرون، في حين أن ~ 15٪ من الجزر البشرية يمكن أن يكون أكبر من 200 ميكرون 23 .

في هذا الفيديو، ونحن تصف طريقة بديلة لتغليف خلايا الثدييات من خلال تشكيل قطرات في خطوة استحلاب واحد بدلا من قطرة عن طريق قطرة. منذ يتم تنفيذ إنتاج حبة في وعاء أثارت بسيطة، وطريقة مناسبة لصغيرة (~ 1 مل) على نطاق واسع (10 3 L مجموعة) حبة الإنتاج مع انخفاض تكاليف المعدات 24 . هذا الأسلوب يسمح لإنتاج الخرز مع كروية عالية باستخدام مجموعة واسعة من اللزوجة الجينات مع قصيرة (على سبيل المثال 20 دقيقة) حبة جيل مرات. وقد وضعت هذه الطريقة في الأصل من قبل بونسيليت وآخرونل. 25 ، 26 وتستخدم لتجميد الحمض النووي 27 والبروتينات 28 بما في ذلك الأنسولين 29 ، والبكتيريا 30 . لقد تكييفنا مؤخرا هذه الأساليب لتغليف خلايا الثدييات باستخدام خطوط خلايا بيتا البنكرياس 31 ، 32 وأنسجة البنكرياس الأساسي 32 .

مبدأ الأسلوب هو توليد المياه في النفط مستحلب تتكون من قطرات الجينات في الزيوت المعدنية، تليها هلام الداخلية من قطرات الجينات ( الشكل 1 ). أولا إنكابسولانت (على سبيل المثال، الخلايا) هو فرقت في محلول الجينات تحتوي على غرامة ملح الكالسيوم الحبوب مع ذوبان منخفضة في درجة الحموضة العملية الأولية. ثم تضاف خليط الجينات إلى مرحلة عضوية مهيجة لإنشاء مستحلب، وعادة في وجود التوتر السطحي. في حالة تغليف الخلايا الثدييات، يمكن أن تكون المكونات الموجودة في المصل بمثابة عوامل خافضة للتوتر السطحي. بعد ذلك، يتم تخفيض الرقم الهيدروجيني من أجل ذوبان ملح الكالسيوم بإضافة حمض قابل للذوبان في الزيت الذي يقسم إلى المرحلة المائية. يجب أن يذوب حامض الخليك مع معامل تقطيع الزيت / الماء <0.005 33 قبل أن يذوب في الزيت ثم يضاف إلى المستحلب حيث يتم خلطه في طور الزيت ويقسم بسرعة إلى المرحلة المائية 34 . ويوضح الشكل 2 التفاعلات الكيميائية ونشرها التي تحدث أثناء التحمض وخطوة الهلام الداخلية. وأخيرا، يتم استرداد الخلايا المغلفة من قبل انقلاب المرحلة، فصل المرحلة تسارع بواسطة الطرد المركزي، خطوات الغسيل المتكررة والترشيح. ويمكن بعد ذلك اتباع هذه الخطوات من قبل حبة وأخذ العينات خلية لتحليلات مراقبة الجودة، في الخلايا المخبرية ثقافة و / أو زرع الخلايا المغلفة.

s = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> شكل 1
الشكل 1: تخطيطي لعملية مستحلب القائم لتغليف خلايا الثدييات. يتم إنتاج الخرز أولا عن طريق استحلاب الجينات والخلايا وكاكو 3 خليط في الزيوت المعدنية (الخطوات 1 و 2 في التخطيطي)، مما اثار الهلام الداخلي عن طريق إضافة حمض الخليك (الخطوة 3). ثم يتم فصل الخرز التبلور من النفط بإضافة العازلة المائية لتحريك مرحلة الانقلاب (الخطوة 4)، تليها الطرد المركزي وطموح النفط (الخطوة 5)، ثم الترشيح (الخطوة 6). وأخيرا، يتم نقل الخرز التي تم جمعها على مرشح في وسط زراعة الخلايا للفي المختبر الثقافة أو لزرع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ردود الفعل ونشر الخطوات التي تحدث أثناء الهلام الداخلي. (1) يتم إضافة حمض الخليك إلى المرحلة العضوية ويتم نقله إلى قطرات الجينات بالحمل الحراري. (2) أقسام حمض الخليك في المرحلة المائية. (3) في وجود الماء، ينفصل الحمض وينتشر للوصول إلى حبوب الكاكاو 3 التي تصور باللون الأزرق الداكن. (4) يتم تبادل الأيونات H + مع أيونات كا 2 + في كاكو 3 ، والإفراج عن كا 2 + أيونات. (5) أيونات الكالسيوم منتشر حتى يواجهون الجينات غير المتفاعلة، مما يؤدي إلى الربط عبر اليونوتروبيك لسلاسل الجينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على النقيض من التقليدية إنوابسولاتورس خلية مقرها فوهة، توزيع حجم حبة واسعة هو إكسبكتد من هذه العملية بسبب آلية تشكيل الحبرية في استحلب أثار. بالنسبة لمجموعة فرعية من التطبيقات، قد يكون هذا التوزيع حجم حبة مشكلة. على سبيل المثال، قد يتعرض جزء أكبر من الخلايا في سطح حبة في الخرز أصغر. إذا كانت القيود الغذائية ( مثل الأكسجين) هي مصدر قلق، قد تتفاقم هذه القيود في الخرز أكبر. ميزة من أسلوب استحلب أثار هو أن متوسط ​​حجم حبة يمكن تعديلها بسهولة عن طريق تغيير معدل الإثارة خلال خطوة الاستحلاب. ويمكن أيضا توزيع حجم حبة واسعة يمكن استغلالها لدراسة تأثير حجم حبة على أداء الخلايا مغلفة.

تغليف الخلايا الثدييات عن طريق الاستحلاب والهلام الداخلي هو بديل مثير للاهتمام للمختبرات التي ليست مجهزة مع مولد حبة. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يعطي المستخدمين خيار تقليل وقت المعالجة، أو توليد الخرز في منخفضة جدا أو عالية جدا الجينات كونسنتربالجمع.

بروتوكول موضح أدناه يصف كيفية تغليف الخلايا في 10.5 مل من محلول الجينات 5٪ أعدت في 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض (هيبيس) العازلة. يتكون الجينات من خليط 50:50 من لفم الزرع الصف (منخفض اللزوجة عالية محتوى حمض المنورونيك) و مفغ (اللزوجة المتوسطة محتوى حمض غولورونيك عالية) الجينات. كربونات الكالسيوم في تركيز النهائي من 24 ملم يستخدم كعامل الربط عبر المادية. يشكل الزيت المعدني الخفيف المرحلة العضوية، في حين يستخدم حامض الخليك لتحميض المستحلب وإطلاق الهلام الداخلي. ومع ذلك، نوع الجينات وتكوينها، فضلا عن المخزن المؤقت عملية اختيار تعتمد على التطبيق المطلوب 32 . وقد استخدمت مجموعة متنوعة من أنواع الجينات (انظر الجدول من المواد) لإنتاج الخرز مع هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير محلول الألجينات، تعليق الكاكو 3 والنفط الحامض

  1. إعداد العازلة العملية والمتوسطة.
    1. إعداد العازلة عملية نموذجية تستخدم لتوليد عالية التركيز الخرز الجينات باستخدام 10 ملي هيبيس، 170 ملي كلوريد الصوديوم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    2. إعداد وسط ثقافة نموذجية باستخدام دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 6 ملي الجلوتامين، 100 / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. إعداد محلول المخزون الجينات في 1.17 أضعاف التركيز المطلوب النهائي في الخرز.
    1. أولا، تزن كمية مناسبة من مسحوق الجينات. على سبيل المثال، للحصول على تركيز النهائي من الجينات 5٪ مع 50:50 لفم و مفغ الجينات، تزن ما مجموعه 1.17 جرام الجينات الصوديوم من خلال الجمع بين 0.583 غرام لفم الجينات مسحوق و 0.583 غرام مفغ مسحوق الجينات.
    2. وضع 20 مل العازلة العملية في أوتوكجرة زجاجية لافابل على لوحة ضجة مغناطيسية وتهيج في ~ 200 دورة في الدقيقة. إضافة تدريجيا مسحوق الجينات الصوديوم إلى الحل.
    3. ترك الحل اثارة بين عشية وضحاها في سرعة منخفضة. إذا لزم الأمر، ربط قارورة إلى لوحة ضجة.
    4. إذا كان الحل غير حل تماما، ربط زجاجة على خلاط دوارة والاستمرار في الخلط عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إضافية.
    5. تعقيم الحل الجينات عن طريق التعقيم الحل لمدة 30 دقيقة في وعاء أقل من نصف كامل. اترك درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية قبل استرجاع الحل.
    6. إذا لزم الأمر، وإزالة الجسيمات عن طريق تصفية محلول الجينات بعد وقت قصير من التعقيم قبل أن تصل إلى درجة حرارة الغرفة، في حين أن اللزوجة لا تزال منخفضة بما فيه الكفاية.
  3. إعداد تعليق كربونات الكالسيوم في 21 أضعاف التركيز المطلوب النهائي لالهلام الداخلي.
    1. تزن مسحوق كاكو 3 . على سبيل المثال، الإعلاند 1 ز كاكو 3 إلى 20 مل العازلة العملية للحصول على 24 ملي كاو 3 كما النهائي تركيز عامل التبلور.
    2. الأوتوكلاف تعليق 3 كاكو لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: سوف تتغير تركيز كاكو 3 مع مرور الوقت بسبب بيكربونات - كو 2 التوازن. تجنب استخدام نفس المخزون كاكو 3 تعليق لأكثر من 10 إجراءات التغليف.
  4. الأوتوكلاف السفينة أثارت لعملية الاستحلاب. قبل الاستخدام، إزالة أي آثار من الماء المكثف المتبقية في قارورة الدوار.
  5. مباشرة قبل عملية الاستحلاب، إعداد النفط أسيديفيد. حل 44 ميكرولتر حامض الخليك في 11 مل من الزيوت المعدنية وضعت في أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: خطأ شائع هو حل غير مكتملة للحمض الخليك. تجنب بيبتينغ كميات صغيرة من حمض الخليك والتأكد من أن حمض الأسيتيك يذوب تماما في النفط من قبل فورتيكسينغ المتكررة.
    تنبيه: حمض الخليك هو سامة أ د حمض متطايرة. التعامل مع هذا الكاشف تحت غطاء الدخان والحفاظ على حمض الخليك / حل النفط في حاوية مغلقة حتى خطوة الاستحلاب. ارجع إلى معلومات مسس على هذا الكاشف للحصول على مزيد من المعلومات.
  6. السماح لجميع الحلول للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في تغليف الخلايا.

2. الجينات حبة الجيل عن طريق الاستحلاب والهلام الداخلية

  1. وضع 10 مل من النفط المعدني الخفيف في قارورة الدوار والبدء في التحريض بسرعة دوران منخفضة (على سبيل المثال 250 دورة في الدقيقة لدورق الدوار تستخدم في هذا الفيديو).
  2. إذا كانت الخلايا المستخدمة لهذه العملية هي من الثقافات الملتصقة، وتطبيق التربسين لتعليق الخلايا. إنهاء رد فعل بإضافة فبس المحتوية على المتوسطة أو التربسين المانع وجمع عينة لتعداد الخلايا.
    1. تحديد تركيز الخلية وجدوى بعد تريبان تلطيخ الأزرق باستخدام عدادة الكريات أو عداد الخلية الآلي، كما هو موضح سابقاأس = "كريف"> 32.
  3. الطرد المركزي الخلايا لمدة 7 دقائق في 300 x ج وغسلها مرة واحدة في الوسط المطلوب لتجميد الخلايا. تأكد من أن هذه الوسيلة تحتوي على مستحلبات مثل فبس أو ألبومين المصل البقري (بسا). على سبيل المثال، استخدم دمم يحتوي على 10٪ فبس.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في نفس المتوسطة للحصول على 10.5 أضعاف التركيز النهائي المطلوب في الخرز.
  5. إضافة 1.1 مل من 10.5 أضعاف مخزون الخلية المركزة إلى 9.9 مل من محلول الجينات. ثم، إضافة 550 ميكرولتر من تعليق 3 كاكو وتخلط عن طريق التحريك مع ملعقة معقمة لضمان توزيع حتى من كاكو 3 .
  6. نقل على الفور 10.5 مل من خليط الألجينات والخلايا وكاكو 3 في زيت تهييج باستخدام حقنة.
    ملاحظة: بالنسبة للحلول عالية اللزوجة، نضح وإخراج الخليط ببطء شديد لتجنب فقاعات الهواء. في بعض الحالات، فمن الأفضل لوقف التحريض مع إضافة الخليط إلى قارورة لتجنبالجينات إنتراينمنت على المكره رمح.
  7. مباشرة بعد إضافة الجينات والخلايا و كاكو 3 خليط إلى النفط، وزيادة معدل الإثارة.
    ملاحظة: لفم 5٪: الجين مفغ المستخدمة هنا، تم تطبيق سرعة دوران 1025 دورة في الدقيقة لتوليد الخرز من حوالي 900 ميكرون قطرها مناسبة للفي المختبر الثقافة 35 . سوف تؤدي سرعات دوران أعلى و تركيزات أقل من الجينات إلى انخفاض متوسط ​​أقطار حبة، كما هو موضح في المنشورات السابقة 25 ، 32 . التغيرات الطفيفة في المكره والهندسة السفينة، وكذلك خصائص الجينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على متوسط ​​قطر حبة. لكل تغيير في تكوين السفينة أو الكثير من الجينات، يجب إنشاء منحنى قياسي يتعلق بحقل منطقة متوسط ​​قطر حبة متوسط ​​لسرعة دوران 32 .
  8. بدء الموقت واستحلاب الجينات لمدة 12 دقيقة.
  9. إضافة 10 مل من رانه النفط وحمض الخليك حل لتحمض مستحلب، حل كاكو 3 ، وبالتالي جسديا عبر ربط الجينات في الخرز تبلور. السماح 8 دقيقة لهذه الخطوة التحمض.

3. حبة الانتعاش

  1. تقليل معدل التحريض إلى 400 دورة في الدقيقة. إضافة 40 مل من العازلة العملية مختلطة مع 10٪ المتوسطة لزيادة الرقم الهيدروجيني وتسبب انقلاب المرحلة.
  2. وقف التحريض 1 دقيقة في وقت لاحق ونقل الخليط إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي. شطف قارورة الدوار مع إضافية 20 مل المتوسطة وإضافة هذا إلى أنبوب. نضح قدر ما المرحلة المائية ممكن من قارورة الدوار قبل الشفط مرحلة النفط للحد من اتصال حبة مع مرحلة النفط.
    ملاحظة: استخدام ماصة كبيرة تتحمل (على سبيل المثال 25 مل ماصة) في هذه الخطوة ومن هذه النقطة على لتجنب إتلاف الخرز. لأحجام أصغر، ويمكن أيضا التلاعب حبة تعليق مع نصائح ماصة قطع. للحصول على هذه النصائح، وقطع نهاية طرف ماصة مع مقص وإيل ارتداء حماية العين.
  3. أجهزة الطرد المركزي أنابيب لمدة 3 دقائق في 630 x ج لتسريع حبة تسوية وفصل المرحلة.
  4. إزالة النفط والفائض محلول مائي عن طريق الشفط مع ماصة باستور.
  5. غسل الخرز مرة واحدة على الأقل مع المتوسطة. تصفية تعليق حبة على 40 ميكرون مصافي الخلايا النايلون، ونضح السائل الزائد المرتبطة مع الخرز من تحت مصفاة. نقل الخرز إلى حجم معروف من المتوسطة باستخدام ملعقة معقمة.
    ملاحظة: أصغر أو أكبر حجم المسام مرشحات يمكن استخدامها في هذه الخطوة، اعتمادا على الهدف الحد الأدنى قطر حبة. ومع ذلك، ينصح الترشيح الجاذبية بدلا من الترشيح يحركها الضغط من خلال الفرعية ميكرون حجم المسام مرشحات لتجنب إتلاف الخرز.
  6. قياس حجم حبة من حجم النزوح (حجم بعد إضافة الخرز، ناقص حجم قبل إضافة الخرز) وأعلى حتى المتوسطة للحصول على حبة المطلوب: إجمالي حجم نسبة، والتي هي عادة 1: 5، أو 1 مل الخرز في4 مل متوسطة. من هذه النقطة على، دائما استخدام ماصات تتحمل كبيرة لتجنب إتلاف الخرز.
  7. نقل الخلايا مغلفة في T- قوارير للفي المختبر ثقافة أو زرع التجارب.

4. مراقبة الجودة والتطبيقات

ملاحظة: من أجل ضمان الخلايا مغلفة وجودة حبة، وتوزيع حجم حبة والبقاء على قيد الحياة الخلية بعد العملية ينبغي أن يكون كميا. عكس هلام لاستعادة الخلايا من داخل الخرز لمزيد من التحليل يتم عادة.

  1. لتقييم توزيع حبة حجم، وصمة عار الخرز مع تولويدين الأزرق- O.
    1. وضع حبات 0.5 مل في المخزن المؤقت عملية 4 مل يحتوي على 10٪ المتوسطة كاملة.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 1 ز / لتر محلول الأزرق تولويدين أعدت في المخزن المؤقت العملية.
    3. احتضان لمدة 60 دقيقة في أنبوب مخروطي على شاكر دوارة في 50 دورة في الدقيقة.
    4. إضافة 5 مل العازلة العملية التي تحتوي على 10٪ كاملة المتوسطة و إمدنقل حبات على نحو حرفي والحل في طبق بتري والحصول على الصور على مجهر التكبير منخفضة أو باستخدام كاميرا رقمية باليد. إذا لزم الأمر، ضع طبق بتري على مربع الضوء قبل الحصول على الصور مع الكاميرا المحمولة لتعزيز التباين وتجنب الظلال.
    5. أداء تحليل الصورة لتحديد حجم حبة التوزيع كما هو موضح سابقا 32 ، على سبيل المثال باستخدام تحليل الصور مجانية 36 .
  2. لتقييم بقاء الخلية نوعيا، وصمة عار الخلايا باستخدام هوموديمر إثيديوم لتحديد الخلايا الميتة و كالسين آم لتحديد الخلايا الحية.
    1. إضافة 1 حجم من الخرز إلى 4 مجلدات من المخزن المؤقت العملية التي تحتوي على 10٪ المتوسطة كاملة.
    2. إضافة كمية مناسبة من كالسين آم و إديديوم حلول الأسهم هوموديمر للحصول على 4 ميكرومتر و 2 ميكرومتر تركيزات، على التوالي. توليد الضوابط وصمة عار واحدة عن طريق إضافة واحد فقط من الكواشف لبعض عينات حبة.
    3. احتضان الخرز على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. وضع الحل بين شريحة ساترة باستخدام فاصل مثل حلقة o لتجنب ضغط الخرز.
    5. انتقل إلى المجهر مضان. استخدام الضوابط وصمة عار واحدة لتقييم مضان تنزف من خلال. حدد مرشحات مضان المناسبة على أساس موجات الإثارة / الانبعاثات المرتبطة كالسين آم (494/517 نانومتر) و إيثيديوم هوموديمر ملزمة دنا (528/617 نانومتر).
  3. لاستعادة الخلايا من الخرز لمزيد من التحليل، ديجيل الجينات باستخدام سيترات أو حل مخلب آخر.
    1. إعداد حل ديجلينغ تحتوي على 55 ملي سترات، هيبيس 10 ملي و 95 ملي كلوريد الصوديوم في درجة الحموضة 7.4.
    2. مزيج هذا الحل مع وسط 10٪، ومن ثم إضافة 1 مل الجينات الخرز إلى 9 مل من الخليط.
    3. ديجيل الخرز على الجليد مع 75 دورة في الدقيقة التحريض لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن الآن أن تستخدم الخلايا لتحليل أو إزالتها من سوليت الجينات ديجيلدأيون بواسطة الطرد المركزي. على سبيل المثال، بقاء الخلية بعد ديجلينغ يمكن قياسها من قبل تلطيخ تريبان الأزرق. بدلا من ذلك، يمكن طرد الخلايا وغسلها، تليها مرنا، الحمض النووي و / أو عينات العينات البروتين والتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في نهاية عملية الاستحلاب والهلام الداخلي، يجب استرداد حجم حبة مشابه لحجم الخليط الأولي وخليط الخلية. يجب أن تكون الخرز كروية للغاية مع عدد قليل من العيوب ( الشكل 3 ). يجب أن تكون الخرز قوية بما فيه الكفاية لتحمل بيبتينغ من خلال ماصات تتحمل كبيرة. في تركيزات عالية الجينات، يمكن ملاحظة قطرات النفط أو الهواء مغلفة في الخرز. هذا يحدث على الأرجح بسبب انحباس النفط في قطرات الجينات خلال خطوة الاستحلاب (النفط / المياه / النفط مستحلب مزدوج). في أيدينا، هذه الخرز تمثل جزء صغير (<5٪) من حجم حبة وأغلب هذه الخرز تم إزالتها في حين الشفط النفط خلال خطوة الانتعاش حبة، وذلك بسبب كثافتها أقل.

الشكل 3
الشكل 3 : حبات الجينات الممثلة 5٪ التي تحتوي على خلايا βTC3 مغلفة التي تم الحصول عليها من خلال عملية الاستحلاب والهلام الداخلي صورة النقيض من 5٪ حبات الجينات التي تحتوي على 5 × 10 6 βTC3 خلايا / مل الخرز الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

حجم الخرز التي تم الحصول عليها لن تكون موحدة - وهذا هو سمة جوهرية من مستحلب أثار ( الشكل 4A ). خلال الاستحلاب في تدفق المضطرب، تقلبات الضغط تعمل على تعطيل قطرات 37 ، 38 ، مواجهة التوتر السطحي والقوى اللزجة في المرحلة فرقت 39 . القوى اللزجة لا يمكن تجاهلها إذا كانت اللزوجة في المرحلة المشتتة أعلى بكثير من اللزوجة ه المرحلة المستمرة. على افتراض أن الحد الأقصى لمعدل تبديد الطاقة المحلية يتناسب مع متوسط ​​معدل تبديد الطاقة في الوعاء، يمكن حساب أقصى قطر قطرة مستقر d ماكس (إذا كان أعلى من مقياس كولموغوروف) على النحو التالي 39 ، 40 ، 41 ، 42
المعادلة 1
حيث ρ c هي كثافة المرحلة المستمرة، ε هو متوسط ​​معدل تبديد الطاقة في الوعاء، σ هو التوتر بين السطحيين، μ d هي لزوجة المرحلة المشتتة و C ثابت التناسب. عندما تسود قوى التوتر السطحي على القوى اللزجة، يبسط الجانب الأيمن إلى C ، في حين إذا تسود القوات اللزجة فإنه يبسط:

سس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> المعادلة 2

أما في السطوح المحركة، فإن مدخلات الطاقة تحت مقاييس التدفق المضطرب تتناسب مع دخل القدرة لكل وحدة حجم، أي إلى N i 3 D i 2 ، حيث N i هو معدل الإثارة و D i هو قطر المكره. لذلك، جنبا إلى جنب مع المعادلة 1 وبالنظر إلى ثابت D ط ، إذا كانت قوى التوتر السطحي تسود د ماكس من المتوقع أن تكون متناسبة مع N ط -1.2 ( الشكل 4B )، في حين أنه يتناسب مع N ط -0.75 إذا القوى اللزجة داخل الخرز تسود كقوة ريتنتيف الرئيسية. ويشير الشكلان 4B و 4 C إلى أن التأثيرات البينية تحدد د(ريبليت) لتركيزات منخفضة من الجينات، في حين تصبح القوى اللزجة أكثر هيمنة عند تركيز الجينات أعلى (على سبيل المثال 5٪ للجينات # 3 الموصوفة في جدول المواد). وبما أنه يمكن أن يكون من غير العملي تحديد د ماكس كحد أقصى ، فإن قيم الكميات العالية ( مثل الكوميل 95) للقطر أو اللحظة السطحية تعني القطر ( d 32 ) قد استخدمت بدلا من ذلك، لأنها تتناسب عموما مع d ماكس 43 .

قبل تغليف الخلايا، فمن المستحسن أن منحنى د 32 كدالة N ط ولدت ( الشكل 4B ). سيساعد هذا المنحنى على تحديد N المناسب للحصول على متوسط ​​حجم حبة المطلوب. ومن المرجح أيضا أن يكون هناك حاجة إلى منحنى قياسي جديد لدفعات مختلفة من النفط أو الجينات، أو إذا كان الجينسين كونسنيتم تعديل تراتيون. اعتمادا على هندسة السفينة وعلى تركيزات الجينات، مجموعة واسعة نسبيا من أقطار حبة متوسطة يجب أن تكون قابلة للتحقيق. على سبيل المثال، D 32 القيم بين 200 ميكرون و> 1 ملم يمكن الحصول عليها باستخدام 2٪ ( الشكل 2C في هوسلي وآخرون 32 ) إلى 5٪ الجينات ( الشكل 4 ) باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه.

الشكل 4
الشكل 4 : توزيع حجم الخرزة. ( A ) تولويدين الأزرق- O الملون 5٪ الخرز الجينات. ( ب ) د 32 كدالة لمعدل الإثارة ( N ط ) ل 1.5٪ و 5٪ حبات الجينات باستخدام خليط 50:50 من الجينات # 1 و # 2 (انظر جدول المواد). يتم عرض نقطة واحدة للجي 5٪نيت الخرز. ( C ) d 32 كدالة من N i ل 2٪ و 5٪ ألجينات # 3 (انظر جدول المواد). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري لأحجام حبة ضمن عينة (N> 150 الخرز). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعتمد بقاء الخلية من عملية الاستحلاب والهلام الداخلي بشكل رئيسي على مدى ومدة انخفاض الرقم الهيدروجيني الذي تعاني منه الخلايا. باستخدام العملية الموضحة في هذا الفيديو، تم قياس 76 ± 2٪ βTC3 بقاء الخلية 31 . عند تغليف الخلايا المشتتة في 10 5 خلية / مل الجينات إلى 10 7 خلية / مل الكثافة البذر الجينات، يجب أن تحتوي جميع الخرز الخلايا. عند تغليف مجموعات الخلايا مثل خلايا البنكرياس، يمكن توقع وجود مجموعة فرعية من الخرزذ. ويبين الشكل 5 نموذجي خلية حية / ميتة تلطيخ النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه العملية. ويمكن تحقيق بقاء الخلية العليا من خلال زيادة قدرة المخزن المؤقت للعملية وخفض مدة خطوة التحمض. على سبيل المثال، تم الحصول على 90 ± 2٪ MIN6 البقاء على قيد الحياة خلية باستخدام 60 ملي موبس (3- (N- مورفولينو) حمض بروبانيسولفونيك) كما المخزن المؤقت العملية ومن خلال تقليل الوقت الكلي لعملية إلى 4 دقائق 32 . ومع ذلك، كانت الخرز ولدت أقوى بكثير مع العازلة العملية هيبيس 10 ملي من مع العازلة عملية موبس 60 بسبب زيادة كميات من الكالسيوم 2+ صدر في درجة الحموضة أقل 31 . كل من عملية موبس قصيرة وعملية هيبيس أطول يجب أن تولد الخرز التي هي مستقرة بما فيه الكفاية لمدة> 2 أسابيع في زراعة المختبر أو زرع. ومع ذلك، قد تتضخم الخرز أو ديجل تماما في حلول مع انخفاض الكالسيوم أو مع تركيزات عالية خالب (على سبيل المثال، خالية من الكالسيوم الفوسفات مخزنة محلول ملحي).

لخلايا MIN6 مغلفة نمت في المختبر ، مرئية الخلايا المجاميع تشكل بعد ~ 5-7 أيام من المختبر في توسيع الخلايا يجمد و 150 ميكرون ~ الكروية قطرها يمكن أن تحصد بعد 2 أسابيع. ومن المتوقع أن يكون معدل نمو الخلايا الجينات يجمد أقل مما كانت عليه في الثقافات غير يجمد، وخاصة بالنسبة للمواد الهلامية مع تركيز أعلى الجينات أو أعلى محتوى حمض غولورونيك.

الشكل 5
الشكل 5 : الخلايا المغلفة مباشرة بعد العملية. ( A ) خلية حية (الأخضر، كالسين آم) والخلية الميتة (الأحمر، إثيديوم هوموديمر) تلطيخ الخلايا مغلفة. ( B ) المرحلة صورة النقيض من نفس حبة. تم تغليف الخلايا MIN6 في 2٪حبات الجينات باستخدام 12 دقيقة استحلاب، 8 دقيقة الحموضة و 10 ملي هيبيس العازلة كما هو موضح في هذا البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات مختلفة (المبين في الشكل 2 ) خلال رد فعل الهلام الداخلي يمكن أن تحد من حركية الشاملة. بالنسبة للحبوب كربونات الكالسيوم أكبر من ~ 2.5 ميكرون، وقد تبين أن معدل حل كربونات أن الحد من معدل 26 ، 44 . خطوة التحمض التي تؤدي إلى الإفراج الكالسيوم الداخلي كما تبين أن متغير العملية الحرجة التي تؤثر على بقاء الخلية 32 . وبالتالي فإن الظروف التي تؤدي إلى الهلام الداخلي هي حاسمة سواء بالنسبة لجودة حبة وكذلك بقاء الخلية. اعتمادا على التطبيق النهائي للخرز، قد يتم اختيار مختلف ظروف العملية المثلى. على سبيل المثال، قد يكون من المرغوب فيه انخفاض درجة الحموضة أعلى (على سبيل المثال باستخدام 10 ملي هيبيس لتخفيف محلول الجينات) لتطبيقات زرع حيث الاستقرار على المدى الطويل من الخرز أمر بالغ الأهمية. من ناحية أخرى، وانخفاض انخفاض الرقم الهيدروجيني (على سبيل المثال باستخدام 60 ملي موبس إلى العازلةr الحل الجينات) قد يكون من الأفضل للتطبيقات في المختبر .

بالإضافة إلى تعديل مستوى ومدة التحمض، يمكن تصور تعديلات عملية أخرى. على سبيل المثال، يمكن استخدام تكوينات الأوعية الأخرى المحركة، وتركيزات الألجينات، ومخازن العمليات، والمراحل العضوية والعوامل الحمضية. كما نوقش سابقا، يمكن بسهولة تعديل حجم حبة المتوسط ​​عن طريق تغيير معدل الإثارة خلال خطوة الاستحلاب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي وقتا أطول استحلاب إلى أحجام أصغر حبة، ولكن يمكن أن يسبب انخفاض بقاء الخلية. منشورات بونسيليت وآخرون. 25 ، 26 ، 45 و هوسلي إت آل. 31 ، 32 وقد اختبرت وناقشت بعض هذه الخيارات.

تغييرات طفيفة في بروتوكول المذكورة أعلاه يمكن أن يكون لها تأثير عميق علىحبة جيل، حبة نوعية وبقاء خلية. يوفر الجدول 1 دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لفهم وحل المشاكل التي قد تحدث.

مشكلة سبب نموذجي الحلول المقترحة
يتوقف المكره بالتناوب أثناء إضافة الجينات أو زيت الحمض المجال المغناطيسي غير كاف للخلط الكافي أو رمح المكره غير منحرف تأكد من أن قارورة الدوار يتمركز بشكل جيد على لوحة مغناطيسية مسجلة على لوحة في الوضع الأمثل قبل إضافة خليط الجينات. اختبار معدلات التحريض عالية جدا ومن ثم انخفض إلى معدل الإثارة المطلوب قبل إضافة خليط الجينات.
تأكد من أن رمح المكره هو الانحياز جيدا ومستقرة. لبيللكو الدوار قوارير، ضمان أن المكره هو عقد بقوة في مكان بواسطة البراغي على كلا الجانبين من سبينر قارورة كاب. تأكد من أن حركة المكره يقتصر على الاتجاه شعاعي (المكره لا ينبغي تمايل على رمح).
لا الخرز التي تم الحصول عليها كان الجينات مستحلب بشكل غير صحيح ضمان أن الجينات ميكرودروبليتس مرئية خلال الاستحلاب. إن لم يكن، تحقق من أن كثافة مرحلة النفط وهندسة السفينة 23 مماثلة لتلك الموصوفة في هذا البروتوكول. قد لا تسمح مرحلة النفط الكثيفة أو هندسة السفن التي لا توفر تبديدا كافيا للطاقة المحلية باستحلاب الجينات المناسب.
لا الخرز التي تم الحصول عليها لم يحدث الهلام الداخلي وهناك خطأ شائع هو حل غير كامل للحمض الأسيتيك في مرحلة الزيت. تأكد من أن خليط الزيت الحمضي هو فورتيكسد بما فيه الكفاية وليس لوحظ أي حمض الخليك فيأسفل الأنبوب.
إذا كان المكره لا تصل إلى النفط، ويمكن إضافة المزيد من النفط قبل إضافة الجينات. ومع ذلك، ينبغي تعديل كمية حمض الأسيتيك وفقا للمعادلة التالية:
المعادلة 3
أين المعادلة 4 1 هو نسبة مرحلة الزيت / الماء قبل التعديلات (على سبيل المثال 0.525 ل 10.5 مل الجينات في 10 مل زيت + 10 مل حمض زيت)، المعادلة 4 2 هو نسبة مرحلة النفط / الماء بعد التعديلات على البروتوكول، و داو هو معامل توزيع حامض الخليك بين المرحلتين. ويمكن قياس معامل التوزيع هذا تقريبيا أو تقريبيا بقيم مأخوذة من الأدبيات. على سبيل المثال، معامل توزيع حمض الأسيتيك بين هيبتان والماء 46 هو 0.011.
لا حبةs التي تم الحصول عليها، أو الخرز غير ميكانيكيا غير مستقرة الحل ألجينات الصفر القص اللزوجة أقل من 0.004 باسكال أو أكثر 112 با · ق بسبب ارتفاع دفعة إلى دفعة التقلب من الجينات الكثير، فمن المستحسن لقياس اللزوجة من تركيزات مختلفة من الحلول الجينات. قد تكون هناك حاجة إلى الجمع بين دفعة عالية اللزوجة مع دفعة منخفضة اللزوجة للوصول إلى اللزوجة الهدف. بالنسبة لخليط لفم و مفغ 5٪ المستخدم هنا، كانت لزوجة القص صفر 3.3 با · s. وتجدر الإشارة إلى أن الجينات مع أطوال كتلة حمض غولورونيك قصيرة جدا أو أطوال سلسلة قصيرة قصيرة قد لا تسمح تشكيل هلام.
الخرز كبيرة جدا أو صغيرة جدا معدل الإثارة خلال استحلاب منخفضة جدا أو مرتفعة جدا لتركيز الجينات أو اللزوجة المستخدمة زيادة الاضطراب عن طريق زيادة معدل الإثارة أو إضافة يحير سوف يقلل من حجم حبة. تركيز الجينات، درجة الحرارةإراتور، السفينة والهندسة المكره سوف تؤثر على حجم حبة الحصول عليها.
ويلاحظ العديد من الخرز كسر التعامل مع حبة قاسية، والضرر أثناء خطوة الهلام الداخلي أو قوة حبة غير كافية. الأضرار الميكانيكية إلى الخرز يمكن أن يؤدي إلى تمزق حبة مرة واحدة يبدأ الهلام الداخلي. تقليل معدل الإثارة مباشرة قبل خطوة التحمض والتأكد من أن يتم التعامل مع الخرز بلطف باستخدام ماصات 25 مل أو 1000 ماصات ميكرولتر مع نصائح قطع. إذا لوحظت الخرز التالفة حتى مع التعامل الدقيق والحد من التحريض أثناء التحمض، قد تكون قوة حبة غير كافية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى عدم كفاية محتوى حمض غولورونيك أو التبلور غير المكتمل (مثل عدم كفاية التحمض).
انخفاض بقاء الخلية العملية الأولية درجة الحموضة عالية جدا أو النهائي درجة الحموضة منخفضة جدا يمكن زيادة بقاء عملية الخلايا الثدييات عن طريق الحد من انخفاض الرقم الهيدروجيني ووقت التحمض
انخفاض بقاء الخلية في الخرز أصغر عدم كفاية الجينات حل التخزين المؤقت القدرات ومن المتوقع انخفاض الرقم الهيدروجيني أكبر في الخرز أصغر مما كانت عليه في الخرز أكبر بسبب نسبة سطح / حجم أكبر من هذه الخرز. وبما أن حمض الأسيتيك الذي يضاف إلى المستحلب محدود، فمن المتوقع أن تكون تركيزات حامض الخليك أعلى في حبات أصغر لنفس تركيز كاكو 3 . زيادة قدرة الجينات حل التخزين المؤقت (على سبيل المثال باستخدام 60 ملي موبس بدلا من 10 هيبيس مم) يمكن أن تزيد من بقاء الخلية في الخرز أصغر 32 . يمكن إزالة الخرز الصغيرة مع خسائر الخلايا عالية بشكل انتقائي عن طريق الترشيح أو الترسيب دون تكبد خسائر حجمية كبيرة.
أنانكومبليت كاكو 3 حل عدم كفاية التحمض أو وقت التحمض. لاحظ أن هذه المشكلة قد لا تكون مشكلة إذا استقرار حبة كافية. وقد لوحظ عدم اكتمال كاكو 3 حل في الخرز أكبر بعد هذا البروتوكول 32 . يمكن أن يختلف مدى حل كاكو 3 اعتمادا على حجم حبوب الكاكاو 3 ، وانخفاض الرقم الهيدروجيني أثناء العملية، ومدة انخفاض الرقم الهيدروجيني، فضلا عن تركيز الجينات المستخدمة. لا تعتبر هذه المشكلة إشكالية طالما أن الاستقرار الميكانيكية حبة كافية للتطبيق المطلوب. لزيادة حبة عبر ربط، وضمان أن حبوب الكاكاو 3 صغيرة بما فيه الكفاية (~ 2.5 ميكرون). يمكن أن يساعد سونيكاتينغ تعليق كاسو 3 على تعطيل الحبوب المجمعة 26 . في تركيزات منخفضة جدا أو عالية الجينات، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات في تركيز كاكو 3 . وأخيرا، مخالب أو حلول منخفضةومستويات الأيونات ثنائي التكافؤ يؤدي إلى فقدان تدريجي من كا 2 + في هلام. إذا لوحظ فقدان تدريجي من حبة الاستقرار الميكانيكية، تحقق من أن تخزين حبة أو العازلة الثقافة يحتوي على> 2 ملي كا 2 + .

الجدول 1: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. قائمة المشاكل والأسباب المحتملة والحلول المحتملة.

وتشمل القيود المحتملة للاستحلاب وعملية الهلام الداخلية للفي المختبر ثقافة خلايا الثدييات وتطبيقات زرع: (1) ضرورة التعرض عابرة لدرجة الحموضة منخفضة، (2) الحاجة إلى إزالة النفط المتبقية، (3) حجم حبة بوليديسبيرز (4) إجهاد القص المحتمل خلال تشكيل الحبرية الجينات و (5) المسامية أعلى من الخرز التبلور داخليا مقارنة حبات التبلور خارجيا 47 .

وقد تم الحصول على بقاء الخلية عالية وظيفة MIN6 و βTC3بعد عملية التحسين 32 . ومع ذلك، قد لا تكون هذه العملية مناسبة لمزيد من الخلايا الحساسة الرقم الهيدروجيني. قد يكون القضاء الكامل على النفط من الخرز أيضا تحديا، وإدارة الغذاء والدواء (فدا) - أنواع النفط المعتمدة مطلوبة للتطبيقات السريرية في نهاية المطاف. قد يكون توزيع حجم حبة بوليديسبيرز أيضا إشكالية إلى حد ما لتطبيقات إمونوسولاشيون، حيث تغليف الخلايا كاملة والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من المرغوب فيه. في حين أن أحجام صغيرة حبة يمكن أن يؤدي إلى نتوء خلية 48 ، يمكن حبات كبيرة تعيق نشر المواد الغذائية و / أو وظيفة الخلية 35 ، 49 . من ناحية أخرى، توفر عملية الاستحلاب فرصة مثيرة للاهتمام للتحقيق في تأثير حجم حبة على بقاء الخلية بعد زرع من خلال توليد كل من الخرز الصغيرة والكبيرة في عملية واحدة. متوسط ​​حجم حبة يمكن تعديلها بسهولة عن طريق تعديل معدل الإثارة دورينز خطوة الاستحلاب ( الشكل 4 ). وأخيرا، فإن المسامية أعلى من الخرز تبلور داخليا قد يكون أيضا ضارا لالمناعية، حيث الجزيئات مثل الأجسام المضادة والسيتوكينات ينبغي استبعادها من الخرز. ومع ذلك، فإن عملية استحلاب يسمح أيضا جيل حبة من حلول الجينات مركزة جدا، وبالتالي تقليل حجم الجينات حبة المسام.

عملية الاستحلاب والهلام الداخلية هي بديل مثير للاهتمام ل إنكابسولاتورس القائم على فوهة للمختبرات التي ترغب في توسيع التغليف الخلية أو عدم الوصول إلى إنكابسولاتور. هذه العملية هي طريقة قوية وبسيطة لتجميد الخلايا في الخرز الجينات باستخدام مخفف جدا أو تتركز جدا الحلول الجينات. بعض التجارب اللاحقة التي يمكن القيام بها مع الخلايا يجمد هي لتحديد تأثير مصفوفة الجينات على قرارات مصير الخلية، أو لتحديد إلى أي مدى توفر الخرز حاجزا بين ترانسبلانتد، والنظام المناعي المضيف. الاستحلاب وطريقة الهلام الداخلي يوفر نهجا جديدا لتغليف الجزر الابتدائية في دفعات كبيرة. وتسمح هذه الطريقة أيضا بتغليف الخلايا في حبات الجينات ذات التركيز العالي مع مسامية منخفضة، وبالتالي تقليل وصول الأجسام المضادة إلى الخلايا المغلفة. وبالتالي فإن الاستحلاب وطريقة الهلام الداخلي يوفر وسيلة جديدة لتوليد كميات ذات الصلة سريريا من الخلايا العلاجية مغلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

نشكر جيل أوزبورن لعملها الأرض وضع على عملية الاستحلاب ولورين ويلكينسون للحصول على الدعم التقني. نشكر الدكتور إيغور لاسيك، الدكتور تيموثي J. كيفر والدكتور جيمس د. جونسون لإسهاماتهم وتعاونهم. نشكر ديابيت كيبيك، جدرف، ثيسيل، ومركز كوبيكويس سور ليس ماتيريوكس فونكتيونلز (سكمف)، ومجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث (نزيرك)، ومركز زرع جزيرة الإنسان وتجديد خلايا بيتا، وشبكة الخلايا الجذعية الكندية، و ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية، ومؤسسة فوندز كيبيكواز دي لا ريشيرتش سور لا ناتشر إت ليس تيشنولوجيز، و كوست 865 للحصول على الدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade) Sigma A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM Life Technologies 11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin Thermo Fisher Scientific SH3039603
Glutamine Life Technologies 25030
Penicillin and streptomycin Sigma P4333-100ML
HEPES, cell culture tested Sigma H4034-100G
NaCl Thermo Fisher Scientific S271-1
Fine-grain CaCO3 Avantor Materials 1301-01 After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil Thermo Fisher Scientific O121-4 Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid Thermo Fisher Scientific A38-500 Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas Sigma CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm Thermo Fisher Scientific 08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes VWR 14673-043
Toluidine Blue-O Sigma T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks Bellco 1965-00100 The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed Bellco 7760-06005 The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter Innovatis Cedex AS20 This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box Artograph LightPad® PRO This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera Canon PowerShot A590 IS A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters Olympus IX81 Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software Molecular Devices Metamorph A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware CellProfiler Non-applicable A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108, (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50, (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79, (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69, (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47, (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2, (3), E15 (2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52, (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54, (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88, (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11, (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23, (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75, (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3, (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42, (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23, (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63, (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23, (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38, (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43, (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50, (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18, (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311, (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11, (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108, (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39, (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23, (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (10), R100 (2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1, (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40, (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54, (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61, (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10, (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41, (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14, (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33, (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57, (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18, (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244, (3), 500-510 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics