Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Biochemistry

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Summary

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

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Abstract

V'è una crescente domanda di analizzare molti campioni biologici per la malattia di comprensione e di scoperta di biomarcatori. proteomica strategie quantitative che consentono la misurazione simultanea di più campioni sono diffusi e ridurre notevolmente i costi ei tempi sperimentali. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata precursore combinato etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot), che migliora campione multiplazione di etichettatura isotopica tradizionale o approcci di tagging isobariche. CPilot globale può essere applicato a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi e fornisce informazioni sulla abbondanza relativa proteina attraverso diverse condizioni del campione. CPilot funziona 1) usando condizioni di bassa tampone pH selettivamente peptide dimethylate N-terminali e 2) utilizzando condizioni tampone pH elevato etichettare ammine primarie di residui di lisina con reagenti isobariche commercialmente disponibili (vedere Tabella dei materiali / reagenti). Il grado dimultiplexing campione disponibile dipende dal numero di etichette precursori utilizzati e il reagente di marcatura isobarica. Qui, presentiamo un'analisi 12-plex usando la luce e dimethylation pesante combinato con sei-plex reagenti isobariche per analizzare 12 campioni di tessuti di topo in una singola analisi. multiplazione avanzata è utile per ridurre il tempo sperimentale e costi e, soprattutto, permettendo un confronto in molte condizioni del campione (repliche biologiche, stadio della malattia, trattamenti farmacologici, genotipi, o longitudinali time-punti) con pregiudizi meno sperimentale e l'errore. In questo lavoro, l'approccio globale CPilot viene utilizzato per analizzare il cervello, cuore e tessuti del fegato attraverso repliche biologiche dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. Globale CPilot può essere applicato per studiare altri processi biologici e atta ad aumentare campione multiplexing a più di 20 campioni.

Introduction

Proteomica spesso comporta l'analisi di molti campioni utilizzati per comprendere meglio i processi patologici, cinetica enzimatica, modificazioni post-traduzionali, risposta a stimoli ambientali, risposta ai trattamenti terapeutici, scoperta biomarker, o meccanismi di droga. metodi quantitativi possono essere impiegati per misurare differenze relative dei livelli delle proteine ​​nei campioni di e può essere privo di etichetta o coinvolgere etichettatura isotopica (metabolica, chimica o enzimatica). Stabili metodi di etichettatura isotopo sono cresciuti in popolarità perché consentono molti campioni da analizzare simultaneamente e sono adatti per i campioni da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi. Metodi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentare la produttività sperimentale, marcatura isotopicariducendo il tempo di acquisizione, i costi, e l'errore sperimentale. Questi metodi utilizzano spettri di massa precursore per misurare abbondanze relative delle proteine ​​da picchi peptide. Al contrario, i reagenti codifica isobariche 8, 9, 10 generano ioni giornalista che sono o rilevati in MS / MS o MS 3 11 spettri e questi picchi sono utilizzate per rilevare l'abbondanze relative di proteine.

L'attuale stato-of-the-art in proteomica multiplazione o è un 10-plex 12 o 12-plex analisi tag isobarica 13. Multiplexing campione maggiore (cioè> 10 campioni) metodi sono stati sviluppati dal nostro laboratorio per tessuti 14, 15, 16, 17, e da altri per l'analisi di cellule 18 sup>, 19, 20, 21 tessuti, o peptidi mirati 22. Abbiamo sviluppato una tecnica di multiplexing migliorato chiamato combinato precursore etichettatura isotopica con marcatura isobarica (CPilot). CPilot globale è utile per ottenere informazioni sulle concentrazioni relative di tutte le proteine attraverso differenti condizioni del campione (≥12) 14. La figura 1 mostra una schema generale CPilot. Triptici o Lys-C peptidi sono selettivamente etichettati all'estremità N-terminale con dimethylation con bassi pH 2 ed a residui di lisina con 6-plex reagenti utilizzando pH elevato. Questa strategia raddoppia il numero di campioni che possono essere analizzati con reagenti isobariche che aiuta a ridurre i costi sperimentali e, inoltre, riduce i passaggi e il tempo sperimentali.

CPilot è flessibile abbiamo sviluppato altri metodi per studiare modi ossidativo post-traduzionalefiche, comprese le proteine 3-nitrotirosina modificati 14 e cisteina contenenti peptidi con S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Abbiamo anche sviluppato un aminoacido approccio selettivo, cisteina CPilot (cyscPILOT) 17. MS 3 acquisizione con un top-ione 11 o selettiva-y 1 ione metodo 15 può contribuire a ridurre l'interferenza degli ioni reporter e migliorare la precisione quantitativa di CPilot. L'uso di MS 3 nel metodo di acquisizione richiede uno strumento ad alta risoluzione con un analizzatore di massa Orbitrap sebbene bassa risoluzione strumenti trappola ionica possono anche funzionare 24.

In precedenza, CPilot è stato utilizzato per studiare le proteine del fegato 16 dal modello murino della malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo come eseguire l'analisi CPilot globale utilizzando cervello, cuore, fegato e omogenati per studiare il ruolo del periphery nella malattia di Alzheimer. Questo esperimento incorpora replica biologica. A causa della versatilità di CPilot, gli utenti interessati possono utilizzare la tecnica per studiare altri tessuti per una serie di problemi e sistemi biologici.

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Protocol

Etica dichiarazione: I topi sono stati acquistati da un non-profit di ricerca biomedica istituzione indipendente e alloggiati presso la Divisione di laboratorio risorse animali presso l'Università di Pittsburgh. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura ed uso degli animali Istituzionale presso l'Università di Pittsburgh.

1. Proteine ​​Estrazione e Generazione di peptidi per Chemical-tagging

  1. Estrarre proteine da tessuti, cellule, o fluidi corporei.
    1. Omogeneizzare 60-90 mg di tessuto (per esempio cervello, cuore, fegato e) in tampone fosfato salino (PBS 1x) con 8 M urea (500 mL) usando un omogeneizzatore meccanico. Proteasi o fosfatasi inibitori possono essere aggiunti al buffer, se necessario. In questo progetto, che non sono stati utilizzati. Utilizzare i seguenti parametri per l'omogeneizzatore: lisi perline una matrice, 4 m / s, 20 s. tessuto cardiaco può richiedere fino a 9 cicli di omogeneizzazione.
      NOTA: proteasi o di inibitori della fosfatasi s può essere aggiunto al buffer, se necessario. Essi non sono stati utilizzati in questo studio.
      1. Rimuovere tessuto omogenato dal tubo lisi e trasferire in una provetta da micro-centrifuga. Risciacquare lisi tubi con 100-500 ml di PBS con 8 M urea e combinare la soluzione di risciacquo con omogenato tissutale.
    2. Centrifugare i tessuti omogeneizzati (9.447 xg, a 4 ° C, 15 min) e raccogliere il surnatante.
  2. Determinare la concentrazione di proteine usando un test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: ulteriore diluizione con tampone può essere necessario se la concentrazione di proteina è troppo alta. Le concentrazioni risultanti per campioni da questi tessuti erano tra 6-13 mg / mL.
    1. Opzionale: Aggiungere uno standard di controllo della qualità interna (ad esempio bovini alfa caseina o altra proteina esogena) alla norma ug rapporto 1: campione di proteine 100 ug.
jove_title "> 2. Digestione del campione

  1. Aggiungere 100 mg (100 x 10 -6 g) di proteine di ogni campione a etichettati individualmente provette micro-centrifuga. Il volume dipende dalla concentrazione di proteina (vedi punto 1.2).
  2. Aggiungere ditiotreitolo (DTT) (40: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare a 37 ° C per 2 h. Il calcolo per il rapporto molare è basato massa proteica di albumina di siero bovino (BSA), che è 66,5 x 10 3 g / mol.
  3. Aggiungere iodoacetamide (IAM) (80: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare in ghiaccio al buio per 2 ore. Questa reazione è eseguita in ghiaccio per 2 ore per evitare reazioni collaterali.
  4. Aggiungere L-cisteina (40: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Aggiungere 20 mM tampone Tris con 10 mM CaCl 2 (pH 8,2) per diluire urea ad una concentrazione finale di 2 M.
  6. Aggiungere L-1-tosylamido-2 phenylethyl clorometil chetone (TPCK) -treated tripsina (50: 1 substrato enzimatico rapporto molare) di ciascun campione e incubare a 37 ° C per 24 h.
  7. Estinguere la digestione delle proteine ​​dal flash-congelamento del campione in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione.

Desalting 3. Il campione

  1. Re-acidificare i campioni con l'aggiunta di acido formico (FA). Aggiungere abbastanza FA per ottenere una concentrazione finale di 0,1%. Se i campioni sono in origine a -80 ° C, scongelare i campioni sul ghiaccio prima di ri-acidificazione.
  2. De-sale peptidi utilizzando C 18 lipofilo idrofilo ottenuta (HLB) cartucce 10 mg come descritto in precedenza 16.
  3. Asciugare i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) per un volume di ~ 10 microlitri.

4. dimethylation etichettatura (N-terminale)

  1. Ricostituire peptidi in acido acetico 1% (0,25 mg / mL) disciolti in cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o acqua di grado nano-pura. Rimuovere a 50 μ; G porzione in un tubo a micro-centrifuga (1,5 mL) e memorizzare il resto a -80 ° C.
  2. Aggiungere 8 ml di 60 mM (4%) CH 2 O (37% p / v) o 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% p / v) per i campioni di etichettatura con luce o dimethylation pesante, rispettivamente . Tipicamente, si aggiungono 4 ml di reagente per 25 pg di peptidi (Procedura 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Aggiungere 8 ml di 24 mM NaBH 3 CN o 24 mM NaBD 3 CN ai campioni marcati rispettivamente con leggera o pesante dimethylation,.
  4. Vortex e agitare su un agitatore tubo per circa 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Placare le reazioni con l'aggiunta di 16 ml di 1% di ammoniaca (~ 28-30% v / v) per 5 min. In genere, si aggiungono 8 ml di reagente per 25 mg di peptidi.
  6. Re-acidificare miscele di reazione aggiungendo 8 ml di 5% FA (98% v / v).
  7. Combinare la luce e peptidi dimetilato pesanti (Figura 1) per generare un totale di sei campioni. Vedi Tabella 1
  8. Eseguire dissalazione campione secondo passi 3.2 e 3.3.

5. isobarica Tagging (residui Lys)

  1. Ricostituire 100 pg di peptidi dimetilato (1 mg / mL) in 100 mM di bicarbonato di ammonio tri-etil (Teab) tampone (pH ~ 8,5).
  2. Preparare i reagenti isobariche, come indicato nel protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali / reagenti).
  3. Aggiungere i reagenti isobariche solubilizzati (41 mL) a peptidi e vortex per ~ 10 s. Agitare i campioni su un tubo agitatore micro-centrifuga per ~ 1 h. Placare le reazioni con 8 ml idrossilammina (10% w / v) e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente.
  4. Raggruppare le sei campioni etichettati in un'unica miscela e desalt (Procedura 3.1-3.3) o conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.
    NOTA: Per migliorare la copertura proteoma e profondità, una strategia di separazione multidimensionale è suggeritocome forte scambio cationico (SCX).

6. Forte scambio cationico

  1. Eseguire SCX come da protocollo del produttore (vedi Materiali Tavolo).
    1. Preparare ~ 1 mL di soluzione di ammonio formiato (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, e 500 mM) con 10% acetonitrile (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Rimuovere il tappo rosso dalla parte superiore del puntale e toccare la punta della pipetta con l'imballaggio slurry per garantire che il materiale di imballaggio è verso la parte inferiore del puntale.
      NOTA: Critical: Non buttare via la punta della pipetta fino alla fine del protocollo.
    3. Posizionare l'adattatore centrifuga sulla parte superiore di un tubo micro-centrifuga (2 mL) e fissare la punta della pipetta all'interno.
    4. Aggiungere 150 ml di tampone di ricostituzione SCX alle punte per pipette.
    5. Centrifugare le punte di pipette per 6 minuti a temperatura ambiente (4.000 xg). Ripetere questo passaggio altre due volte e gettare i rifiuti.
    6. Sciogliere il peptides in 150 microlitri di tampone di ricostituzione SCX. Assicurarsi che il pH è 3.
    7. Aggiungere peptidi alle punte per pipette, centrifuga (vedi 6.1.5), e mantenere l'eluente.
    8. Trasferire il filtro e pipetta in un tubo a micro-centrifuga (2 mL) e aggiungere 150 ml di 20 mM di soluzione di ammonio formiato. Centrifugare per 6 minuti a temperatura ambiente (4.000 xg) e mantenere l'eluente.
    9. Ripetere il punto 6.1.8 altre sette volte, usando concentrazioni successive (cioè 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM) di formiato di ammonio.
  2. Trasferire le otto frazioni SCX ai tubi micro-centrifuga (1,5 mL) e concentrato mediante evaporazione centrifuga (vedi punto 3.3).

7. cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) e MS 3

  1. Ricostituire i peptidi in acqua di massa grado spettrometria con 0,1% FA, filtro, e posto in una fiala di auto-campionatore. Filtra peptidi come follOWS:
    1. Aggiungi peptidi ricostituiti ad un tubo a micro-centrifuga contenente un filtro di 0,65 micron (vedi Materiali Tabella).
    2. peptidi centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Rimuovere il filtro, eliminare e aggiungere peptidi filtrati in una fiala di auto-campionatore.
  2. Preparare i buffer di fase mobile come segue: 3% (v / v) con 0,1% ACN FA (A) e 100% ACN con 0,1% FA (B).
  3. Iniettare 6 microlitri di ciascun campione frazione SCX su una colonna trappola impaccata a 2 cm con C 18 materiale (5 um, 200 Å dimensione dei pori).
    NOTA: pulizia campioni sulla trappola è la seguente: 3 min, 0% B; 3 ml / min utilizzando un sistema di cromatografia liquida 2D (vedi materiali Tabella).
  4. Eseguire il metodo analitico di separazione. Utilizzare una silice fusa colonna capillare 75 um id x 13,2 centimetri laser tirato-tip ricco di C 18 materiale (5 um, 100 Å). Il gradiente è: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 Nl / min, 180 min.
  5. Eseguire la raccolta dei dati per lo spettrometro di massa, mentre il metodo di separazione analitica è in esecuzione.
    NOTA: I parametri per la scansione di analisi MS sono i seguenti: 400-1,600 m / z, risoluzione 60.000, controllo automatico del guadagno (AGC) bersaglio 1 x 10 6 ioni, tempo massimo di iniezione 500 ms. Parametri per CID-MS / MS sono i seguenti: Top 1-7 o superiore dati 8-14 acquisizione dipendente (DDA), 3 m / z larghezza isolamento, 500 segnale minimo, il 35% di energia normalizzata di collisione (NCE), 0,25 attivazione q , 10 ms tempo di attivazione, 3 x 10 4 AGC, 50 ms massimo tempo di iniezione. Parametri per HCD-MS 3 sono le seguenti: 200 segnale minimo, 4 m / z larghezza isolamento, 60% NCE, il tempo di attivazione 0,1, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z intervallo di selezione MS / MS , escludere ioni genitore non-frammentato.
  6. NOTA: Per i campioni eseguito su un nuovo modello di uno strumento contenente un Orbitrap o uno spettrometro di massa tribrid, parametri DDA varieranno e possono essere ottimizzati per includere più MS / MS e MS 3 scansioni. Inoltre, per gli strumenti tribrid, selezione precursore sincrono (SPS) -MS 3 deve essere impiegato.

8. Data Analysis 16

  1. Cerca i file RAW utilizzando il software di analisi delle proteine ​​in un database appropriato, ad esempio il mouse UniProt.
    NOTA: E 'importante creare due flussi di lavoro per ogni file RAW per la ricerca per la luce e peptidi dimetilato pesanti.
  2. Cerca i file RAW utilizzando i seguenti parametri: tripsina con due scissioni perse, range di massa peptide 300-6,000 Da, 15 ppm genitore tolleranza di massa, 1 Da tolleranza frammentazione. modifiche statiche: dimethylation luce (28,031, peptide N-terminale) o heavy dimethylation (36,076 Da, peptide N-terminale), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    NOTA: A volte il picco dimetilato pesante è ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminale) è dal picco luce dimetilato e, quindi, dovrebbe essere incorporato nel flusso di lavoro di ricerca per i peptidi dimetilato pesanti. modifiche dinamiche: ossidazione (15,995 Da, M), 6-plex tag isobarico (229,163 Da, K). Include una ricerca di database un'esca per produrre false discovery rate (ad esempio 1 e il 5%) e un nodo di quantificazione per cercare il reporter intensità di ioni di tag isobariche.
  3. statistica
    1. Esportare i dati in un programma di foglio elettronico al fine di normalizzare i valori di ioni proteina reporter. Per ciascuna proteina, dividere sia i rapporti di ioni giornalista mediani o intensità di ioni greggio giornalista dal rapporto mediana dello standard interno o crude intensità giornalista ioni dello standard interno, rispettivamente. Utilizzare il software statistico appropriato come un programma di foglio elettronico, perseus, o R per determinare variazioni significative tra condizioni del campione.

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Representative Results

CPilot utilizza la chimica ammina-based per chimicamente peptidi dell'etichetta lungo la N-terminale e residui di lisina e migliora le capacità multiplexing campione. La figura 2 mostra dati rappresentativi MS che si ottiene da un 12-plex analisi CPilot di cervello, cuore, fegato e tessuti da topo modello di malattia e di tipo selvatico controlli di Alzheimer. Come indicato nella tabella 1, due repliche biologiche per topi malattia e wild-type di Alzheimer sono compresi in questa analisi 12-plex. La Figura 2A mostra una coppia picco doppiamente carica che è separato da m / z spaziatura di 4 indica un singolo gruppo dimetil stata incorporata nel peptide. Sia la luce e picchi dimetilato pesanti per questa coppia sono indipendentemente isolati e frammentati con CID. I dati MS / MS per ciascuno dei peptidi dimetilato è mostrato nelle figure 2B e C. Risultati della ricerca indicano che questo pair di picchi appartiene al T (dimetil) ELNYFAK (isobarica-tag 6) peptide della proteina chinasi fosfoglicerato 1. L'ione frammento più intenso è y 3+ che è simile per la luce e picchi dimetilato pesanti. Questi picchi sono isolati riguardo ad HCD-MS 3 e si osservano gli ioni Reporter (m / z 126-131) come mostrato nelle figure 2D e 2E. Entrambe le serie di MS 3 spettri sono necessari per ottenere informazioni circa i 12 campioni. In questo esempio, i rapporti reporter di ioni (AD / WT) (controllo delle malattie / Wild-tipo Alzheimer) per cervello, fegato e tessuti cardiaci sono simili tra i due repliche biologiche. I valori fold-change per ogni confronto suggeriscono che fosfoglicerato chinasi 1 livelli nel cervello e nel cuore sono più alti nei topi AD, mentre nel fegato i livelli sono più bassi.

Figura 1
Figure 1: flusso di lavoro usando Proteomica CPilot. Come esempio, questo flusso di lavoro descrive l'analisi di 12 campioni individuali. Proteine da tessuti, cellule o fluidi corporei vengono estratti e viene aggiunto uno standard proteina adatta (ad esempio bovini alfa-caseina). Le proteine ​​vengono digeriti con tripsina. Peptidi sono etichettati all'estremità N-terminale mediante leggera o pesante dimethylation (pH ~ 2,5) e residui di lisina utilizzando TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Peptidi marcati vengono raggruppati in un'unica miscela e soggetto a SCX RP-LC-MS / MS e MS 3. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Esempio Dati CPilot di peptidi dal cervello, del cuore, del fegato e dei tessuti del modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. (A) mostra leggeri e pesanti peptidi dimetilato, rappresentati dai picchi a m / z 643,854 e 647,875. Questi peptidi sono stati selezionati, isolato, e frammentata, generando così CID-MS / MS (B e C), che ha fornito l'identificazione peptide. Un ulteriore selezione, l'isolamento e la frammentazione dei più intensa ione frammento della luce e peptidi dimetilato pesanti nella fase MS / MS generati HCD-MS 3 spettri (D ed E), rispettivamente. La sequenza peptidica è T (dimetil) ELNYFAK (isobarica-tag 6) e appartiene alla fosfoglicerato chinasi 1. Si prega cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Reattivo isobarica0;
126 127 128 129 130 131
Luce dimethylation WT un AD b WT ANNO DOMINI WT ANNO DOMINI
cervello cuore fegato
dimethylation Heavy WT ANNO DOMINI WT ANNO DOMINI WT ANNO DOMINI
cuore fegato cervello
Il tessuto è sia da un controllo wild-type (WT) o di Alzheimer del mouse della malattia (AD) b.

Tabella 1: CPilot raggruppamento di AD e WT cervello, cuore, e tessuti del fegato.

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Discussion

CPilot consente la misura simultanea di più di 12 campioni unici. Al fine di garantire il tagging di successo sia a N-terminale e lisina residui di peptidi, è indispensabile avere il pH corretto per ogni serie di reazioni e di eseguire la reazione dimethylation prima per l'etichettatura peptide. dimethylation selettivo del N-terminale è effettuata da avere un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Questo risultato è ottenuto sfruttando le differenze dei PKA del dei gruppi amminici sulla lisina e N-terminale. A pH 2,5, la lisina è inattivo (PKA ~ 10.5); Tuttavia, se il pH è leggermente acido (pH 5-7) o basico, sia la N-terminali e residui di lisina saranno dimetilato. Inoltre, se la codifica isobarico viene eseguita per prima ad un pH basso, l'N-terminale avrà i residui di etichette e lisina isobariche saranno dimetilato. Ciò può provocare meno frammenti essere selezionati per MS 3 come dovrebbero essere selezionati b-ioni. Relativi costi di dimetilLe reazioni ation sono poco costosi rispetto ai reagenti isobariche commerciali. Mentre si può utilizzare un intero flacone di reagente isobarica per 100 mcg, abbiamo anche avuto successo con la metà del flacone di reagente per 100 mcg con efficienza etichettatura paragonabile. Questo aiuta a ridurre in modo significativo i costi per i singoli esperimenti CPilot e permette più campioni da analizzare. Inoltre è importante notare che altri reagenti codifica isobariche possono essere utilizzati al posto del reagente isobarica utilizzato in questo protocollo, come abbiamo precedentemente dimostrato 14. Per garantire un'elevata efficienza di etichettatura e di tagging, è importante aggiungere reagenti ai campioni in fretta. Ciò consentirà di campioni di avere approssimativamente lo stesso tempo di reazione. Per scopi quantitative, ciascun campione deve essere trattato in modo identico specialmente prima di mettere in comune campioni alla dimethylation e gradini etichettatura isobariche. Infine, va notato che lavorare con molti campioni contemporaneamente nelle fasi iniziali, necessitanties attenta abilità utente e attenzione a campione maneggevolezza.

Lo scenario più ideale è quello di ottenere ioni reporter per ogni proteina nella miscela di tutti i 12 campioni. Tuttavia, questo non è il caso per un gran numero di proteine. Il numero di peptidi identificati con le informazioni quantificazione per CPilot e altri migliorato multiplazione avvicinamento dipende da diversi fattori tra cui il tipo di campione, il frazionamento del campione e fasi di lavorazione, modalità di acquisizione dati MS, e tipo di strumento. Sebbene sia dimethylation e passi di tagging isobariche hanno un'alta efficienza di etichettatura peptide di circa 95-99%, c'è ancora ~ 20% dei dati MS 3, che non conterrà le informazioni giornalista di ioni. Ciò è dovuto in parte all'utilizzo di tripsina che genera peptidi arginina-terminati che risultano in nessun incorporazione di reagente isobarica. Questo può essere risolto utilizzando altri enzimi, come LysC, con un potenziale compromesso in identificazioni proteiche 25. Anche per pesantipeptidi dimetilato, il picco selezionato per frammentazione può essere M o M-1 picco, che hanno diverse intensità e influenzerà le intensità di ioni giornalista osservati nella fase MS 3. Così ci possono essere alcune ioni bassa intensità giornalista che non vengono rilevati per alcuni campioni. Tali situazioni sono spesso comunemente osservati per bassa intensità MS / MS frammenti che sono isolati per MS 3 passi. Una grande soluzione a questo problema è stata incorporata in spettrometri di massa tribrid, che, invece di usare selezione singola tacca per MS 3, utilizzano multi-tacca o più MS / MS frammenta 26.

C'è un sacco di versatilità nell'approccio CPilot soprattutto per quanto riguarda il numero di campioni che possono essere confrontati in una singola analisi (cioè, fino a 20 con reagenti isobariche commerciali) ed i tipi di tessuti utilizzati. Abbiamo dimostrato che è facile da ottenere accurate informazioni quantitative da cervello, cuore, etessuti del fegato della stessa analisi nel contesto di una malattia. Questo metodo, in modo simile ad altri metodi di multiplazione, permette l'analisi di più campioni contemporaneamente, ed è applicabile a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi. Inoltre, CPilot marcato peptidi possono essere analizzati utilizzando una bassa risoluzione 24 o alta (60.000) strumento. In confronto, ottenendo misurazione successo utilizzando altri metodi di multiplazione può essere limitata ad uno specifico tipo di campione (cioè le cellule) 18, può richiedere uno strumento ad altissima risoluzione 20, o l'accesso alle etichette isotopi stabili. CPilot è grande per gli utenti interessati a comprendere la malattia, scoperta di biomarcatori, risposta ad un farmaco o intervento terapeutico, o cambiamenti longitudinali attraverso molti punti temporali. Inoltre, per i grandi proteomica fucile analisi dei campioni clinici (dove N è grande, centinaia di migliaia), cpILOT possono essere adatti per ridurre i costi ei tempi sperimentali. In futuro, CPilot sarà ampliato di multiplex un maggior numero di campioni utilizzando isotopica ed etichette isobariche esistenti e romanzo.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi in competizione.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono l'Università di Pittsburgh start-up fondi e NIH, NIGMS R01 concessione (GM 117.191-01) per RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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References

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