Identifikation af Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Plante intercellulære forbindelser, plasmodesmata (Pd), spiller en central rolle i plante fysiologi og plante-virus interaktioner. Kritisk til Pd transport sortering signaler, der direkte proteiner til Pd. Vores viden om disse sekvenser er imidlertid stadig i sin vorden. Vi beskriver en strategi for at identificere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) er celle til celle-forbindelser, der fungerer som gateways, som små og store molekyler transporteres mellem planteceller. Pd transport af små molekyler, som ioner og vand, antages at forekomme passivt, celle til celle transport af biologiske makromolekyler, sådanne proteiner, højst sandsynligt sker via en aktiv mekanisme, der involverer specifikke målretning signaler på den transporteres molekyle. Knaphed på identificerede plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har stærkt begrænset forståelse af protein-sortering veje involveret i plante celle til celle makromolekylære transport og kommunikation. Fra et væld af plante endogene og virale proteiner kendt trafik gennem Pd, kun tre PLSs er blevet rapporteret til dato, alle dem fra endogene vegetabilske proteiner. Det er således vigtigt at udvikle en pålidelig og systematisk eksperimentelle strategi for at identificere en funktionel PLS sekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for Pd målretning, direkte i levende plante celler. Her beskriver vi en sådan strategi bruge som et paradigme celle-til-celle bevægelse protein (MP) af tobak mosaik virus (TMV). Disse eksperimenter, der identificeret og karakteriseret først plante viral PLS, kan være tilpasset til opdagelsen af PLS sekvenser i mest Pd-målrettet proteiner.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport af centrale regulatorer af plante udvikling og morfogenese, lige fra transkriptionsfaktorer til mRNA og små RNA-molekyler. Desuden, denne makromolekylære transportkapaciteten PD er udnyttet af de fleste plante vira til deres intercellulære udbredelse under infektion; for at flytte gennem Pd, plante virus har udviklet sig specialiserede proteiner, betegnes bevægelse proteiner (MPs), der er specifikt målrettet til Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylære veje af Pd transport sandsynligvis er tæt forbundet med specifikke sekvenser, der er målrettet de transporterede proteiner i disse veje. Identifikation af disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan således diagnosticering af den tilsvarende Pd transport pathway. Dette er analogt Pd transport8, for eksempel, at forskellige nukleare import veje, som kan være specifikke for forskellige nukleare lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Begrebsmæssigt, repræsenterer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellulært målretning sekvenser, der er nødvendige og tilstrækkelige for målretning. Men i modsætning til NLSs11, sekvens oplysninger om PLSs er stærkt begrænset. Specifikt, er kun fire protein sekvenser involveret i Pd målretning blevet rapporteret, med alle dem afledt af endogene vegetabilske proteiner. Den første er repræsenteret af et HOXD domæne KN112 – en transkriptionsfaktor, der flytter fra indre cellelag til epidermis af plante blad13 – og dens KNOX homologs14. Den other sig er også fra en transkriptionsfaktor, Dof, som indeholder en formodede PLS beskrevet som intercellulære handel (IT) motiv15. Den tredje sekvens er fra PDLP1 plasmodesmata-resident type 1 membran protein, og den er repræsenteret ved en transmembrane domæne16. Endelig den fjerde Pd målretning sekvens blev for nylig rapporteret til glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankrede proteiner, og det er repræsenteret ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) ændring signal17.

Interessant, indtil for ganske nylig, ingen PLSs er blevet rapporteret til viral MPs. Tidligere undersøgelser vist tilstedeværelse af formodede PLS sekvenser i anlægget viral MPs18,19, men ingen sand PLS, dvs, en minimal aminosyresekvens, både nødvendige og tilstrækkelige for Pd målretning af en ikke-forretningsmæssigt forbundne cargo molekyle ( fx., fælles fiskeripolitik) er blevet identificeret i en viral MP. Endnu var en af disse proteiner, MP af tobak mosaik virus (TMV), den første, for hvilke Pd lokalisering og transport har været demonstreret20.

For at løse dette hul, udviklede vi en eksperimentel strategi for at identificere TMV MP PLS. Denne strategi byggede på tre begreber. (i) vi defineret PLS som en minimal aminosyresekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for protein målretning til Pd21. (ii) fordi TMV MP første mål Pd og derefter translocates gennem disse kanaler22, sigter vi mod frakobling disse to aktiviteter og at identificere bona fide PLS, der fungerer kun for Pd målretning og ikke for den efterfølgende transport. (iii) vi analyseret de identificerede PLS for aminosyrerester vigtig for dens Pd målrettet aktivitet, uanset om strukturelt eller funktionelt. Brug denne fremgangsmåde, afgrænset vi en 50-amino syre rester sekvens på amino endestation TMV MP, der fungerer som bona fide PLS. Dette blev gjort ved at producere en serie af TMV MP fragmenter, der mættede hele længden af proteinet, tagging deres carboxyl-termini med den fælles fiskeripolitik og forbigående at udtrykke dem i plantevæv. PD lokalisering af hver af de testede fragmenter blev fastsat ved at coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose bindende protein 1)23. Det mindste fragment, der stadig er lokaliseret til Pd, men ikke krydse Pd, blev anset for at repræsentere PLS. Endelig var PLS alanin-scannet til at bestemme de vigtigste aminosyrerester kræves for dens struktur og/eller funktion.

Mens her vi illustrere denne tilgang ved at beskrive identifikation af TMV MP PLS, kan det være ansat til at opdage PLSs i nogen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet af plante patogener eller planterne selv; Dette skyldes, at vores metode ikke drage fordel af eventuelle unikke funktioner af viral parlamentsmedlemmer med hensyn til deres evne til at målrette til Pd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plantematerialet

  1. Valg af plantearter
  2. Bruge native til protein plantearter af interesse, dvs., der koder dette protein for endogene proteiner eller som repræsenterer den naturlige vært for patogen for virale proteiner. Derudover skal de valgte plantearter imødekommenhed over for den valgte metode til forbigående genetiske transformation.
    Bemærk: Undersøgelserne, der rutinemæssigt beskæftiger Nicotiana benthamiana, som repræsenterer en god vært for TMV og omdannes effektivt af Agrobacterium-medieret genetiske transformation teknikken, dvs., agroinfiltration (Se trin 3). N. benthamiana planter også er nemt dyrkes og har store blade, som er let podes af Agrobacterium og let analyseres af Konfokal mikroskopi.
  3. Planternes vækst
    1. Plantefrø N. benthamiana i våd jord med høj tæthed. Holde dem i et kontrolleret miljø kammer på 20-25 ˚C under 16 h af lys på ~ 75 µmol fotoner m-2 s-1 og 8 h af mørket. Efter diameteren af euphyll når 0,5 cm, omhyggeligt overføre udplantningsplanterne til større Potter og fortsat vækst i den samme afdeling på samme betingelser.
    2. Opretholde planterne, indtil de vokser til 4-8-bladstadium inden for 4 uger når de største blade er 4-6 cm i diameter; på dette tidspunkt, de kan bruges til agroinfiltration (Se trin 3).
      Bemærk: Vigtigere, aldrig bruge planter, hvis de begyndte at blomstre da på denne udviklingsstadiet, leaf arkitektur ofte varierer24,25, undertiden fører til inkonsistente resultater.

2. udtrykket vektor konstruktion

  1. Valg af ekspressionssystem
    1. Vælg udtryk system, dvs., vektorer og vektor leveringsmetode, bedst egnet til udtryk for protein af interesse i de plantearter, der er undersøgt.
      Bemærk: Lejlighedsvis, sådanne specifikke kombinationer af testede protein/plantearter kan kræve særlige vektorer og vektor leveringsmetode for optimal udtryk og funktion af proteiner af interesse. For de fleste tokimbladede planter, dog vælge binære plasmider som udtryk vektorer og agroinfiltration som levering system.
  2. Protein fluorescerende tagging
    1. Fluorescently tag hver udtrykt protein for analyse af dens subcellulært distribution22, herunder Pd lokalisering.
      Bemærk: Ansætte autofluorescent proteiner, som den fælles fiskeripolitik og DsRed2, som koder. Tag den testede protein med den fælles fiskeripolitik og coexpress det med en gratis DsRed2. Fælles fiskeripolitik funktioner både som tag og som en virus-relateret cargo molekyle. DsRed2 funktioner at kalibrere samlede effektivitet af flygtige udtryk, og fordi det er celle-selvstændig, til at identificere den oprindeligt transformerede celle; denne sidstnævnte funktion er vigtigt ved vurdering af celle-til-celle bevægelse af potentielt ikke-celle-selvstændige testet proteiner. Coexpression med Pd markør PDCB1, som også er celle-selvstændig, tag den testede protein med den fælles fiskeripolitik og PDCB1 med DsRed2.
    2. Som en tommelfingerregel, fuse autofluorescent tag til carboxyl-endestation på de udtrykte proteiner. Men hvis tagged fuld længde testet protein udstiller kompromitteret Pd målretning, overføre tag til protein amino endestation.
    3. Klon kodning sekvenser af proteiner skal testes i et velegnet plante udtryk vektor.
      Bemærk: Der er mange forskellige plante udtryk vektorer, der giver mulighed for fluorescerende tagging. Vi bruger en række pSAT plasmider26 eller nogle af deres derivater27,28, som er egnet til kloning af rækkefølgen af direkte interesse for rammen med de foreslåede autofluorescent tags (Se trin 2.2.1) i begge amino- og carboxyl-terminal retningslinjer.
    4. Overføre hver udtryk kassette til en Agrobacterium binære vektor.
      Bemærk: Selvom pSAT-baserede konstruktioner er egnet til direkte biolistic levering i plantevæv, agroinfiltration, som er den transformation metode anbefales her (Se trin 3), kræver at udtryk kassette til at være placeret mellem T-DNA grænser for en binær vektor29.
      Bemærk: Alle pSAT vektorer er designet til at tillade sådanne overførsel til pPZP-RCS2 multigene udtryk binary vektor26,30 ved en trinvis kloning ved hjælp af sjældne skæring nukleaser AscI, -PpoI, -SceI, CeuI, PI-PspI og PI-TliI 26. forskere, der foretrækker at udnytte recombinatorial kloning, fxved hjælp af heterolog lox websteder31, kan ansætte pSAT vektor varianter26,27.
    5. For coexpression, overføre begge udtryk kassetter, f.eks., testet protein-FFP og DsRed2 eller testet protein-FFP og PDCB1-DsRed2 (Se trin 2.1), at den samme pPZP-RCS2 binære vektor.
      Bemærk: Alternativt Agrobacterium kulturer husly individuelle binære konstruktioner kan være blandet sammen for infiltration i N. benthamiana (Se trin 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Tilføj 1 µg af en pPZP-RCS2-baserede plasmid fra trin 2.2.5 til 100 µL kultur af kompetente celler af Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101 forberedt som beskrevet32, inkuberes i isbad i 30 min, flash-freeze i flydende kvælstof i 1 minut, og Der inkuberes ved 28 ° C i 15 min.
    1. Derefter tilsættes 1 mL af LB medium (10 g/L trypton, 5 g/L gærekstrakt og 10 g/L NaCl) til kompetente celle blandingen og inkuberes ved 28 ° C i 2 h. Spin ned celler ved 3.000 × g i 1 min, genopslæmmes dem i 0,2 mL af LB , og plade dem på LB-agar suppleres med passende antibiotika (fx, 100 mg/L spectinomycin og 50 mg/L rifampicin for pPZP-RSC2-baserede vektorer26,30). Vokse ved 28 ° C for 48 h før enkelte kolonier er synlige.
  2. Pluk og plade flere enkelte kolonier på en frisk LB-agar plade (Se trin 3.1), vokser ved 28 ° C for 48 h, og tage en lille mængde af bakterier til analyse af kolonien PCR33 at bekræfte tilstedeværelsen af de specifikke binære konstruktioner.
  3. Vokse hver Agrobacterium koloni med konstruktionen af interesse overnatning på 28 ° C i 5 mL af LB medium suppleres med passende antibiotika (Se trin 3.1.1). Centrifugeres celler på 3.000 × g, og genopslæmmes dem til OD600= 0,5 i agroinfiltration buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone). Der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
    1. Hvis du bruger en blanding af binære plasmider snarere end en enkelt multigene udtryk plasmid for protein coexpression, Bland de tilsvarende cellekulturer på 1:1 v/v forhold før infiltration. Derefter inkuberes celler ved 28 ° C i 2 timer.
  4. Indlæse inokulat i en 1 mL plastik sprøjten og trykke på dysen af sprøjte (uden nål) mod lavere (abaxial) epidermis af den fuldt modne N. benthamiana blade. Hold blade med en behandsket finger på adaxial ansigt34,35.
    1. Indføre Agrobacterium i infiltration medium ved langsom injektion. Statistisk signifikans, infiltrere adskillige blade på hver plante.
      Bemærk: Bemærk, at de ældste blade ikke anvendes som de ikke give konsekvente udtryk niveauer.
    2. Podes alle blade in situ. Vedligeholde anlægget infiltreret indtil observation, som beskrevet i trin 1.2.

4. konfokalmikroskopi

  1. Brug en kniv til at skære hvert blad i fragmenter mellem venerne 24-48 timer efter infiltration, (afhængigt af effektiviteten af forbigående udtryk for den specifikke testet protein); størrelsen af hver væv skive bør være sådan, at udsnittet er helt dækket af dækslet glas (22 mm x 40 mm) bruges til mikroskopi.
  2. Leaf skiver på objektet skub med abaxial bladets overflade vender opad, placere en dråbe vand på blad skive og dække det med dækslet glas. Immobilisere cover glas med små stykker tape på hver side.
  3. Observere agroinfiltrated væv under en laser scanning Konfokal mikroskop og registrere de fremkomne billeder.
    1. Først, bruge en 10 X mål linse for at identificere celler med signalet, og derefter bruge 63 x mål linse for mere detaljerede observationer.
    2. Brug 458 nm bølgelængde fra en argon ion laser til at ophidse den fælles fiskeripolitik og 543 nm til at vække DsRed2. Bevare alle indstillinger for billede erhvervelse, dvs, laser intensitet og photomultiplier tube (PMT) indstillinger, mellem eksperimenter. I gennemsnit undersøge 100-120 celler for hver eksperimentelle betingelse.

5. identifikation af PLS

  1. Diagnosticere lokaliseringen af de testede protein ved hjælp af Konfokal mikroskop (afsnit 4). Kontrollere, om den testede protein har den karakteristiske perifere punktformet mønster25,36,37,38,39,40,41 og colocalizes med Pd markør PDCB123. Dette indikerer, at den testede protein sandsynligvis indeholder PLS sekvenser.
  2. Efter bekræftelse af testede protein, PLS aktivitet gradvis underinddele åben læsning rammen (ORF) (genbank stammesamlingsnummer BAF93925.1) i mindre fragmenter, autofluorescently, (f.eks.fælles fiskeripolitik) tag hver af dem og analysere deres subcellulært lokalisering som beskrevet i trin 4. I første omgang, anbefales størrelsen af 100 aminosyrerester for hver opdelt fragment.
  3. Yderligere Underinddel afkortet fragmenter, som PLS aktivitet og kontrollere deres subcellulært lokalisering, som beskrevet i trin 4 indtil det mindste fragment, der stadig lokaliserer til Pd, er dvs tilstrækkelig til at transportere autofluorescent tag gods til Pd, er identificeret. Dette fragment formodes at repræsentere PLS sekvens.
  4. Slet den formodede PLS fra fuld længde testet protein, dvs fuse den resterende del af testen protein uden formodede PLS til autofluorescent tag, og bestemme subcellulært lokaliseringen af de resulterende mutant protein som beskrevet i trin 4. Hvis denne mutant protein, som mangler den formodede PLS undlader at lokalisere til Pd, vil dette indikere, at de identificerede PLS ikke er kun tilstrækkelig (Se trin 5.3), men også nødvendige for Pd transport af de testede protein.
  5. Agroinfiltrate blade med en blanding af Agrobacterium kulturer husly udtrykket konstruere for den fælles fiskeripolitik-tagged PLS og gratis DsRed2 (Se trin 3.3). Observere infiltreret væv ved hjælp af Konfokal mikroskop med objektive linse af 10 x ved hjælp af de samme indstillinger som i trin 4.3.
  6. Score celler, der indeholder både den fælles fiskeripolitik og DsRed2 signaler som oprindeligt infiltreret celler, og score de tilstødende celler, der indeholdt kun fælles fiskeripolitik signal som dem, der udstiller bevægelse.
    Bemærk: Dette trin undersøger de identificerede PLS for dens potentielle celle-til-celle bevægelse evne; Dette er fordi mange proteiner, der er målrettet Pd (herunder de fleste plante viral MPs) også flytte gennem Pd til de tilstødende celler. Koncentrationen af Agrobacterium bruges til infiltration afhænger udtryk effektiviteten af forskellige strukturer henholdsvis. For agroinfiltration, Sørg for at bruge celle kultur fortynding, der sikrer a omdannelse af enkelt celler, forlader de tilstødende celler, untransformed, (ii) opnår lignende effektivitet af udtryk. For eksempel udnytte vores eksperimenter OD600 af 0,01 og 0,005 for udtryk for den fælles fiskeripolitik-tagged PLS og gratis DsRed2, henholdsvis.

6. identifikation af nøglen PLS restkoncentrationer ved hjælp af alanin Scanning42

  1. Brug standard PCR-protokoller til at forstærke PLS kodende sekvens ansætte et par af primere konstrueret til at indeholde ønskede mutation, dvs., substitution af mål af aminosyrer rest med alanin, omkring den centrale region af hver primer som beskrevet 21. udføre primer design og brug af site-directed mutagenese kit for site-directed mutagenese ifølge producentens anvisninger.
  2. Rense de resulterende PCR produkter ved hjælp af enhver standard DNA rensning kit, og fordøje dem ved 37 ° C med DpnI at fjerne forældreorganismen (dvs.ikke-muteret) methylerede og hemimethylated DNA. Køle det ned i 5 min. ved stuetemperatur (ikke på is). Derefter omdanne blandingen direkte til E. coli kompetente celler43, og identificere kolonier med de ønskede mutant konstruktioner, som beskrevet i trin 3.2.
  3. Indføre mutant-konstruktioner i den binære vektor, som beskrevet i trin 2.2.4, udføre agroinfiltration som beskrevet i trin 3, og vurdere Pd målretning som beskrevet i trin 4 og 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative data, som trofast illustrerer resultaterne forventes fra de beskrevne protokoller og identificere TMV MP PLS, er tilpasset fra Yuan et al. 21. figur 1A først opsummerer store konstruktioner at udtrykke den fuld længde TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestående af de første 50 aminosyrerester protein, 1-50), og dens alanin scanning V4A derivater smeltet til den fælles fiskeripolitik (genereres som beskrevet i trin 2.2, 5.2 og 6) figur 1B opsummerer og kvantificerer subcellulært lokaliseringen af disse tagged proteiner. Figur 1 c viser de karakteristiske perifere punktformet Pd lokalisering mønstre observeret for TMV MP-den fælles fiskeripolitik og for TMV MP PLS-fælles fiskeripolitik såvel som for den coexpressed Pd markør, PDCB1-DsRed2 (Se trin 5.1). Figur 2A illustrerer Pd målretning af TMV MP-den fælles fiskeripolitik og for TMV MP PLS-den fælles fiskeripolitik og nucleocytoplasmic fordeling af coexpressed gratis DeRed2 (Se trin 5.1). Endelig, figur 2B viser tabet af Pd målretning af både TMV MP og TMV MP PLS med en enkelt alanin substitution V4A, der angiver, at denne rest er vigtigt for PLS struktur eller funktion; i de samme celler coexpressed Pd markør PDCB1 stadig lokaliserer til Pd (Se trin 6).

Disse data viser, at denne konceptuelt og teknisk enkel procedure for systematisk produktion af protein fragmenter, deres fusion til en autofluorescent markør-cargo protein og testning for evnen til at lokalisere til Pd kan identificere en minimal protein sekvens nødvendige og tilstrækkelige for Pd målretning, dvs, PLS. For korrekt fortolkning af disse lokalisering data, er det kritisk at udføre colocalization eksperimenter med en kendt Pd protein, fx, TROLDERI eller PDCB familiemedlemmer16,23 eller en af planten viral MPs, at sortere til Pd44 . Colocalization har naturligvis ikke fuldføres, da ikke alle P-lokalisering proteiner kan være målrettet mod de samme Pd, men en statistisk signifikant grad af colocalization med mindst en af Pd markør proteiner er nødvendige for at definere PLS aktivitet.

Figure 1
Figur 1: identifikation af TMV MP PLS. (A) oversigt over vigtigste fælles fiskeripolitik-fusion konstruktioner bruges til at identificere TMV MP PLS. TMV MP sekvenser, grønne kasser; Fælles fiskeripolitik, blå kasser; Pedersen, promotor; T, terminator. Tal til venstre angiver aminosyrerester inkluderet i hver TMV MP fragment. (B) oversigt over subcellulært lokalisering af fusion proteiner vist i (A). PD lokalisering eller nucleocytoplasmic lokalisering var fast besluttet på baseret på lokalisering af de tilsvarende subcellulært markører, PDCB1-DsRed2 og gratis DsRed2, henholdsvis. Procentdelen af celler udstiller hver lokalisering mønster er vist baseret på scoring 100 udtrykker celler pr. konstruktion i tre uafhængige forsøg. Data er gennemsnit ± standardfejl (SE). (C) Pd målretning af TMV MP-fælles fiskeripolitik, TMV MP PLS-den fælles fiskeripolitik og Pd markør PDCB1-DsRed2. Fælles fiskeripolitik signal er i blå; DsRed2 signal er i lilla; plastid autofluorescence blev filtreret ud. Billeder er enkelt Konfokal sektioner. Skalere barer = 10 µm. DIC, Differential interferens kontrast Mikrograf. Dette tal er tilpasset fra Yuan et al. 21. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Pd målretning af TMV MP, TMV MP PLS og deres alanin-scanning mutanter. (A) subcellulært lokalisering af TMV MP-fælles fiskeripolitik, TMV MP PLS-den fælles fiskeripolitik og nucleocytoplasmic markøren DsRed2. (B) tab af Pd målretning evne til V4A alanin-scanning mutanter af TMV MP-fælles fiskeripolitik og TMV MP PLS-den fælles fiskeripolitik. PD blev visualiseret ved coexpression af Pd markør PDCB1-DsRed2. Fælles fiskeripolitik signal er i blå; DsRed2 signal er i lilla; plastid autofluorescence blev filtreret ud. Billeder er enkelt Konfokal sektioner. Skalere barer = 10 µm. DIC, Differential interferens kontrast Mikrograf. Dette tal er tilpasset fra Yuan et al. 21. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol har fire centrale bestanddele: koncept for at identificere en sekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for målretning til Pd, systematisk inddeling af protein af interesse i fragmenter, der er gradvist reduceret i længden, fusing de testede brudstykker til en autofluorescent protein, der fungerer både som tag og som makromolekylære last og funktionelle assay for Pd målretning i levende plante væv efter forbigående udtryk for de testede fusion proteiner. Bemærk at Agrobacterium-medieret forbigående udtrykket genererer data inden for en relativt kort periode af tid, dvs., flere dage i forhold til måneder kræves til produktion af transgene planter, som ofte anvendes i lignende undersøgelser15.

Coexpression af protein af interesse med subcellulært lokalisering markører, fxPDCB1 eller gratis DsRed2, normalt udføres fra et multigene udtryk vektor. Men hvis overførslen af flere udtryk kassetter til en enkelt vektor er teknisk problematisk, coexpression kan også udføres ved at overføre hver kassette i en separat binær konstruktion og kombinere tilsvarende mængder af flydende kulturer i den resulterende Agrobacterium stammer for agroinfiltration. Fordi denne protokol udnytter forbigående udtryk, behøver den binære vektor ikke bære udvalg markører for stabil transformation, selv om deres tilstedeværelse ikke er skadelig for udtryk effektivitet.

Denne protokol er optimeret til protein udtryk og målretning i N. benthamiana; Det kan dog anvendes i andre plantearter, herunder Arabidopsis45,46, imødekommenhed over for genetiske transformation af Agrobacterium. For andre plantearter, eller hvis det ellers ønskes, denne protokol kan tilpasses til at udnytte biolistic levering41 for forbigående udtryk direkte fra pSAT-baserede vektorer, undgå behovet for at overføre udtryk kassetter til binære vektorer.

Et kritisk punkt i denne protokol er den konsekvente fysiologiske og udviklingsmæssige tilstand af plantematerialet. Specifikt, alle planter skal være sund gennem hele forsøget, og for agroinfiltration, N. benthamiana planter skal være mindre end 4-uger gammel og på 4-8-blad scenen med de største blade bliver 4-6 cm i diameter. Hvis planterne er for ung, bliver virkningerne af agroinfiltration for svær, forstyrrer udtryk og lokalisering af de mærkede proteiner. På den anden side udviser de ældre planter ofte en variabel arkitektur af Pd24,25, også påvirker sammenhængen i Pd-targeting mønstre.

Stadig, på grund af varierende fysiologiske forhold af anlægget som helhed og af dens transformerede celler i særdeleshed, effektiviteten af Pd målretning i hvert eksperiment kan noget variere. Det er således vigtigt at analysere et relativt stort antal celler (> 100) pr. eksperiment, og udføre mindst tre biologiske replikater af hvert forsøg. Generelt, mener vi et testet fragment indeholder Pd målrettet aktivitet, hvis det udviser Pd lokalisering i mindst 70% af de transformerede celler. Forskelle i Pd målretning effektiviteten af hver fragment, fx, procent af transformerede celler viser Pd-specifikke punktformet ophobning mønster, bør analyseres af Student's t-test, og p-værdier < 0,05-0,01, svarende til den statistiske sandsynlighed på mere end 95-99%.

Et andet vigtigt spørgsmål er placeringen af det fluorescerende tag og gods i fusion molekyle. Nogle Pd-målrettet proteiner også knytte til det endoplasmatiske reticulum (ER), og denne forening kan kræve uhindret amino-terminal sekvensen. I disse tilfælde, amino-terminal fusioner, hvori carboxyl-terminus af protein fragment af interesse er smeltet til amino endestation for fluorescerende-tag bør f.eks.den fælles fiskeripolitik eller DsRed2, anvendes. Denne standard placeringen af koden kan ændres i de følgende tilfælde. a hvis amino-terminal fusioner ikke er brugbar – dvs., de gør ikke udstille meningsfuld subcellulært lokalisering mønstre, er dårligt udtrykt eller ikke generere fluorescerende signal nok for pålidelig detektion – og hvis protein af interesse indeholder ikke amino-terminal signal sekvenser eller carboxyl-terminal fusioner, hvor de testede fragment amino endestation er smeltet til carboxyl-terminus af tag, de bør forsøges. (ii) de carboxyl-terminal fusions bør også anvendes hvis protein af interesse indeholder signal sekvenser på sin carboxyl-terminus. (iii) Hvis protein af interesse har begge amino - og carboxyl-terminale signaler, som dem der findes i GPI-forankrede proteiner, ikke eller hvis det indeholder en amino-terminal signal peptid endnu sine amino-terminal fusion brugbar, skal tag være placeret internt,) enten nedstrøms i amino-terminal signal eller opstrøms af signalet fra carboxyl-terminal). Nogle nyttige procedurer for interne fluorescerende tagging af proteiner er beskrevet i vores tidligere publikationer47,48.

I øjeblikket er der ingen kendte konsensus sekvens for PLS. Som sådan (i trin 5.2) anbefaler vi, i første omgang inddele proteinet i sammenhængende ~100-200 rest-lange fragmenter. Disse kan derefter ske gradvis kortere baseret på den observerede Pd-targeting aktivitet eller manglen på samme. Man skal være opmærksom på andre potentiale målretning signaler i protein (fxNLS, signal peptider, osv.). Som den potentielle overlapning af sådanne sekvenser med PLS sekvenser er ukendt, bør disse protein regioner inkluderes i denne mutationsmønstre analyse.

Hidtil har blev denne protokol brugt til at identificere en enkelt PLS i et protein molekyle21. Potentielt, men kan et protein indeholde mere end én signal sekvens; jo flere NLSs har været beskrevet i mange nukleare proteiner, herunder GATA transskription faktorer49. Når du analyserer forskellige fragmenter af de testede protein for Pd målretning, er det således muligt, at mere end én sådan fragment vil identificeres, med angivelse af tilstedeværelsen af flere PLSs, som kan optræde selvstændigt eller synergistisk.

Den største begrænsning af denne protokol er at følge agroinfiltration, visualisering af subcellulært lokalisering af forbigående udtrykte proteiner af interesse opnås bedst i epidermale celler og på relativt smalle vækststadium. Når det er nødvendigt, kan denne begrænsning overvindes ved at producere transgene planter, som stabilt udtrykker hver af de testede proteiner i de fleste af deres væv og celletyper. Også, ville denne protokol ikke være nyttigt for studier af viral MPs eller andre Pd-målrettet proteiner, der fungerer kun i planter arter, der ikke er indstillet til forbigående genetiske transformation.

Mens vi udviklet denne teknik til identifikation af en PLS TMV MP, kan det bruges, for opdagelsen af PLSs i enhver anden plante viral MPs eller i vegetabilske endogene proteiner, at Lokaliser til Pd, forbigående eller permanent. Desuden, hvis kombineret med passende subcellulært lokalisering markører47, denne protokol er egnet til identifikation af mange andre målretning signaler inden for proteiner af interesse i planter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

For manglen plads, vi citerede det meste review artikler, og vi undskylde over for vores kolleger, hvis oprindelige arbejde ikke blev nævnt. Arbejde i V.C. laboratorium understøttes af tilskud fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C., og S.G.L. laboratoriet understøttes af NIH og midler fra afdelinger for Plantepatologi og plante-mikrobe biologi til S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics