電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

心臓biowireプラットフォームは、電気刺激と三次元細胞培養を組み合わせることによって、ヒト胚および誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞(HPSC-CM)を成熟するために使用されるインビトロの方法です。この原稿は、心臓biowireプラットフォームの詳細な設定を提示します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞(HPSC-CMS)は、有望な細胞源となっているため、創薬、疾患のモデリング、組織工学、再生医療を含む心臓研究におけるそれらの潜在的なアプリケーションの調査を奨励しています。しかし、既存のプロトコルにより生成される細胞は、天然成体心室心筋細胞と比較して未成熟の範囲を表示します。多くの努力がこれまで達成のみ中等度の成熟に、HPSC-CMSを成熟する試みがなされてきました。したがって、biowire呼ば操作システムは、in vitroでのより成熟した状態にHPSC-CMSをリードする物理的および電気的の両方の手がかりを提供することによって考案されています。システムは、私が徐々に増加する周波数と電場刺激にさらされる整列心臓組織(biowire)にアセンブルする剛性テンプレート縫合糸に沿ってゲル型コラーゲンにHPSC-CMSを播種するために微細加工プラットフォームを使用します。非刺激対照と比較して、biowired心筋細胞は、構造的および電気生理学的成熟の強化度を示す刺激しました。このような変化は、刺激速度に依存します。本稿では詳細にbiowiresの設計と作成について説明します。

Introduction

セルベースの治療が最も有望なの一つであり、心臓修復/再生を実現するための戦略を検討しました。これは、心臓組織工学と生体材料1、2の共同送達によって助けられています。ほとんどの利用可能な細胞源は、損傷、病気の、または高齢者の心3上の彼らの潜在的に有益な効果のための動物モデルで研究されています。具体的には、多大な努力は、ヒト多能性幹細胞を使用する試みがなされている(HPSC)は、心筋(HPSC-CM)、心臓組織工学のための潜在的に無制限の自己細胞源由来しました。 HPSC-CMSは、いくつかの確立されたプロトコル4、 5、 図6を用いて製造することができます。しかし、得られた細胞は成体心室心筋7に比べ未熟特性の範囲は、胎児様表現型を表示します8。これは、創薬研究における成人の心臓疾患モデル9の開発における成人の心臓組織のモデルとしてHPSC-CMのアプリケーションに障害となり得ます。

表現型の未熟さのこの制限を克服するためには、新しいアプローチが積極的に心筋細胞の成熟を促進するために研究されてきました。初期の研究は、環状機械10又は電気的刺激11を介して新生児ラット心筋細胞における効果的なプロ成熟特性を明らかにしました。ゲルの圧縮および環状機械的刺激はまた、電気生理学およびカルシウムハンドリング性の最小の増強とのhpSC-CMの成熟12、13、のいくつかの側面を改善することが示されました。したがって、「生物学的ワイヤ」(biowire)と呼ばれるプラットフォームシステムは、構造的な手がかりと電界の両方を提供することによって考案されたstimulatioHPSC-CMS 14の成熟を強化するためのn。このシステムは、電場刺激を受けやすい整列心臓組織を作成するための微細加工プラットフォームを使用しています。これはHPSC-CMの構造的および電気生理学的成熟度を向上させるために使用することができます。ここで、我々は、このようなbiowiresを作るの詳細を説明します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.マスターデザインと製作

注:デバイス製造にソフトリソグラフィを使用してください。ポリジメチルシロキサン(PDMS)成形用の2層SU-8マスターを作成します。

  1. 設計と製図ソフトウェアを使用してデバイスを設計します( 図1A 、左)。マスターの各レイヤーを個別に描画します。マスタ15の 2つのレイヤに対応する2つのフォトマスク(20,000 dpi)にデバイスデザインを印刷します。デバイスパターンを透明に設定し、周囲の領域を暗く設定します。マスクはリソグラフィー(他の15に記載されているように)によってデバイスパターンをSU-8上に光学的に転写するためのテンプレートとして役立つ。
  2. 約4mLのSU-8 50を4インチシリコンウェハの中心に分配する。 2000回転/分(RPM)で30秒回転させることにより、スピンコータを使用してSU-8 50をウェハ上に均一に塗布する。ウェーハを95℃のホットプレート上で10分間焼く。ウェハを紫外線(UV)liに暴露する量200mJ / cm 2でGHT。
  3. 30秒間2500rpmでウェハとスピンの中心上にSU-8 2050の約4ミリリットルを注ぎます。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。室温(RT)に冷却します。
  4. 繰り返しステップ1.3をさらに2回。
  5. 第1層目の透明フォトマスクで被覆されたウェハを覆います。第一の層を作るために270ミリジュール/ cm 2のUV光にウェハを露出します。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。
  6. 二回ステップ1.3を繰り返して、SU-8 2050年の第二の層を作ります。
  7. マスクアライナを用いて第1の層上のフィーチャに第二層マスクを整列させます。次いで、240ミリジュール/ cm 2のUV光にさらします。 15分間95℃で焼きます。
    注:露光時間が必要とされる全UV線量と使用前の日に測定されたUV光出力強度によって決定されます。
  8. プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)にそれを浸漬し、オービタルシェーカー上で30分間、200RPMで振盪することによってウェハを開発。
  9. 場所ウェーハの中心に:マスターペトリ皿へと慎重には、PDMSの混合物(重量で1〜10の割合で、架橋剤を塩基)を注ぎます。すべての機能を網羅し、気泡を避けます。
  10. 2時間70℃のオーブンで加熱。 PDMSのbiowireテンプレート(右図1A)のエッジの周りに切断する鋭利な刃を使用。マスターからPDMSの皮をむきます。ブレードとデバイスをトリム。 20分間121℃で滅菌ポーチと蒸気オートクレーブ中でPDMSのbiowireテンプレートを置きます。
  11. 安全キャビネット(BSC)では、ペトリ皿にPDMSのbiowireテンプレートを配置します。チャネルの両端の溝の中に着座することによりPDMSマイクロウェルのチャネル( 図1B-I)の中央に無菌外科用絹縫合糸(6-0)の部分を保持し、マウントするピンセットを使用。

電気刺激商工会議所の2創出

  1. 2cmのX:長方形のポリカーボネート片(長さ×幅×厚さのペアを作ります0.85 X 0.35センチメートルCM)および電気刺激室( 図2)のフレームとしてそれらを使用します。
  2. 2センチメートル離れポリカーボネートフレームピースの中心線に沿ってドリル2つの幅3mmの穴。
  3. 長さ1.5cm炭素棒の2枚をカット。端から3mm程度の炭素棒を介して1mmの広い穴をドリル。カーボンロッド孔から白金線を通し、カーボンロッドの周りを包むことによって、ワイヤを締め付けます。電気刺激とそれ以降の接続のための白金線の他端にクリップを取り付けます。
  4. ポリカーボネート枠片に炭素棒を挿入します。 6ウェルプレートのウェルに炭素棒に組み付けフレームを置き。
  5. ウェルにPDMSの2ミリリットルを注ぎます。近隣にPDMS表面レベルを維持するが、炭素棒の底部に到達していないがPDMSポリカーボネートフレームの底部を水没。 2時間70℃のオーブンで加熱。
  6. 6のうち、電気刺激室を取ります型ウェルプレートおよび20分間121℃で蒸気滅菌のために滅菌袋に入れ。

HPSC-CMの3酵素的解離

  1. 確立されたプロトコル4を使用して心筋細胞に分化するようにHPSCを誘導します。
    注:簡単に述べると、骨形成タンパク質4、塩基性線維芽細胞成長因子、アクチビンA、血管内皮増殖因子、およびDickkopfホモログ1 4と順次補充を通じて幹プロ培地中で確立された胚様体(EB)プロトコルを介して心筋細胞を生成します。 biowiresを作るために分化の日20-34からのEBを使用してください。
  2. P1,000ピペットチップを用いて低付着プレートからのEBを収集し、コニカルチューブに移します。 125×gで、室温で5分間の遠心分離によってペレット。上清を捨て、予め温めでペレットを再懸濁し、37℃のコラゲナーゼタイプI、1%デオキシリボヌクレアーゼI(DNアーゼI)を含有します。 2時間37℃でインキュベート消化のために。
  3. 予め温めの5 mLを加え、37℃、125×gで、室温で5分間培地および遠心分離を洗います。上清を捨てます。トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液2mLでペレットを再懸濁し、5分間37℃でインキュベートします。
  4. 3%を含有する停止培地1mL(v / v)のDNアーゼIを追加
  5. 5 mLの注射器に20 G(1.5 mm)の針を取り付け、それを介して3-5回EB懸濁液を渡します。
  6. 5分間280×gでの洗浄媒体および遠心分離機の7ミリリットルを加えます。上清を捨てます。イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中にペレットを再懸濁し、氷上で保存します。血球計算盤で細胞数を決定します。 5分間280×gで遠心分離することにより、0.5×10 6個の細胞ペレットを取ります。上清を取り除きます。
  7. 滅菌チューブにそれらを混合する前に、氷上でプレクール全てゲル成分。以下コラーゲンゲル成分(最終濃度)を混ぜる:2.1 mg / mlとラット尾コラーゲンI型、24.9 mMグルコース、23.8ミリモルのNaHCO 3、14.3 mMのNaOHを、10mMのHEPES、および1×M199培地で10%の細胞外マトリックス。最後に、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを追加します。ピペッティングにより混和します。
  8. コラーゲンゲルの3.5μLを用いて0.5×10 6細胞を再懸濁し、よく混合します。
  9. 0.5センチメートル長チャンネル( 図1B-II)中の細胞懸濁液の4μLを追加するP10ピペットチップを使用します。必要に応じて滅菌ピンセットを用いて縫合糸の位置を調整します。
  10. ゲルに触れないように確認しながら、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いてペトリ皿の底を覆います。 37℃で30分間インキュベートします。
  11. 細胞( 図1B-III)をカバーするのに十分な、( 例えば、Proまたは細胞メーカーが推奨する培地幹細胞)の培養培地の12 mLのPBSに置き換えます。 1週間37℃のインキュベーターで培養。一日おきにメディアを変更します。

Biowire栽培4.電気刺激

  1. にBSCは、電気刺激チャンバを収容する6ウェルプレートの各ウェルに2mlのPBSを加えます。優しくウェルにオートクレーブし、電気刺激装置を配置するために滅菌ピンセットを使用してください。井戸からPBSを捨ててください。
  2. 予め温めた培地5mlで炭素棒を覆います。電気刺激チャンバ内biowiresをマウントし、滅菌ピンセットを使用して、炭素棒( 図2)に直交して配向します。
  3. 6ウェルプレートの上部に蓋を置くが、電気刺激装置に接続するプレートの外側に到達するのに十分な白金線を残します。 37℃で細胞培養インキュベーター中で6ウェルプレートを配置し、電気刺激に白金線を接続します。
  4. 二相性パルス繰り返し、1 msのパルス持続時間、3 V / cmで、毎秒1つのパルス(PPS):電気的な次の設定を有する刺激装置を用いてbiowiresを刺激します。次の値にPPSを24時間毎に上げる:1.83、2.66、3.49、40.82、5.15、および6変更中隔日。
  5. 10倍の倍率で顕微鏡下で、電気刺激に応答した心筋細胞の収縮性を観察します。
    注:刺激の1週間後、biowiresが成熟になり(結果のセクションを参照してください)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

biowiresにおける縫合糸の使用のための合理は、一つの軸に整列し、心臓の繊維の形状を模倣する3D構築物の形成のためのテンプレートとして機能します。私たちは、biowireにおける文化の7日後に、細胞は、縫合糸( 図3A)の周囲にゲルを改造することを示しています。細胞が整列し、心臓組織( 図3)を形成するために、縫合糸の軸に沿って組み立てられました。前培養の7日後、biowires 7電場刺激の日と心筋の構造的および機能的成熟と互換性がさらに示される特性に供しました。

biowiresにおけるヒトPSC-CMは心収縮タンパク質の強い発現、筋節αアクチニン、およびアクチン( 図4A)を示しました。我々は、筋原繊維狭窄のHPSC-CMの収縮装置及びアラインメントのサルコメアバンディングを観察し縫合糸の軸に沿っ。これは成人の心臓( 図4A)内の構造と定性的に類似しています。第二に、EBのものと比較し、これらbiowiredのhESC-CMは低い増殖速度( 図4B)を示しました。第三に、biowiredのhESC-CMは、改良された特性を扱うカルシウム( 図5)と心筋細胞電気生理学的成熟( 図6)を示しました。成熟した心筋細胞では、カフェインを用いた治療は、筋小胞体8からのCa 2+の急激な放出を誘導します。例えばCa 2+トランジェントは、電気刺激のhESC-CMの中に見出さはなく、非刺激対照( 図5A-C)からの細胞で行いました。非刺激対照と比較して、電気的に刺激された細胞でのカフェインに対する応答は、刺激周波数依存的( 図5DおよびE)における強度の有意に高い振幅を明らかにしました。一方、HPSC-CMSbiowiresにさらに電気刺激( 図6AおよびB)によって増強された改善のhERG電流及び内向き整流電流(I K1)の濃度を示しました。 I K1 電流のそのような改良はbiowires( 図6C)中のカリウム内向き整流性チャネル遺伝子(KCNJ2)タンパク質発現の誘導によるものです。

成熟に関する別の重要なパラメータはまた、心筋細胞(心房および心室)16作業における未熟の兆候である自動性として知られて自発的に鼓動する心筋細胞の能力です。自動性は、6 Hzのレジメンに供biowiresのものに匹敵した制御biowires( 図6D)と比較してEB由来の心筋細胞において有意に高かったです。

取るnは共に、これらの結果は、電気刺激とbiowireにおける培養はHPSC-CMS 14の構造的および電気生理学的成熟を促進することを示します。

図1
図1:Biowire文化プラットフォーム。 (A)は概略(左)とbiowireの実際の(右)PDMSモールド。スケールバー= 2ミリメートル。 biowireを設定するには(B)は 、縫合糸は、チャネル(I)の中央に取り付けられました。 I型コラーゲンゲル中のhESC-CM懸濁液チャネル(II)中の縫合糸の周囲に播種し、培地(III)中でインキュベートしました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:Biowireは、栽培の第2週の間に電気刺激商工会議所で培養しました。 biowireは炭素電極に対して垂直に配置しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:Biowireで前培養の7日後に縫合糸の周りの細胞の改造やジェル契約。 biowireテンプレートの前培養の指示の日(A)のhESC-CMの明視野像。スケールバー=200μmです。 (B)培養示された日に、ゲル圧縮の定量(±SD平均)。 biowire部の(C)ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)及びマッソントリクローム(MT)染色(双頭矢印は、縫合軸を表します)。スケールBAR =100μmです。この図は、基準14から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:Biowireプラットフォームにおける心筋細胞培養の生理学。 (A)非刺激(対照)の代表的な共焦点画像と心筋アラインメント頻繁Z-ディスクを示す電気刺激biowires(3 Hzから6 Hzのレジメン)は(双頭矢印は、縫合軸を表します)。グリーン、αアクチニン。赤、アクチン。 =20μmのスケールバー。 biowiresにおける(B)心筋細胞の増殖は、EBにおけるよりも低かったです。増殖は、サルコメアαアクチニンおよびKi67について二重染色によって評価した(n =条件あたり3~4、平均±ました; SD)。 *、**、#、および&EBd34(スチューデントのt検定)と比較して統計的に有意な違いを表しています。この図は、基準14から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:CAでの電気刺激推進改善2+ハンドリング性。 (AC)3-Hzのレジメン(B)及び図6 Hzのレジメン(C)に供非刺激対照細胞(A)および細胞におけるカフェインに応答したCa 2+放出の代表的トレース。 (D)実験群の間でピーク蛍光強度のカフェイン誘発性の変化は、(ピーク蛍光Iを正規化した後、平均±SEMカフェインの投与前ntensity。 3ヘルツ、P = 1.1×10対コントロール- 6。 6ヘルツ、P = 2.1×10対コントロール- 7。 6ヘルツ、P = 0.003対3ヘルツ。 N = 10(対照)、N = 6(3 Hz)であり、n = 9(6ヘルツ)(スチューデントのt検定)。 6 Hzのレジメンに供する細胞に5mMの(矢印)でのカフェインの投与前および後のCa 2+トランジェントの(E)代表的な蛍光記録。この図は、基準14から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:電気ペーシングは、電気生理学的特性と自動性を向上させます。 Electrophysiologbiowires又は胚様体(EB)から単離された単一の心筋細胞におけるiCalの特性は、パッチクランプを用いて記録しました。 (A)のhERGテール電流密度。 -100ミリボルトで測定し(B)、I K1電流密度。 (C)内側チャネル遺伝子(KCNJ2)を整流カリウムのアップレギュレーション。 (D)自発拍動(自動能)または自発的な拍動(NO自動性)を示す細胞の割合。 AD内のデータは、実験群間の差は、スチューデントのt検定、カイ二乗検定およびANOVA(ペアワイズ多重比較、ホルム-Sidakの方法法)により分析し、平均±SEMを表します。この図は、基準14から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

<TDのはcolspan =「10」>蓋を静かに覆うことにより、白金線の損傷を避けてください。蓋が完全に閉じていない場合には、プレート上で適切に蓋を固定するテープを使用してください。インキュベーターのドアを閉じるときに、インキュベーターの適切なシールを確実にするために、ドア閉点における電気刺激からの配線の薄い部分を配置します。
プロトコルステップ# 重要なステップ
2.4 高エネルギーの刺激と細胞死を避けるために、カーボンロッドを1〜2 cm離して、または最小限の距離に置きます。
2.6 最初に刺激チャンバが作られたら、プラチナワイヤと炭素との間の接続を試験する。電気刺激装置に刺激チャンバを接続し、次に所望の電圧を設定する。 2本のカーボンロッドのそれぞれにボルトのリードを取り付けます。刺激チャンバからの出力電圧は、電圧計で読み取られるのと同じ電圧でなければなりません。不正確な示度は、PDMSによるプラチナワイヤのコーティングの可能性、またはシステム内の別の接続不良を示しています。
3.1 単細胞を用いてバイオワイヤーを播種した。解離のために、インキュベーションnはコラゲナーゼと時間が重要であり、細胞の年齢および分化プロトコル(単層対のEB)によって決定されるべきです。このプロトコルでは、2時間のインキュベーション時間は、21日目のEB及び単層のために30分間推奨されます。他の年齢層の細胞に関しては、コラゲナーゼ消化時間は、細胞の生存率と収縮機能ポスト消化を監視することによって、最適化が必要になる場合があります。
3.3 トリプシンは、細胞を損傷することができます。従って、5分よりもはやにインキュベーション期間を制限します。
3.5 針の先端に注射器を接続するために、注射器の端部のみを保持することによって、汚染物質を導入することは避けてください。プランジの数は、細胞の大きな塊が存在しないことによって決定されます。細胞死を回避するために、針の中断を最小限に抑えます。気泡の形成を避けます。針破壊後に目に見える塊の場合には、増加するのではなく、その後の単離におけるコラゲナーゼでインキュベーション時間を延長トリプシン中のインキュベーション時間またはプランジングの数。
3.6 ゲルを添加する前に上清を完全に除去する。残留媒体は、細胞:ゲルの比を希釈し、ゲル重合に影響を及ぼす可能性がある。
3.7 コラーゲンゲル成分の濃度を、スケールアップまたはスケールダウンの際に維持する。保存濃度は、バッチや試薬の調製によって異なる場合があります。
3.11 PDMSマイクロウェルがペトリ皿の底に留まることを確実にするために、ペトリ皿が乾燥していることを確認し、PDMSマイクロウェルを押し下げるために一対の滅菌鉗子を使用する。
4.2 すべてのバイオワイヤーが所定の位置にあることを確認します。電気刺激チャンバー内の培地でバイオワイヤーを完全に覆う。全てのバイオワイヤーをカーボンロッドに対して垂直に配置する。
4.3
4.4 培地交換のための電気刺激装置を外します。古い培地の上部のみを削除し、新鮮な培地を追加するにはP1000を使用してください。 biowiresは常にメディアの下に水没していることを確認してください。

表1:プロトコルにおける重要なステップ。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

この原稿はHPSC-CMの成熟を改善するために、設計プラットフォーム、biowireのセットアップと実装について説明します。デバイスは、標準的な微細加工設備で行うことができ、そしてbiowiresは、共通の細胞培養技術及び電気刺激を用いて製造することができます。

我々の知る限りでは、biowiresに似一切報告されている方法はありません。この戦略は、より高い刺激レートのランプアップレジメン(3ヘルツ対6ヘルツ)に供biowiresで得られた大きな成熟レベルによって証明されるように改善された成熟特性は、電気刺激療法に依存していたことがわかります。 biowiresにおける心筋細胞はあまり自動性と高いhERG電流を示し、 私がしたEBに比べK1 20日(EBd20)または40-44日(EBd44)のために栽培しました。 EBd44心筋細胞を10日間培養したLに対しEBd20心筋細胞は、biowiresへの組み込みの前に細胞の特性を表現しましたbiowire培養時間よりonger、さらにEB形式で培養中のより長い時間と、心筋細胞はbiowiresに電気刺激によって誘発されるもののような等価な成熟特性を達することができなかったことを示しています。しかし、biowiresを経て得られた心筋細胞は、まだ大人の心筋細胞のように成熟していないです。

機械的な刺激はHPSC-CMの構造タンパク質の誘導に有効であることが示唆されています。しかし、機械的刺激は、電気生理学的成熟12には至りませんでした。これはHPSC由来の心筋細胞に分化を誘導するために、順次又は同時に、電気刺激やメカニックストレスを組み合わせる必要を示唆するかもしれません。 3D組織中の生化学的要因17およびセル整列の配達18を含む他の方法との電気的刺激の組み合わせは、より効果的なプロ成熟strateを達成することができるかもしれませんin vivo試験での将来のためGY。

ここで使用されるbiowire装置の寸法を5mm×1ミリメートル×0.3ミリメートル(長さ×幅×高さ)であり、より長いbiowiresを作るための装置を変更することが可能です。しかしながら、biowiresの高さは、より大きな組織における酸素供給に制限を与え、(ゲル圧縮時〜300ミクロンの半径を有する)0.3ミリメートルに制限されます。厚い組織を生成するこの制限を克服するために、灌流法19を必要とされるであろう。それにもかかわらず、0.5×10 6細胞/長さのワイヤの0.5センチ比を維持することが推奨されます。長いbiowiresために、コラーゲンゲル重合は、時間がかかることがあり、そしてより頻繁な媒体の変化は、細胞数の増加を必要とすることができます。また、絹縫合糸を用いてbiowireの現在の設定を播種心筋細胞によって生成された収縮力の測定を可能にしません。しかし、生分解性縫合糸の使用は、MAKもよいですこれは将来可能です。

ここに記載されたバイオワイヤーを作製するために使用される細胞型は、Hes2細胞株20を用いたhESC-CMである。このプロトコールは、hiPSC細胞株( 例えば、 CDI-MRBおよびHR-I-2Cr-2R) 14を使用することもできる。異なるヒト幹細胞株の心筋形成能は異なる可能性があり、このプラットフォームの適合性は実験的に決定され、条件は必要に応じて最適化されるべきである。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります( 表1を参照)。

さらに、バイオワイヤは6ウェルプレートに適合するように設計されており、ここでは1本のバイオワイヤの作製を示しています。しかしながら、1つのウェル内で複数のバイオワイヤーを同時に培養し電気的に刺激することが可能である。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、費補助金のハートからでサポートされているとされたストロークカナダ(G-14から0006265)の財団、ヘルスリサーチ(137352と143066)、およびJP Bickell財団助成金のカナダの研究所からの運営費交付金(1013821 )SSNへ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10, (3), 034005 (2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, (0), 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285, (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24, (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114, (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90, (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, (10), e26397 (2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15, (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93, (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics