Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

O objetivo geral do isolamento da microglia magnética CD11b é alcançar um rendimento final de alta pureza da microglia pós-natal em um período de tempo relativamente curto para fins de experimentação in vitro versátil. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como os mecanismos de sinalização pertinentes à inflamação neural. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos atualmente disponíveis é que o isolamento leva aproximadamente 30 minutos, sem sacrificar a pureza, o rendimento ou a viabilidade.

Comece transferindo cabeças recém-decapitadas de filhotes de camundongos de um a dois dias de idade para uma coifa de fluxo de ar laminar. Em seguida, use uma tesoura de microdissecação reta de 4,5 polegadas para fazer uma pequena incisão no crânio e nas meninges, inserindo as pontas na abertura formada pela decapitação e cortando caudal ao rostral. Depois de fazer a incisão, descasque um dos hemisférios para o lado.

Em seguida, use uma pinça curva ou em forma de gancho para remover todo o cérebro. Transfira o cérebro para um tubo de 50 mililitros contendo dois mililitros de 0,25% de tripsina EDTA e incube por 15 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Lave o cérebro com meio de crescimento fresco, adicionando e removendo o meio.

Após a conclusão das lavagens, adicione dois mililitros de meio de crescimento por cérebro e homogeneize triturando o cérebro. Quando o tecido cerebral não diminuir, faça a transição para uma pipeta com uma abertura menor. No final da trituração, quando a suspensão estiver límpida, sem pedaços visíveis, passe a suspensão por um filtro de células de 70 mícrons para criar uma única cultura de células.

Em seguida, pipete de oito a nove mililitros de meio de crescimento em frascos T75, dois frascos por cérebro, e adicione mililitros de homogeneizado cerebral a cada frasco. Cultive as células até o isolamento no décimo sexto dia. Após dezesseis dias, transferir o meio de cultura do frasco para um novo tubo de 50 mililitros.

Adicione três mililitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada frasco T75. Em seguida, agitar os frascos durante cinco minutos à temperatura ambiente num agitador orbital. Centrifugue o meio de cultura a 0,4 vezes g por cinco minutos.

Depois de agitar por cinco minutos, adicione um mínimo de quatro mililitros do meio de cultura centrifugado para interromper a reação de tripsina EDTA e triture para garantir que todas as células tenham sido destacadas. Em seguida, passe as células por um filtro de células de 70 micromolares para criar uma única cultura de células. Execute uma contagem de células e, em seguida, gire para baixo a 0,4 vezes g por cinco minutos.

Em seguida, pegue um tubo de poliestireno de cinco mililitros, adicione um mililitro do meio recomendado e marque o menisco. Adicione o meio recomendado de até 2,5 mililitros e marque este menisco também. Em seguida, remova o meio e ressuspenda o pellet em 500 microlitros do meio recomendado.

Transfira esta mistura para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e, em seguida, dilua até a marca de um mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de soro de rato para cada mililitro de células suspensas e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, prepare o coquetel de seleção misturando 25 microlitros do componente A e 25 microlitros do componente B. Decorridos os cinco minutos, adicione 50 microlitros do coquetel de seleção às células e incube por mais cinco minutos em temperatura ambiente.

Vortex as microesferas por 45 segundos. Em seguida, adicione 80 microlitros de microesferas por mililitro de amostra e incube por três minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione o meio recomendado até a marca de 2,5 mililitros no tubo de poliestireno.

Coloque o tubo no suporte magnético por três minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, despeje lentamente o meio em um tubo de poliestireno de 15 mililitros ainda no ímã. Repita a separação magnética mais três vezes, cada vez adicionando o meio recomendado até a marca de 2,5 mililitros.

Após a última separação magnética, adicione três mililitros de meio de crescimento e conte o número de células usando um contador de células. Coloque as células em placas revestidas de poli-D-lisina para tratamentos. Plaquear a fração negativa do tubo de 15 mililitros, que contém principalmente astrócitos, em balões T75.

Após pelo menos seis horas de incubação em uma incubadora de 37 graus Celsius, recoloque todo o meio de crescimento nos frascos contendo a fração negativa antes de retornar à incubadora. Esta imagem mostra a imunocitoquímica de uma cultura microglial isolada sondada para AIB, um marcador de microglia no canal verde, e GFAP, um marcador de astrócitos, no canal vermelho. A coloração de Hoechst revela a presença de núcleos celulares.

A ausência de células GFAP-positivas demonstra que a microglia isolada usando o kit de seleção positiva CD11b também tem alta pureza. Essas proteínas imunoblotadas de uma cultura microglial isolada foram sondadas para GFAP, que aparece como uma banda de aproximadamente 51 kilodalton, e IBA1, que aparece como uma banda de aproximadamente 15 kilodalton. A beta-actina foi usada como controle de carga e aparece em aproximadamente 42 quilodaltons.

Um problema com o antigo kit de isolamento era que a fluorescência do PE podia ser observada no canal vermelho, como visto aqui. O procedimento modificado não produz nenhuma autofluorescência das esferas magnéticas, como visto no canal vermelho aqui. A microglia isolada usando este procedimento pode ser usada para estudos de sinalização.

A análise de Western blot mostra que Fyn e fosfo-src tirosina Y416 podem ser detectados a partir de microglia isolada com nosso método recém-refinado. A fração negativa da separação microglial contém astrócitos que podem ser usados para estudos de sinalização. O Western blotting mostra que a fração negativa contém células positivas para GFAP.

A análise de Western blot mostra que Fyn e fosfo-src tirosina Y416 podem ser detectados nas células GFAP-positivas. Após esse procedimento, outros métodos, como microscopia de fluorescência multicanal, western blotting e PCR quantitativo, podem ser realizados para responder a perguntas sobre expressão gênica e sinalização de proteínas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como utilizar essa técnica de isolamento rápido para fins de experimentação microglial.