इलेक्ट्रिकल उत्तेजना का उपयोग करने वाले बायोवायर में मानव स्टेम कोशिका-व्युत्पन्न कार्डिय्योमायसाइट्स का परिपक्वता

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Developmental Biology

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Summary

हृदय biowire मंच एक इन विट्रो बिजली की उत्तेजना के साथ तीन आयामी सेल खेती के संयोजन के द्वारा मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hPSC-मुख्यमंत्री) परिपक्व करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है। यह पांडुलिपि हृदय biowire मंच की विस्तृत सेटअप प्रस्तुत करता है।

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Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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Abstract

मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hPSC मुख्यमंत्रियों) एक होनहार सेल स्रोत रहे हैं और इस प्रकार हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में अपनी क्षमता अनुप्रयोगों, दवाओं की खोज, रोग मॉडलिंग, ऊतक इंजीनियरिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा सहित की जांच प्रोत्साहित किया है। हालांकि, मौजूदा प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित कोशिकाओं देशी वयस्क निलय cardiomyocytes के साथ तुलना में अपरिपक्वता की एक श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं। कई प्रयासों hPSC मुख्यमंत्रियों को परिपक्व होने में, केवल मध्यम अब तक प्राप्त कर ली परिपक्वता के साथ बनाया गया है। इसलिए, एक इंजीनियर प्रणाली, biowire कहा जाता है, इन विट्रो में एक अधिक परिपक्व अवस्था में hPSC मुख्यमंत्रियों नेतृत्व करने के लिए दोनों शारीरिक और बिजली के संकेत उपलब्ध कराने के द्वारा तैयार किया गया है। प्रणाली कोलेजन प्रकार मैं एक कठोर टेम्पलेट टांका गठबंधन हृदय ऊतक (biowire), जो एक उत्तरोत्तर बढ़ती आवृत्ति के साथ बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के अधीन है में इकट्ठा करने के लिए अपने साथ जेल में hPSC मुख्यमंत्रियों बीज के एक microfabricated मंच का उपयोग करता है। nonstimulated नियंत्रण की तुलना में,उत्तेजित biowired cardiomyocytes संरचनात्मक और electrophysiological परिपक्वता का एक उन्नत डिग्री दिखा रहे हैं। इस तरह के बदलाव उत्तेजना दर पर निर्भर होते हैं। यह पांडुलिपि डिजाइन और biowires के निर्माण के बारे में विस्तार से वर्णन करता है।

Introduction

सेल आधारित चिकित्सा सबसे होनहार और जांच की रणनीतियों हृदय की मरम्मत / उत्थान को प्राप्त करने से एक है। यह हृदय ऊतक इंजीनियरिंग और biomaterials 1, 2 के सह वितरण द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है। अधिकांश उपलब्ध सेल सूत्रों क्षतिग्रस्त, रोगग्रस्त, या आयु वर्ग के दिलों 3 पर उनकी संभावित लाभदायक प्रभाव के लिए पशु मॉडल में अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से, महत्वपूर्ण प्रयास मानव pluripotent स्टेम सेल का प्रयोग किया गया है (hPSC) cardiomyocytes (hPSC-मुख्यमंत्री), हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक संभावित असीमित ऑटोलॉगस सेल स्रोत व्युत्पन्न। hPSC मुख्यमंत्रियों कई स्थापित प्रोटोकॉल 4, 5, 6 का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता। हालांकि, प्राप्त कोशिकाओं भ्रूण की तरह समलक्षणियों, अपरिपक्व विशेषताओं में से एक सीमा के साथ वयस्क निलय cardiomyocytes 7 की तुलना में प्रदर्शित करते हैं, 8। यह दवाओं की खोज अनुसंधान के क्षेत्र में और वयस्क हृदय रोग मॉडल 9 के विकास में वयस्क हृदय के ऊतकों के मॉडल के रूप में hPSC मुख्यमंत्रियों के आवेदन के लिए एक बाधा हो सकती है।

आदेश प्ररूपी अपरिपक्वता की इस सीमा को पार करने के लिए, नए तरीकों को सक्रिय रूप से cardiomyocyte परिपक्वता को बढ़ावा देने के जांच की गई है। प्रारंभिक अध्ययन चक्रीय यांत्रिक 10 या बिजली की उत्तेजना 11 के माध्यम से नवजात चूहे cardiomyocytes में प्रभावी समर्थक परिपक्वता गुण का पता चला। जेल संघनन और चक्रीय यांत्रिक उत्तेजना भी hPSC-मुख्यमंत्री परिपक्वता 12, 13, electrophysiological और कैल्शियम से निपटने गुणों की कम से कम वृद्धि के साथ के कुछ पहलुओं को बेहतर बनाने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, एक मंच प्रणाली "जैविक तार" (biowire) कहा जाता है दोनों संरचनात्मक संकेतों और बिजली के क्षेत्र stimulatio प्रदान करके तैयार किया गया थाn hPSC मुख्यमंत्रियों 14 वर्ष की परिपक्वता बढ़ाने के लिए। इस प्रणाली गठबंधन हृदय ऊतक कि बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के लिए उत्तरदायी है बनाने के लिए एक microfabricated मंच का उपयोग करता है। यह hPSC मुख्यमंत्रियों के संरचनात्मक और electrophysiological परिपक्वता सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यहाँ, हम इस तरह के biowires बनाने के विवरण का वर्णन।

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Protocol

1. मास्टर डिजाइन और निर्माण

ध्यान दें: डिवाइस फेब्रिकेशन के लिए नरम लिथोग्राफी का प्रयोग करें। polydimethylsiloxane (PDMS) मोल्डिंग के लिए एक दो परत SU-8 मास्टर करें।

  1. डिवाइस (बाएं चित्रा 1 ए,) एक डिजाइन का उपयोग और सॉफ्टवेयर का मसौदा तैयार करने के लिए डिजाइन। अलग से मास्टर के प्रत्येक स्तर ड्रा। 20,000 डीपीआई से कम दो photomasks पर डिवाइस डिजाइन प्रिंट, मास्टर 15 की दो परतों के लिए इसी। पारदर्शी के रूप में डिवाइस पैटर्न और अंधेरे के रूप में आसपास के क्षेत्र सेट करें; मास्क (के रूप में दूसरों 15 द्वारा वर्णित) ऑप्टिकली डिवाइस पैटर्न SU-8 पर लिथोग्राफी द्वारा हस्तांतरण करने के लिए टेम्पलेट के रूप में काम करेगा।
  2. एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर के केंद्र पर SU-8 50 के बारे में 4 एमएल बांटना। कोट SU-8 50 समान रूप से वेफर 30 s के लिए प्रति मिनट (आरपीएम) 2,000 क्रांतियों पर कताई द्वारा एक स्पिन coater के प्रयोग पर। 10 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस hotplate पर वेफर बेक। पराबैंगनी (यूवी) ली को वेफर बेनकाब200 एमजे पर GHT / सेमी 2।
  3. 30 s के लिए 2,500 आरपीएम पर वेफर और स्पिन के केंद्र पर SU-8 2050 की लगभग 4 एमएल डालो। 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस hotplate पर बेक। कमरे के तापमान (आर टी) के लिए कूल।
  4. दोहराएँ कदम 1.3 दो बार।
  5. पहली परत पारदर्शिता photomask के साथ लेपित वेफर कवर। 270 MJ / 2 सेमी पर पराबैंगनी प्रकाश को वेफर बेनकाब पहली परत बनाने के लिए। 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस hotplate पर बेक।
  6. कदम 1.3 दो बार दोहराते हुए SU-8 2050 की दूसरी परत बनाओ।
  7. पहली परत एक मुखौटा aligner का उपयोग करने पर सुविधाओं के लिए दूसरी लेयर मास्क संरेखित करें। फिर, 240 MJ / सेमी 2 पर पराबैंगनी प्रकाश को बेनकाब। 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बेक।
    नोट: जोखिम समय की आवश्यकता कुल यूवी खुराक और पराबैंगनी प्रकाश उत्पादन तीव्रता दिन उपयोग करने से पहले पर मापा से निर्धारित होता है।
  8. प्रोपलीन ग्लाइकोल monomethyl ईथर एसीटेट (PGMEA) में यह जलमग्न और एक कक्षीय शेकर पर 30 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर मिलाने से वेफर का विकास करना।
  9. जगहवेफर के केंद्र पर: एक पेट्री डिश में मास्टर और ध्यान (1 वजन से 10 के अनुपात में crosslinker के लिए आधार) PDMS मिश्रण डालना। सभी सुविधाएं शामिल होंगी और हवा के बुलबुले से बचें।
  10. 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में हीट। एक तेज ब्लेड का प्रयोग करें PDMS biowire टेम्पलेट के किनारे (चित्रा 1 ए, दाएं) के आसपास कटौती करने के लिए। मास्टर से PDMS छील। ब्लेड के साथ डिवाइस ट्रिम। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक नसबंदी थैली और भाप आटोक्लेव में PDMS biowire टेम्पलेट रखो।
  11. एक बायोसेफ्टी कैबिनेट (BSC) में, एक पेट्री डिश में टेम्पलेट biowire PDMS जगह। चिमटी का प्रयोग करें पकड़ और चैनल (चित्रा 1 बी आई) के दोनों सिरों पर खांचे में यह बैठने द्वारा PDMS microwell के चैनल के केंद्र में बाँझ सर्जिकल रेशम टांके (6-0) का एक टुकड़ा माउंट करने के लिए।

2. विद्युत उत्तेजना चैंबर का निर्माण

  1. 2 सेमी x: आयताकार पॉलीकार्बोनेट टुकड़े (लम्बाई x चौड़ाई x मोटाई की एक जोड़ी बनाने0.85 सेमी x 0.35 सेमी) और उन्हें बिजली उत्तेजना कक्ष ( चित्रा 2 ) के फ्रेम के रूप में उपयोग करें।
  2. प्रत्येक पॉली कार्बोनेट फ़्रेम टुकड़ा के केंद्र रेखा के साथ 2 सेमी चौड़ा 2 सेमी चौड़ा ड्रिल करें।
  3. 1.5 सेंटीमीटर लंबे कार्बन रॉड के दो टुकड़े को काटें। अंत से 3 मिमी के बारे में कार्बन रॉड के माध्यम से 1 मिमी चौड़ा छेद ड्रिल करें। कार्बन रॉड छेद के माध्यम से एक प्लैटिनम तार थ्रेड करें और कार्बन रॉड के चारों ओर लपेटकर वायर को कस लें। बिजली उत्तेजक औधधि के साथ बाद में कनेक्शन के लिए प्लैटिनम तार के दूसरे छोर पर क्लिप संलग्न करें।
  4. पॉली कार्बोनेट फ़्रेम के टुकड़ों में कार्बन रॉड डालें। एक छः-अच्छी तरह से थाली के एक कण में कार्बन छड़ के साथ इकट्ठे फ़्रेम रखें।
  5. अच्छी तरह से पीडीएमएस के 2 एमएल डालो पीडीएमएस में पॉलीकार्बोनेट फ़्रेमों के निचले हिस्से को कम करते हुए पीडीएमएस सतह के स्तर को बंद रखते हुए कार्बन छड़ के नीचे तक नहीं पहुंचते हैं। 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में गर्मी
  6. छः से बिजली उत्तेजना कक्ष ले लो-वहाँ अच्छी तरह से प्लेट और इसे 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर भाप नसबंदी के लिए एक नसबंदी पाउच में डाल दिया

3. एचपीएससी-सीएम के एनजीमाईक डिस्संसेशन

  1. एचपीएससी को एक स्थापित प्रोटोकॉल 4 का उपयोग करके कार्डियोमोसाइट्स में अंतर करना प्रेरित करें
    नोट: संक्षेप में, अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4, बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक, सक्रियण ए, संवहनी endothelial वृद्धि कारक, और डिकोकॉफ़ homolog 1 4 के साथ अनुक्रमिक पूरक के माध्यम से स्टेम समर्थक माध्यम में स्थापित भ्रूण निकाय (ईबी) प्रोटोकॉल के माध्यम से कार्डियोमोसाइट्स उत्पन्न करते हैं। बायोयर्स बनाने के लिए 20 से 34 दिनों के अंतर से ईबी का उपयोग करें।
  2. पी 1,000 विंदुक टिप के साथ कम लगाव प्लेट से ईबीएस ले लीजिए और एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली 125 xg और आरटी। सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और पूर्व गर्म, 37 डिग्री सेल्सियस कोलेजनज प्रकार में 1% डीओक्सीबैनेयुलीज आई (डीएनसी आई) युक्त गोली को फिर से खोलें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैंपाचन के लिए।
  3. पूर्व गरम, 37 डिग्री सेल्सियस के 5 एमएल जोड़ें 125 XG पर और आरटी पर 5 मिनट के लिए मध्यम और अपकेंद्रित्र धोएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ट्रिप्सिन / ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान के 2 एमएल के साथ गोली Resuspend और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 3% से युक्त रोक माध्यम के 1 एमएल जोड़ें (v / v) DNase मैं
  5. एक 5 एमएल सिरिंज करने के लिए एक 20 जी (0.9 मिमी) सुई संलग्न करें और 3-5 गुना के माध्यम से यह ईबी निलंबन गुजरती हैं।
  6. 5 मिनट के लिए 280 XG पर धोने मध्यम और अपकेंद्रित्र के 7 एमएल जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। Iscove के संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM) में गोली Resuspend और बर्फ पर दुकान। एक hemocytometer साथ सेल नंबर निर्धारित करें। 5 मिनट के लिए 280 XG पर centrifugation द्वारा 0.5 x 10 6 कोशिकाओं और गोली ले लो। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  7. पूर्व शांत सब बर्फ पर जेल घटकों उन्हें एक बाँझ ट्यूब में मिश्रण से पहले। मिक्स निम्नलिखित कोलेजन जेल घटकों (अंतिम एकाग्रता): मैं 2.1 मिलीग्राम / एमएल चूहा पूंछ कोलेजन प्रकार, 24.9 मिमी ग्लूकोज, 23.8 मिमी नःसीओ 3, 14.3 मिमी NaOH, 10 मिमी HEPES, और 1x M199 माध्यम में 10% बाह्य मैट्रिक्स। कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स पिछले जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
  8. कोलेजन जेल के 3.5 μL के साथ 0.5 x 10 6 कोशिकाओं Resuspend और मिश्रण अच्छी तरह से।
  9. 0.5 सेमी लंबी चैनल (चित्रा 1 बी II) में सेल निलंबन के 4 μL जोड़ने के लिए एक P10 विंदुक टिप का उपयोग। बाँझ संदंश यदि आवश्यक हो तो साथ टांका की स्थिति को समायोजित करें।
  10. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पेट्री डिश के तल को कवर, सुनिश्चित करें कि जेल को छूने के लिए नहीं बना रही है। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. संस्कृति के माध्यम के 12 एमएल (जैसे, स्टेम समर्थक या मध्यम सेल निर्माता द्वारा अनुशंसित), कोशिकाओं (चित्रा 1 बी-तृतीय) को कवर करने के लिए पर्याप्त के साथ पीबीएस बदलें। 1 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति। हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।

4. Biowire खेती के लिए बिजली उत्तेजना

  1. मेंBSC, एक छह अच्छी तरह से थाली कि एक बिजली के उत्तेजक चैम्बर घर होगा के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। बाँझ चिमटी का प्रयोग धीरे कुएं में autoclaved बिजली की उत्तेजना डिवाइस जगह। अच्छी तरह से पीबीएस त्यागें।
  2. पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 5 एमएल के साथ कार्बन छड़ कवर। बिजली की उत्तेजना कक्ष में biowires माउंट करने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें और उन्हें कार्बन छड़ (चित्रा 2) करने के लिए खड़ा उन्मुख।
  3. छह अच्छी तरह से प्लेट के ऊपर ढक्कन रखें, लेकिन पर्याप्त प्लैटिनम तार प्लेट के बाहर तक पहुँचने छोड़ विद्युत उत्तेजक के साथ कनेक्ट करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह से थाली प्लेस और बिजली उत्तेजक को प्लैटिनम तार कनेक्ट।
  4. biphasic दोहरा नाड़ी, 1-एमएस पल्स अवधि, 3 वी / सेमी, और प्रति सेकंड 1 पल्स (पीपीएस): निम्न सेटिंग वाले एक बिजली के उत्तेजक का उपयोग कर biowires उत्तेजित। निम्न मान के लिए पी पी एस हर 24 घंटे बढ़ाएं: 1.83, 2.66, 3.49, 4.82, 5.15, और 6. बदलें मध्यम हर दूसरे दिन।
  5. 10X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे बिजली की उत्तेजना के जवाब में cardiomyocyte सिकुड़ना का निरीक्षण करें।
    नोट: के बाद उत्तेजना के एक सप्ताह, biowires परिपक्व हो जाता है (परिणाम अनुभाग देखें)।

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Representative Results

biowires में एक टांका के उपयोग के लिए तर्कसंगत 3 डी निर्माणों कि एक धुरी में संरेखित और हृदय तंतुओं के आकार की नकल के गठन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा करने के लिए है। हम बताते हैं कि biowire में संस्कृति की सात दिनों के बाद, कोशिकाओं टांका (चित्रा 3 ए) के आसपास जेल पुन: बनाया। कोशिकाओं टांका की धुरी के साथ इकट्ठे हृदय ऊतक (चित्रा 3) गठबंधन बनाने के लिए। preculture के 7 दिनों के बाद, biowires विद्युत क्षेत्र उत्तेजना के 7 दिन और cardiomyocytes के संरचनात्मक और कार्यात्मक परिपक्वता के साथ संगत आगे प्रदर्शन किया गुण का शिकार हुए।

मानव biowires में PSC मुख्यमंत्रियों हृदय सिकुड़ा प्रोटीन की मजबूत अभिव्यक्ति, sarcomeric α-actinin, और actin (चित्रा 4 ए) का प्रदर्शन किया। हम hPSC-मुख्यमंत्री सिकुड़ा तंत्र और myofibrilar बाध्यताओं के संरेखण के sarcomeric बैंडिंग मनायाटांका की धुरी के साथ। यह गुणात्मक वयस्क दिल (चित्रा 4 ए) में संरचना के समान है। दूसरा, ईबीएस के उन लोगों की तुलना में, इन biowired hESC मुख्यमंत्रियों कम प्रसार दरों (चित्रा 4 बी) का प्रदर्शन किया। तीसरा, biowired hESC मुख्यमंत्रियों सुधार कैल्शियम से निपटने के गुण (चित्रा 5) और cardiomyocyte इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी परिपक्वता (चित्रा 6) प्रदर्शन किया। परिपक्व cardiomyocytes में, कैफीन के साथ इलाज के sarcoplasmic जालिका 8 से सीए 2 + की अचानक रिहाई लाती है। इस तरह के Ca 2 + यात्रियों गैर प्रेरित नियंत्रण (चित्रा 5 ए-सी) से कोशिकाओं में नहीं विद्युत प्रेरित hESC-सेमी में पाए गए, लेकिन। गैर प्रेरित नियंत्रण की तुलना विद्युत प्रेरित कोशिकाओं में कैफीन के जवाब, एक उत्तेजना आवृत्ति निर्भर तरीके (चित्रा 5D और ई) में तीव्रता का एक काफी अधिक आयाम का पता चला। इस बीच, hPSC मुख्यमंत्रियोंbiowires में सुधार hERG वर्तमान और संशोधक वर्तमान आवक (मैं k1) घनत्व है, जो आगे बिजली की उत्तेजना (चित्रा 6A और बी) द्वारा बढ़ाया गया था दिखाया। मैं k1 वर्तमान में इस तरह के सुधार biowires (चित्रा 6C) में पोटेशियम भीतर सुधार चैनल जीन (KCNJ2) प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक प्रेरण के अनुसार कर रहे हैं।

परिपक्वता के बारे में एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर अनायास हरा cardiomyocytes की क्षमता है, यह भी स्वत: चलन के रूप में जाना है, जो काम कर रहे cardiomyocytes (आलिंद और निलय) 16 में अपरिपक्वता की निशानी है। स्वत: चलन नियंत्रण biowires (चित्रा 6D) है, जो 6 हर्ट्ज आहार के अधीन biowires में बराबर था की तुलना में ईबी व्युत्पन्न cardiomyocytes में काफी अधिक था।

लेनाn एक साथ, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बिजली की उत्तेजना के साथ biowire में संस्कृति hPSC मुख्यमंत्रियों 14 के संरचनात्मक और electrophysiological परिपक्वता को बढ़ावा दिया।

आकृति 1
चित्र 1: Biowire संस्कृति मंच। (ए) योजनाबद्ध (बाएं) और वास्तविक (दाएं) biowire की PDMS मोल्ड। स्केल बार = 2 मिमी। (बी) biowire सेट करने के लिए, एक टांका केन्द्र चैनल (आई) में रखा गया था। कोलेजन प्रकार मैं जेल में एक hESC-मुख्यमंत्री निलंबन चैनल (द्वितीय) में टांका चारों ओर वरीयता प्राप्त और मध्यम (iii) में इनक्यूबेट किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2:Biowire खेती के दूसरे सप्ताह के दौरान विद्युत उत्तेजना चैंबर में सुसंस्कृत किया गया था। biowire कार्बन इलेक्ट्रोड करने के लिए खड़ा रखा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: सेल पुननिर्माण और जेल Biowire में Preculture के 7 दिन के बाद सिवनी के आसपास अनुबंध करना। (ए) biowire टेम्पलेट में preculture का संकेत दिया दिनों पर hESC मुख्यमंत्रियों की Brightfield छवियों। स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी। (बी) संस्कृति के संकेत के दिनों में जेल संघनन की मात्रा (एसडी ± औसत)। (सी) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और मैसन का trichrome (एमटी) biowire वर्गों के धुंधला (दो सिरों तीर टांका अक्ष का प्रतिनिधित्व करते हैं)। स्केल बाआर = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा संदर्भ 14 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: Biowire मंच में cardiomyocytes सुसंस्कृत की फिजियोलॉजी। (ए) गैर प्रेरित (नियंत्रण) के प्रतिनिधि कोंफोकल छवियों और विद्युत प्रेरित biowires (3 हर्ट्ज और 6 हर्ट्ज परहेजों) cardiomyocyte संरेखण और बार-बार जेड डिस्क दिखा (दो सिरों तीर टांका अक्ष का प्रतिनिधित्व करते हैं)। ग्रीन, α-actinin; लाल, एक्टिन। स्केल बार = 20 सुक्ष्ममापी। (बी) biowires में cardiomyocyte प्रसार ईबीएस की तुलना में कम था। प्रसार sarcomeric α-actinin और Ki67 (n = 3-4 प्रति हालत, औसत ± के लिए डबल धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था; एसडी)। *, **, #, और और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद EBd34 (विद्यार्थी t- टेस्ट) की तुलना में प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा संदर्भ 14 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: सीए 2 + में विद्युत उत्तेजना प्रचारित सुधार हैंडलिंग गुण। (एसी) nonstimulated नियंत्रण कोशिकाओं (ए) और कोशिकाओं 3-हर्ट्ज आहार (बी) और 6 हर्ट्ज आहार (सी) के अधीन में कैफीन के जवाब में सीए 2 + रिहाई के प्रतिनिधि निशान। (डी) प्रयोगात्मक समूहों के बीच शिखर प्रतिदीप्ति तीव्रता का कैफीन-प्रेरित परिवर्तन (शिखर प्रतिदीप्ति मैं सामान्य के बाद sem ± मतलबकैफीन के प्रशासन से पहले ntensity; बनाम 3 हर्ट्ज, पी = 1.1 x 10 नियंत्रण - 6; बनाम 6 हर्ट्ज, पी = 2.1 x 10 नियंत्रण - 7; 3 हर्ट्ज बनाम 6 हर्ट्ज, पी = 0.003; एन = 10 (नियंत्रण), एन = 6 (3 हर्ट्ज), और एन = 9 (6 हर्ट्ज) (विद्यार्थी t- टेस्ट)। (ई) 2 + यात्रियों से पहले और 6 हर्ट्ज आहार के अधीन कोशिकाओं में 5 मिमी (तीर) में कैफीन के प्रशासन के बाद सीए के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट रिकॉर्डिंग। यह आंकड़ा संदर्भ 14 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: विद्युत पेसिंग में सुधार करता है electrophysiological गुण और स्वत: चलन। Electrophysiologbiowires या embryoid निकायों (EBS) से अलग एकल cardiomyocytes में iCal गुण एक पैच क्लैंप के साथ दर्ज किए गए। (ए) hERG पूंछ वर्तमान घनत्व। (बी) मैं K1 वर्तमान घनत्व -100 mV पर मापा। (सी) अपरेगुलेशन पोटेशियम की भीतर से चैनल जीन सुधार (KCNJ2)। (डी) सहज पिटाई (स्वत: चलन) या कोई सहज पिटाई (कोई स्वत: चलन) प्रदर्शित कोशिकाओं का अनुपात। ईसवी में डेटा औसत ± SEM प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतभेद विद्यार्थी t- टेस्ट, ची-वर्ग परीक्षण, और एनोवा (जोड़ो में कई तुलना, होल्म-सिदक विधि) द्वारा विश्लेषण किया गया प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा संदर्भ 14 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी colspan = "5"> प्लैटिनम तार को कोई नुकसान धीरे ढक्कन को कवर करके बचें। मामले में ढक्कन पूरी तरह से बंद नहीं होती है थाली पर ठीक से ढक्कन सुरक्षित करने के लिए टेप का प्रयोग करें। जब इनक्यूबेटर दरवाजे को बंद करने, दरवाजा बंद करने बिंदुओं पर विद्युत उत्तेजक से तारों की पतली भाग जगह इनक्यूबेटर के समुचित सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए।
प्रोटोकॉल कदम # गंभीर कदम
2.4 2 सेमी अलग या छोटी संभव दूरी पर उच्च ऊर्जा उत्तेजना और कोशिका मृत्यु से बचने के लिए - कार्बन छड़ 1 रखें।
2.6 प्लैटिनम तार और कार्बन एक बार उत्तेजना कक्ष पहली बार के लिए किया जाता है के बीच कनेक्शन का परीक्षण करें। विद्युत उत्तेजक करने के लिए उत्तेजना कक्ष लिंक करें और फिर एक वांछित वोल्टेज की स्थापना की। दो कार्बन छड़ से प्रत्येक पर एक वोल्ट नेतृत्व रखें। उत्तेजना कक्ष से आउटपुट वोल्टेज एक ही वोल्टेज वाल्टमीटर पर पढ़ा होना चाहिए। किसी भी गलत रीडिंग PDMS साथ प्लैटिनम तार के संभावित कोटिंग या सिस्टम में एक और दोषपूर्ण संबंध का संकेत।
3.1 एकल कोशिकाओं biowire बीज के इस्तेमाल किया गया। पृथक्करण के लिए, incubation कोलैजिनेज़ के साथ समय महत्वपूर्ण है और कोशिकाओं की उम्र और भेदभाव प्रोटोकॉल (monolayers बनाम EBS) द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, 2 घंटे की एक ऊष्मायन समय दिन के लिए सिफारिश की है 21 ईबीएस और monolayers के लिए 30 मिनट। अन्य उम्र के कोशिकाओं के लिए, कोलैजिनेज़ पाचन समय सेल व्यवहार्यता और सिकुड़ा समारोह के बाद पाचन की निगरानी के द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती।
3.3 ट्रिप्सिन कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता; इस प्रकार, 5 मिनट से अधिक नहीं करने के लिए ऊष्मायन अवधि सीमा।
3.5 सिरिंज का ही छोर पकड़े सुई टिप करने के लिए सिरिंज संलग्न करने से दूषित पदार्थों को शुरू करने से बचें। डालता की संख्या कोशिकाओं के बड़े गुच्छों के अभाव से निर्धारित होता है। सुई कम से कम व्यवधान कोशिका मृत्यु से बचने के लिए। बुलबुला गठन से बचें। सुई विघटन के बाद दिखाई गुच्छों के मामले में, में वृद्धि का लम्बा बाद विलगन में कोलैजिनेज़ में ऊष्मायन समय के बजायट्रिप्सिन या डालता है की संख्या में ऊष्मायन समय।
3.6 सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से जेल के अलावा करने से पहले निकालें। अवशिष्ट मध्यम सेल के अनुपात पतला हो सकता है: जेल और जेल बहुलकीकरण प्रभावित करते हैं।
3.7 जब ऊपर या नीचे स्केलिंग कोलेजन जेल घटकों की सांद्रता को बनाए रखें। ध्यान रखें कि शेयर सांद्रता बैच या अभिकर्मकों की तैयारी के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
3.11 कि PDMS microwells पेट्री डिश के तल पर रहने सुनिश्चित करने के लिए, सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश सूखा है बनाने के लिए और PDMS microwells नीचे पुश करने के लिए बाँझ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
4.2 सुनिश्चित करें कि सभी biowires स्थान पर हैं। पूरी तरह से बिजली की उत्तेजना कक्ष में माध्यम के साथ biowires कवर। कार्बन छड़ करने के लिए खड़ा सब biowires व्यवस्थित करें।
4.3
4.4 मध्यम परिवर्तन के लिए बिजली के उत्तेजक डिस्कनेक्ट कर दें। वर्ष माध्यम के केवल शीर्ष भाग को दूर करने के लिए और फिर ताजा मध्यम जोड़ने के एक P1000 का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि biowires हमेशा मध्यम के भीतर डुबोया जाता है।

तालिका 1: प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम।

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Discussion

यह पांडुलिपि सेटअप और इंजीनियर मंच, biowire के कार्यान्वयन का वर्णन है, hPSC मुख्यमंत्रियों की परिपक्वता में सुधार होगा। डिवाइस मानक microfabrication सुविधाओं में बनाया जा सकता है, और biowires आम सेल संस्कृति तकनीक और एक बिजली के उत्तेजक के साथ उत्पादन किया जा सकता है।

हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ biowires के समान कोई सूचना विधि है। इस रणनीति का पता चलता है कि बेहतर परिपक्वता गुण, के रूप में biowires उच्च उत्तेजना दर रैंप-अप आहार (6 हर्ट्ज बनाम 3 हर्ट्ज) के अधीन में प्राप्त अधिक से अधिक परिपक्वता के स्तर इसका सबूत बिजली की उत्तेजना आहार पर निर्भर थे। Biowires में cardiomyocytes कम स्वत: चलन और उच्च hERG धाराओं का प्रदर्शन किया और मैं तुलना में K1 ईबीएस 20 दिन (EBd20) के लिए या 40-44 दिन (EBd44) के लिए खेती करने के लिए। EBd20 cardiomyocytes, biowires में उनके शामिल करने से पहले सेल गुणों का प्रतिनिधित्व किया जबकि EBd44 cardiomyocytes सुसंस्कृत 10 दिनों एल थेonger biowire संस्कृति समय और पता चलता है कि ईबी प्रारूप में संस्कृति में लंबे समय के साथ, cardiomyocytes biowires में बिजली की उत्तेजना से प्रेरित उन लोगों के रूप बराबर परिपक्वता गुण नहीं पहुंच सका है। हालांकि, cardiomyocytes biowires के माध्यम से प्राप्त अभी भी वयस्क cardiomyocytes के रूप में के रूप में परिपक्व नहीं हैं।

यांत्रिक उत्तेजना hPSC मुख्यमंत्रियों की संरचनात्मक प्रोटीन की प्रेरण में प्रभावी होने के लिए सुझाव दिया गया है। हालांकि, यांत्रिक उत्तेजना electrophysiological परिपक्वता 12 के लिए नेतृत्व नहीं किया था। यह hPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes में टर्मिनल भेदभाव प्रेरित करने के लिए, बिजली की उत्तेजना और मैकेनिक तनाव गठबंधन करने के लिए की जरूरत का सुझाव दे सकता क्रमिक रूप से या समवर्ती,। जैव रासायनिक के वितरण सहित अन्य तरीकों, साथ बिजली की उत्तेजना के संयोजन 17 कारकों और 3 डी में सेल का मिलान 18 ऊतकों, एक अधिक प्रभावी समर्थक परिपक्वता रणनीतियां प्राप्त करने में सक्षम हो सकता हैविवो अध्ययन में भविष्य के लिए GY।

biowire डिवाइस के आयामों यहां इस्तेमाल किया 5 मिमी हैं एक्स 1 मिमी x 0.3 मिमी (लंबाई x चौड़ाई x ऊँचाई), लेकिन यह अब biowires बनाने के लिए डिवाइस को संशोधित करने के लिए संभव है। हालांकि, biowires की ऊंचाई, 0.3 मिमी तक ही सीमित है (जेल संघनन पर ~ 300 सुक्ष्ममापी की परिधि के साथ) बड़ा ऊतकों में ऑक्सीजन प्रसव में सीमाओं दिया। मोटा ऊतकों पैदा करने की इस सीमा को पार करने के लिए, एक छिड़काव विधि 19 की आवश्यकता होगी। फिर भी, यह 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / लंबाई में तार के 0.5 सेमी के अनुपात बनाए रखने के लिए सिफारिश की है। अब biowires के लिए, कोलेजन जेल बहुलकीकरण अधिक समय लग सकता है, और अधिक लगातार मध्यम परिवर्तन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की वजह से जरूरत हो सकती है। इसके अलावा, biowire रेशम टांके का उपयोग कर के मौजूदा सेटअप संकुचन के बल वरीयता प्राप्त cardiomyocytes द्वारा उत्पन्न की माप के लिए अनुमति नहीं है। हालांकि, एक बायोडिग्रेडेबल टांका के उपयोग पहुंच सकता हैभविष्य में यह संभव ई।

सेल biowire यहाँ वर्णित बनाने के लिए इस्तेमाल प्रकार hESC-मुख्यमंत्री Hes2 सेल लाइन 20 का उपयोग कर रहा है। प्रोटोकॉल भी hiPSC सेल लाइनों (जैसे, CDI-MRB और मानव संसाधन-मैं-2CR-2R) 14 इस्तेमाल कर सकते हैं। विभिन्न मानव स्टेम कोशिका पंक्ति का cardiomyogenic क्षमता अलग हो सकता है, और इस मंच के लिए उपयुक्तता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए और शर्तों अनुकूलित के रूप में की जरूरत है। वहाँ प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम (तालिका 1 देखें) कर रहे हैं।

साथ ही, biowires एक 6 अच्छी तरह से थाली में फिट करने के लिए डिजाइन किए गए थे, और उदाहरण यहाँ एक biowire के निर्माण से पता चला है। हालांकि, यह संस्कृति के लिए संभव है और विद्युत एक अच्छी तरह से में एक साथ कई biowires को प्रोत्साहित।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

यह काम एक अनुदान सहायता दिल से द्वारा समर्थित किया गया था और स्ट्रोक कनाडा (जी 14-0,006,265) के फाउंडेशन, स्वास्थ्य अनुसंधान (137,352 और 143,066), और एक जेपी बिकेल नींव अनुदान की कनाडा संस्थान से ऑपरेटिंग अनुदान (1,013,821 ) एसएसएन करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

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References

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