Isolation, karakterisering og rensning af makrofager fra væv ramt af fedme-relaterede Inflammation

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol giver mulighed for en forsker at isolere og karakterisere væv-resident makrofager i forskellige hallmark betændt væv udvundet fra kost-induceret modeller af stofskiftesygdomme.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fedme fremmer en kronisk inflammatorisk tilstand, der er overvejende medieret af væv-resident makrofager samt monocyt-afledte makrofager. Kost-induceret fedme (DIO) er en værdifuld model i at studere rollen af makrofag heterogenitet; passende makrofag isolering er imidlertid vanskeligt at erhverve fra betændt væv. I denne protokol skitsere vi isolation trin og nødvendige retningslinjer for fejlfinding stammer fra vores undersøgelser for at opnå en passende befolkning af væv-resident makrofager fra mus efter 18 uger af højt fedtindhold (HFD) eller () høj-fedt/høj-kolesterol HFHCD) kost intervention. Denne protokol fokuserer på tre hallmark væv studerede i fedme og åreforkalkning herunder leveren, hvidt fedtvæv (WAT) og aorta. Vi fremhæve hvordan dualistiske brugen af flow flowcytometri kan opnå en ny dimension af isolering og karakterisering af væv-resident makrofager. En grundlæggende del af denne protokol adresser snørklede underliggende væv-specifikke enzymatiske digestions og makrofag isolation og efterfølgende celleoverfladen antistof farvning for flow cytometric analyse. Denne protokol adresser eksisterende kompleksiteter underliggende fluorescerende-aktiveret celle sortering (FACS) og præsenterer præciseringer til disse kompleksiteter for at opnå bred karakterisering fra tilstrækkeligt sorteret cellepopulationer. Alternative berigelse metoder er inkluderet til sortering af celler, såsom tætte leveren, giver mulighed for fleksibilitet og tid forvaltning, når du arbejder med FACS. Kort sagt, denne protokol aids-forsker til at evaluere makrofag heterogenitet fra et væld af betændt væv i en given undersøgelse og giver indsigtsfulde fejlfindingstip, der har været en succes for gunstige cellulære isolering og karakterisering af immunceller i DIO-medieret betændelse.

Introduction

Musemodeller har været flittigt brugt til at studere dynamikken i menneskelige sygdomme. Korrekt isolering af væv bosiddende celler fra mus i en syge tilstand kan skabe en platform for at forstå de molekylære og cellulære bidrag til patogenesen af en sygdom1. En lidelse, der er af afgørende betydning er fedme. Forekomsten af fedme fortsætter med at stige på verdensplan parallelt med insulinresistens og type 2 diabetes mellitus, kardiovaskulære sygdomme, og fedtlever sygdom2,3. Næringsstof overforbrug er yderligere skæv af nedsat fysisk aktivitet udløser ændret signaler fra fedtvæv, som kan ændre den cellulære miljø af andre perifere væv som aorta og leveren4. Sådanne forstyrrelser af metaboliske homøostase resultater i en kronisk lav kvalitet systemisk inflammation5.

Klassisk aktiveringen af makrofager bopæl til aorta og lever samt deres rekruttering til hvidt fedtvæv (WAT) har vist sig at ikke kun indlede dysregulering af metaboliske signaler, men også opretholde betændelse6,7. Fænotypiske og funktionelle heterogenitet af makrofager er stærkt forbundet med patogenesen af fedme relaterede co-morbiditet7. Den dynamiske plasticitet i makrofag polarisering giver mulighed for disse celler til at udstille en række aktiveret fænotyper, der koordinerer progression og opløsning af betændelse8. Mens klassisk aktiveret (M1) makrofager er involveret i udbredelsen af inflammation, har alternativt aktiveret (M2) makrofager været forbundet med opløsning og væv reparation9,10.

Som kroppen gennemgår metabolisk stress, ophobes hvidt fedtvæv unormalt. Den udvidede fedtvæv tiltrækker og bevarer inflammatoriske celler, der dybt ændrer normal adipocyt funktion for at fremme insulinresistens, hyperglykæmi og i sidste ende type 2 diabetes mellitus, insulinresistens eller hyperglykæmi11, 12. Sideløbende har infiltreret hvidt fedtvæv remodels svar på inflammatoriske signaler udgivet af klassisk aktiveret (M1) fedtvæv makrofager (hæveautomater)13,14. Denne multi-cellulære organ udøver en kaskade af signaler, der derails den normale funktion af andre kroppens organer som f.eks aorta og lever4.

Leveren er en metabolisk kraftcenter, der tilpasser som svar på stimuli med oprindelse fra nærliggende dysregulated WAT15. Hepatisk makrofager eller Kupffer celler, som reaktion på metaboliske ændringer, udskille inflammatoriske cytokiner, der forvandle både parenkymalt og ikke-parenkymalt celle fænotype og fremme af væv remodellering. Hepatisk lipid ophobning, betændelse, overdreven ekstracellulære matrix indskud, nekrose og eventuel funktionen tab følger de inflammatoriske fornærmelser bidrager til det brede spektrum af leverskader forbundet med ikke-alkoholiske fedtlever sygdom 16,17,18.

Parallelt med kompromitteret WAT og leverfunktionen akkumulere store arterier lipider i arterievæggen som kroppen gennemgår kronisk metabolisk stress19. Arteriel lipid ophobning udløser udskillelsen af kemokiner af aktiverede endotelceller og efterfølgende ansættelse af monocytter20. Når rekrutteret, monocytter formere sig, differentiere, indtage lipoproteiner og blive skum celler. Atherogenesis er indledt og påført det pro-inflammatoriske aktivitet af rekrutteret og væv bosiddende lipid-laden makrofager. Bukke under for de ekstracellulære og intracellulære stress signaler videresendes i denne atherogene mikromiljø, indlede disse makrofager derefter en apoptotiske signalering cascade. Som disse skum celler dør, bidrager de deres lipid fyldt indhold til nekrotisk kernen af læsion, som derefter fører til plaque brud, myokardieinfarkt og slagtilfælde.

Kollektivt, orchestrates heterogenitet af makrofag fænotyper delvis fedme induceret af inflammatoriske observerede ændringer i dysregulated væv såsom WAT, leveren og aorta8,21. Karakterisering af rekrutteret og væv bosiddende makrofager kunne give indsigt i potentielle molekylære mål, at manipulerer makrofag fænotype1. Du kan faktisk karakterisere makrofager fra fedme-induceret betændt væv, kan en enkelt celle suspension fås gennem enzymatisk nedbrydning. Sådanne dissociation protokoller skal være effektiv i tilstrækkeligt nedværdigende bindevæv samtidig minimere immun celledød og giver optimal celle udbytte. Enzym blandingen er afhængig af typen af væv og dens strukturelle fyldes op. Elastiske væv som aorta kræver stærkere enzymatisk aktivitet, i forhold til leveren og WAT, at opnå væv dissociation. Fra enkelt cellesuspension, kan væv bosiddende makrofager utvetydigt karakteriseret eller isoleret for videre downstream analyse såsom transcriptional profilering.

Her er en væv-specifik protokol beskrevet der bruger collagenase-afhængige væv fordøjelse og polykromatisk flowcytometri effektivt isolerer og karakteriserer væv-resident makrofager fremstillet af traditionel kost induceret fedme, åreforkalkning, enkle steatose og steatohepatitis musemodeller. Samtidige farvning af celle overflade markører med antistoffer mod leukocyt-(CD45 og/eller CD11b) og makrofag - (F4/80) specifikke antigener er ofte bruges til at identificere makrofag populationer22. Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) er en kraftfuld strategi, der anvendes til at sortere disse identificerede befolkninger på høj renhed. Den sorterede befolkning kan derefter evalueres for fænotype bestemt gen profiler ved hjælp af downstream Molekylær analyse (såsom kvantitative realtid polymerase chain reaction)23. Selv om standard flowcytometri og flow flowcytometri-baserede celle sortering er stærke værktøjer i skelne makrofager inden for en meget heterogen cellesuspension, skal de tidligere protokoller optimeres for at sikre vellykket output. I denne undersøgelse, er protokoller, at effektivt isolerer og karakteriserer levedygtige væv specifikke makrofager beskrevet; vigtigere er, giver denne undersøgelse afgørende indsigt i tekniske spørgsmål, der ofte opstår, samt proaktiv og trouble-shooting strategier til at forebygge og/eller løses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller (afsnit 1, 1.2 og 1.3) blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) ved Pennsylvania State University.

Væv Dissociation buffere forberedelse Endelige volumen Opbevaring
Hvidt fedtvæv (WAT) Dissociation Buffer: 2,5% HEPES, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA), 3 mg/mL (0,3%) Collagenase Type II i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 4,5 g/L glukose uden L-glutamin og natrium pyruvat 500 mL minus 80° C (10 mL alikvoter)
Leveren 25 x Perfusion Buffer koncentrat (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH i destilleret deioniseret vand H2O 500 mL minus 20° C (40 mL alikvoter)
Bevarelse Buffer (PRB): 1% BSA i 1 x Perfusion Buffer 1 L 4 ° C
Dissociation Buffer: 1 x Perfusion Buffer suppleret med 4.76 mM CaCl2 og 72 U/mL Collagenase Type IV 50 mL (pr. mus) Forberede umiddelbart før brug
Aorta Dissociation Buffer: 125 U/mL Collagenase Type XI, 60 U/mL Hyaluronidase skriver jeg, 60 U/mL DNase, 450 U/mL Collagenase Type I, 20 mM HEPES i 1 x fosfat Buffered saltvand (PBS) 500 mL minus 80° C (10 mL alikvoter)

Tabel 1: Væv specifikke perfusion buffer opskrifter.

1. Vævscentre Isolation og Dissociation

  1. WAT Isolation og Dissociation
    1. Forberede de væv-specifikke buffere ifølge tabel 1, og gemme dem som beskrevet.
    2. Forbered de følgende reagenser.
      1. Forbered fordøjelsen buffer ved optøning det passende mængde af WAT dissociation buffer og opbevares ved 4 ° C indtil brug. Umiddelbart før anvendelsen, varm buffer til 37 ° C. Forberede FACS buffer ved at forberede 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 2% føtal bovint serum (FBS).
    3. WAT Isolation
      1. Aflive en mus i en kuldioxid (CO2) fyldte kammer. Check for effektiviteten inden fortsætter til dissektion fase.
      2. Dyp de aflivede mus kort i et bægerglas, der indeholder 70% ethanol indtil grundigt gennemblødt og belagt med ethanol. Placer musen ventrale overflade op på stadiet dissektion og fastgør mus forgrunden og bagpoterne til dissektion bestyrelsen ved hjælp af 21 G nåle.
      3. Bruge medium punkt spids pincet til at forstå den abdominale hud forreste urinrørets åbning, så brug skarpe dissekere saks til at gøre en nick i greb abdominal huden.
      4. Indsæt de nederste blade af saksen i de små indsnit mellem hud og bughinden og lave et tværgående snit fra maven til brystkassen.
      5. Forsigtigt trække sig tilbage i huden for at afsløre den intakte bughulen og gøre en tværgående snit gennem bughinden og enten fold tilbage den gennemsigtige membran eller punktafgifter væv for at udsætte den abdominale WAT.
      6. Indsamle de perigonadal fedtpuder, som beskrevet i Mann et al. 24
        1. Perigonadal fedtpuder i mandlige mus er løst bundet til epididymis og testiklerne. Først Find testiklerne og derefter med medium punkt pincet, gribe fat i epididymis hovedet og træk forsigtigt.
        2. Bruger skarpe dissekere saks, punktafgifter hver epididymis fedt pad ved at skære langs overfladen af epididymis (hoved, krop og hale) og testiklerne.
        3. Med pincet, forsigtigt trække på det fedt pad mens skære gennem bindevævet direkte bundet til epididymis struktur.
        4. Brug af pincet, fast greb i slutningen af fedt pad proksimalt for epididymis og forsigtigt skræl det fedt pad fra gonaderne
        5. I hunmus er perigonadal fedtpuder løst bond til livmoderen kroppen og uterin horn.
        6. Ved hjælp af medium punkt pincet, greb perigonadal fedtvæv og træk forsigtigt væv fra livmoderen kroppen og uterin horn.
        7. Punktafgifter hver fedt pad ved at skære langs livmoderen kroppen og uterin horn ved hjælp af skarpe dissekere saks.
      7. Placer fedt puder i en petriskål fyldt med PBS og holde på isen for at holde væv fugtig.
    4. Dissociation af WAT i enkelt celle suspensioner
      1. Fjern overskydende PBS fra petriskålen og bruge en enkelt kant barberblad til hakkekød abdominal WAT i små stykker.
      2. Med den skarpe kant af barberblad, forsigtigt skrabe hakket abdominal WAT ind i en mærket 15 mL polypropylen indsamling rør indeholdende 2 mL WAT dissociation buffer.
      3. Inkuber dette væv-fordøjelse buffer blanding under langsom kontinuerlig rotation ved 37 ° C i 45 min.
      4. Filtrer fordøjet vævet gennem en 70 µm celle si ind i en 50 mL indsamling rør mens du flytter gummi stemplet af en sprøjte stemplet i en cirkulær bevægelse og fortsat sigtes cellesuspension gennem filteret.
      5. Afpipetteres 2 mL af Dulbecco's modificerede Eagle Medium (DMEM) til en 15 mL collection tube, forsigtigt afpipetteres op og ned og vask filteret med enkelt-celle suspension.
      6. Vask filteret to flere gange med koldt DMEM og placere enkelt cellesuspension på is.
      7. Der centrifugeres cellesuspension ved 300 x g ved 4 ° C i 8 min.
      8. Bruge en vakuum indsugningsventil omhyggeligt fjerne flydende adipocytter (først) og resterende supernatanten. Sørg for ikke at forstyrre den pelleted stromale vaskulære fraktion (SVF).
      9. Med 1.000 µL pipette, igen forsigtigt suspendere pellet i ammoniumklorid-kalium (ACK) buffer til at lyse erytrocytter ifølge producentens anvisninger.
      10. Fortyndes de ovenstående cellesuspension med DMEM og centrifugeres cellesuspension ved 300 g ved 4 ° C i 8 min.
      11. Genopslæmmes celler i kolde PBS indeholdende 2% FBS (FACS Buffer) og tælle cellerne i en Burker kammer/hemocytometer.
      12. Overføre enten 1 x 106 celler (for grundlæggende flowcytometri) eller hele cellesuspension (for FACS) til mærket 5 mL runde-bunden polystyren rør. Fortsætte til afsnit 2 i flowcytometri farvning protokol.
  2. Levervævet Isolation og Dissociation
    Bemærk: Denne protokol blev tilpasset fra Smedsrød25.
    1. Forberede de væv-specifikke buffere ifølge tabel 1 og gemme dem som beskrevet.
    2. Forbered de følgende reagenser.
      1. Forberede 1 x Perfusion Buffer (PB), ved at fortynde 40 mL af PBC i 960 mL ultrarent H2O. pre varm en sprøjte fyldt med 50 mL PB ved 37 ° C, lige før perfusion starter. Eliminere enhver nuværende luftbobler.
        1. For at fjerne luftbobler, invertere sprøjten hvor leur lås spids peger opad. Tryk på eller svirp sprøjten, indtil luftboblerne er at den øverste pf sprøjten. Tryk forsigtigt på stemplet at udvise luften
      2. Forbereder fordøjelsen buffer ved fortynding af 0,5 mL af 476 mM CaCl2 løsningtil 49,5 mL 1 x Perfusion buffer. Tilføj 3600U Collagenase Type IV til 4.76 mM CaCl2 -PB løsning. Pre varm en sprøjte fyldt med 50 mL af fordøjelsen buffer ved 37 ° C, lige før perfusion starter. Eliminere enhver nuværende luftbobler, som beskrevet i trin 1.2.2.1.1.
      3. Forberede bevarelse Buffer (PRB) ved at opløse 2,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 250 mL 1 x perfusion buffer. Opbevares ved 4 ° C eller holde på køl indtil brug.
      4. Forberede FACS Buffer med 1 x PBS og 2% FBS.
    3. Levervævet Isolation
      1. Aflive en mus af CO2 kvælning, mætte mus med 70% ethanol til at forhindre forurening af tilbageløbet organer med pels.
      2. Position i mus ventrale side op på en polystyren skum dissekere bestyrelsen og sikre musen forgrunden og bagben poter til dissektion bestyrelsen ved hjælp af 21 G nåle.
      3. For at udsætte thorax væggen og bughulen, forstå abdominal huden i nærheden af urinrørets åbning ved hjælp af en mellemlang punkt spids pincet. Brug derefter en skarp dissekere saks til at oprette et lille snit på greb abdominal huden.
      4. Indsæt de nederste blade af saksen i de små indsnit mellem hud og bughinden og lave et tværgående snit fra lysken til hage.
      5. Forsigtigt trække sig tilbage i huden for at afsløre intakt bughulen og thorax væggen, lave et tværgående snit gennem bughinden og punktafgifter membranen.
      6. Lift brystbenet og omhyggeligt incise mellemgulvet, skal du sørge for ikke at forstyrre den ringere vena cava (IVC). Flytte de gastrointestinale organer til side og Find den subhepatic IVC. Bruge hæmostatisk pincet til at klemme suprahepatic IVC at opretholde lokaliserede perfusion.
        Bemærk: Overdreven ophobning af visceral hvidt fedtvæv kan ofte maskere IVC. For at bedre visualisere dette fartøj, et lille område af fedtvæv ved siden af IVC kan være skåret ud. Vinduet indridset inden for den bøjelig fedtvæv kan derefter placeres over IVC til at eksponere skib til cannulation.
      7. Fastgør sprøjte fyldt med pre varmede PB til 23 G blod samling og infusion sæt. Tryk forsigtigt på stemplet, indtil slangen og nål er fyldt med PB.
      8. Indsæt 23 G kanyle, parallelt med niveauet af den subhepatic IVC. Sikre nål på plads ved hjælp af en 4 cm hæmostatisk klemme.
        Bemærk: Cannulation af subhepatic IVC foretrækkes i kost-fed mus, idet IVC kan være bedre visualiseret og kanylerede inden for det fedt-fyldte hulrum.
      9. Tryk forsigtigt på stemplet at begynde perfusion, farve vil hurtigt skylle fra leveren (højre lap først) Hvis nålen placeres korrekt i fartøjet. Udvidelsen af lapper er også synlig, hvis nålen er indsat korrekt i den subhepatic IVC.
      10. Straks skæres portåren til at tillade PB til at flyde frit gennem leveren.
      11. Perfuse i leveren, indtil blodet er ikke længere synlig. Lejlighedsvis forsigtigt massere lever lapper mellem fore-finger og tommelfinger til at lette perfusion.
        Bemærk: Det er vigtigt at bruge ikke-savtakkede stumpt kantet værktøjer til at håndtere lever for at forhindre vævsskade.
      12. Når 5 mL PB forbliver inden for sprøjten, ændre at sprøjte fyldt med pre varmede dissociation buffer. Forstyr ikke placeringen af sikrede nålen i løbet af denne tid.
        Bemærk: Forstørret lever væsentligt overstiger 1,5 g bør være perfunderet med en større volumen af pre varmede fordøjelsen buffer til at garantere succes lever dissociation.
      13. Perfuse lever indtil fuldt fordøjet. Blidt massage lever lapper for at lette perfusion.
        Bemærk: Adskillelse af Glissons kapsel fra parenkym er observerbare i en korrekt fordøjet leveren. For at vurdere dette, skal du bruge sløve kanten af et par pincet, at forsigtigt trykke på den venstre laterale lap. Et indtryk skal vises på overfladen og indrykningen skal fylde langsomt når pincet er fjernet.
      14. Fjern nålen fra den subhepatic IVC. Fjern ikke den hæmostatisk pincet fastspænding suprahepatic IVC.
      15. Punktafgifter hele leveren ved at forsigtigt skære gennem tilslutning ledbånd ved hjælp af et kort lige klinge dissekere saks og fjerner galdeblæren.
      16. Placere hele leveren i en 10-cm petriskål indeholdende 10 mL iskold bevarelse Buffer og butik på 4 оC indtil klar til at befri celler.
    4. Levercelle Dissociation
      1. Overføre leveren til en 10 cm parabol som indeholder 10 mL iskold DMEM.
      2. Greb de afhuggede suprahepatic IVC tilknyttet skåret leveren ved hjælp af et tandet pincet. Brug medium punkt pincet til at frigive celler fra den Glisson kapsel ved at anvende hurtige strøg bevægelse på hver lap.
      3. Passere den mættede DMEM gennem en 70 µm celle si knyttet til en 50 mL collection tube.
      4. Afpipetteres 10 mL iskold DMEM til 10 cm petriskål og gentage trin 1.2.4.1 til 1.2.4.3 indtil media mætning er ikke længere overholdes. Sted cellesuspension på is eller ved 4 ° C.
      5. Forsigtigt blandes cellesuspension af invertere indsamling rør og derefter centrifugeres ved 54 x g i 2 min. ved 4 ° C.
      6. Indsamle supernatanten i en ren 50 mL collection tube. Derefter centrifugeres cellesuspension ved 54 x g i 2 min. ved 4 ° C.
      7. Gentag trin 1.2.4.6 to ekstra gange, før du fortsætter til trin 1.2.4.8.
      8. Overføre supernatanten til en ren 50 mL-indsamling rør og centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      9. Re suspendere ikke-parenkymalt celle pellet i FACS buffer og tælle dem i en Burker kammer/hemocytometer.
      10. Overføre 1 x 106 celler (for grundlæggende flowcytometri) eller 15 x 106 - 20 x 106 celler (for FACS) til mærket 5 mL runde-bunden polystyren rør. Fortsætte til afsnit 2 i flowcytometri farvning protokol.
  3. Aorta Isolation og Dissociation
    Bemærk: Denne protokol blev tilpasset fra slagteret al.26
    1. Forberede de væv-specifikke buffere baseret på de opskrifter, der er fastsat i tabel 1 og gemme dem som beskrevet.
    2. Forbered de følgende reagenser.
      1. Forbered fordøjelsen buffer ved optøning det passende mængde af WAT dissociation buffer og opbevares ved 4 ° C indtil brug. Umiddelbart før anvendelsen, varm buffer til 37 ° C.
      2. Forberede en 10 x heparin løsning ved at opløse heparin natriumsalt i 1 x PBS ved en koncentration på 200 U/mL. Fortynde 10 x heparin stamopløsning med 1 x PBS til at forberede en 1 x Heparin løsning. Gemme den 10 x og 1 x Heparin løsninger ved 4 ° C indtil brug.
      3. Forberede FACS Buffer med 1 x PBS indeholdende 2% FBS.
    3. Aorta dissektion
      1. Aflive en mus i en CO2-fyldt kammeret og skyl med 70% ethanol.
      2. Placer musen ventrale side op på stadiet dissektion, sprede mus forgrunden og bagpoterne og fastgør dem til dissektion bestyrelsen ved hjælp af 21 G nåle.
      3. Umiddelbart efter euthanizing musen, udføre hjerte punktering. Henvise til trin 1.3.3.4 til 1.3.3.9, hvis nødvendigt.
      4. Lokalisere formet som et sværd proces i den lavere ende af sternum
      5. For at gøre det, placere en finger midtpunkt langs bredden af dyrets hals. Spore langs den ventrale midterlinjen fra hals til caudale slutningen af brystbenet, indtil en bruskspidserne udvidelse kan mærkes.
      6. Bruge medium punkt pincet til at forstå den bruskspidserne forlængelse, og om nødvendigt markerer placeringen af formet som et sværd proces ved at fjerne plasteret af hår eller hud på området.
      7. Delvist indsætte en 26 G kanyle under formet som et sværd proces i 20-30° vinkel.
      8. Forsigtigt negativt pres på sprøjten ved at langsomt trække stemplet, derefter indsætte nålen yderligere i hulrummet indtil blodet flyder.
      9. Hvis blodgennemstrømningen stopper, langsomt rotere nålen eller flytte lidt i og ud.
      10. Brug par pincet til at gribe fat i abdominal huden foran urethrae åbning, og brug et par skarpe dissekere saks til at skære langs den ventrale midterlinjen gennem bughinden fra lysken til hage.
      11. Trække sig tilbage i huden for at udsætte abdominale organer og rib bur med fingre eller stumpe pincet flytte forsigtigt abdominale organer til side.
      12. Brug pincet til at gribe fat i formet som et sværd proces, løfte brystbenet og incise mellemgulvet.
      13. Ved hjælp af dissekere saks, skære igennem de laterale ribben på begge sider. Gribende brystbenet, flip brystkassen opad og skære igennem den tilsluttende base. Fjerne brystkassen udsætter de underliggende thorax organer.
      14. Perfuse aorta med en 26-gauge kanyle tilknyttes en 10 mL-sprøjte fyldt med 1 x heparin løsning ved at indsprøjte 1-2 mL af opløsning i den venstre hjertekammer (LV) af hjertet.
        Bemærk: Sørg for at perfuse med en langsom hastighed med lidt pres for at sikre intakt aterosklerotisk aorta læsioner.
      15. Punktafgifter thymus, lunger og bindevæv. Henvise til trin 1.3.3.16 og 1.3.3.17, hvis nødvendigt.
        1. Foran hjertet finde den hvide bi-fligede (eller butterfly formet) orgel og fast grab fat i thymus med pincet. Træk begge kamre opad fra hulrummet og klip i bunden med saksen.
        2. At fjerne lungerne, Knib en lunge lap med pincet, træk væv fra brysthulen og klip i bunden. Gentag for hver resterende lap.
      16. Bruge en dissektion mikroskop og mikro-dissekere værktøjer, og indsamle de aorta arch (herunder den innominate arterie, venstre fælles halspulsåren og venstre subclavia arteria), den stigende, faldende thorax og abdominale aorta.
        1. Find den opstigende aorta på venstre hjertekammer af hjertet.
        2. Med et par af buede 0.07 x 0,04 mm-spids fatte pincet forsigtigt del af den opstigende aorta emerging fra venstre hjertekammer.
          Bemærk: I forhold til de omkringliggende gul-farvet fedtvæv, vil aorta være en lyse hvide fartøj med oprindelse fra LV når tilstrækkeligt skyllet med heparin løsning.
          1. Hvis aorta ikke var ordentligt skyllet af cardiac perfusion, skylle aorta igen mens aorta er stadig forbundet til hulrummet. For at gøre det, skære nær hjertet-aorta krydset, Fjern hjertet og derefter skære vandret gennem den nederste ende af den abdominale aorta. Indsæt en 26 G kanyle i åbningen af den opstigende aorta og forsigtigt flush aorta med 1 x heparin løsning.
          2. Forsigtigt slæbebåd på den opstigende aorta til bedre diskriminere mellem fedtvæv og integrerede aorta.
          3. Stadig forsigtigt trække på den opstigende aorta, brug spidsen af lukkede foråret dissekere saks til at fjerne det fedt, der indkapsler den opstigende aorta og aortabuen. Det gør du slagtilfælde fedtvæv med spidsen af lukkede saks vinger til at rive væk den tilsluttende fedt.
            Bemærk: Afstå fra udtagelse nogen fedtvæv ved at skære indtil den opstigende aorta og arch kan visualiseres tydeligt. Dette er at forhindre skære aorta.
          4. Hvis den opstigende aorta og arch kan være klart afgrænset fra surround fedtvæv, bruge foråret dissekere saks til punktafgifter overskydende fedt.
          5. Forsigtigt gribe fat i aortabuen med pincet. Igen ved hjælp af foråret saks spids, slagtilfælde på fedt langs længden af den faldende, thorax og abdominale aorta til caudale slutningen af den abdominale aorta, gøre det på højre side af ærmet af fedt.
          6. Fortsætte med at forstå langs aorta, når rives væk fedt. Sørg for at gøre så forsigtigt for at forhindre skadelige aorta.
          7. Træk forsigtigt aorta opad mod mikroskopet, så fedt er nu placeret bag aorta.
          8. Indsæt lukkede saks vinger mellem fedt-aorta interface nær den forreste ende af den nedadgående aorta, svær det fedtvæv tilknytning til aorta's overflade af rent ud ved hjælp af en fejende bevægelse.
            Bemærk: Grundigt at fjerne overskydende fedt og forbinder væv, mens aorta er stadig i hulrummet anbefales.
          9. Punktafgifter hjertet og skæres i caudale slutningen af den abdominale aorta paa tvaers. Fjerne hele aorta.
          10. Placer aorta i en 35 mm parabol og drille væk eventuelle overskydende fedt på aorta ved hjælp af to 21-gauge nåle. Placer skåret aorta i 1,7 mL microcentrifuge tube på is.
    4. Dissociation af Aorta i enkelt celle suspensioner
      1. Med pipette overfoeres 0,2 mL aorta dissociation buffer til glasset indeholdende aorta. Indsætte foråret saks vingerne mod den tilspidsede ende af røret og hurtigt hakkekød aorta for at lette Enzymatisk nedbrydning.
      2. Overføre væv-løsning blandingen til en 15 mL collection tube og pipette 1,8 mL aorta dissociation buffer for en samlet maengde paa 2 mL.
        Bemærk: For overførsel af væv suspension, skåret i 1 cm fra den tilspidset ende af en standard 1.000 µL pipette tip. Bruge den forkortede tip til at overføre suspension med en mikropipette.
      3. Inkuber hakket aorta i aorta dissociation buffer for 55 minutter ved 37 ° C, rysten på 220 rpm (0.514 x g).
      4. Passere suspension gennem 50 µm celle si i en 15 mL polypropylen collection tube. Bruge gummi stempel af en sprøjte stemplet til at lette filtrering.
      5. Skyl 15 mL collection tube med 1 mL FACS buffer, indsamle suspension og passere gennem celle si.
      6. Vask 50 µm celle sien to ekstra gange med 1 mL FACS buffer.
      7. Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Genopslæmmes celler i kolde FACS Buffer. Tælle celler i en Burker kammer/hemocytometer.
      8. Overføre enten 1 x 106 (for grundlæggende flowcytometri) celler eller hele cellesuspension (for FACS) til en mærket 5 mL runde-bunden polystyren rør. Fortsætte til afsnit 2 i flowcytometri farvning protokol.

2. flyde flowcytometri og FACS farvning

Fluorophore R-Phycoerythrin (PE) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blå (488 nm) / gule (561-570 nm) - grøn (532 nm) Blå (488 nm) / gule (561-570 nm) - grøn (532 nm) Blå (488 nm) / gule (561-570 nm) - grøn (532 nm) Violet (405 nm)
ExcitationMAX (nm) 496 496 496 401
EmissionMAX (nm) 578 785 667 455
Fænotypisk markør F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX Integra, integrin αX kæde, CR4, p150, ITGAX ΑM Integra, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Målrettet celletype Væv bosiddende makrofager Klassisk aktiveret (M1) makrofager Monocytter / makrofager Leukocytter (makrofager / monocytter, lymfocytter og granulocytter)
Delmængde af dendritiske celler Dendritiske celler, NK-celler, aktiverede T-celler og en delmængde af intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) Granulocytter, dendritiske celler, NK-celler og delmængder af T- og B-cellerne
Fortyndingsfaktoren 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Isotype kontrol PE rotte IgG2a PE/Cy7 armenske Hamster IgG PE/Cy5 rotte IgG2b Pacific Blue rotte IgG2c

Tabel 2: Liste over fluorophore mærkede antistoffer specifikke for kræsne væv bosiddende makrofager.

  1. Indsamle og udarbejde følgende elementer: FACS Buffer 5 mL runde-bunden polystyren rør, anti-mus CD16/32 Fc receptor blokerende antistof, fluorophore konjugeret eller ukonjugeret primære antistoffer, fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer (hvis nødvendige), 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    Bemærk: For farvning store mængder af celler, antistof koncentration er mest kritiske i stedet for celle nummer. For eksempel, hvis farvning 10 x 106 celler farvning buffer volumen og antistof koncentration bør være den samme som hvis farvning 1,0 x 10 celler6 i 100 µL buffer volumen. 8 celler, øge antistof 5-fold anbefales til farvning 1,0 x 10.
  2. Tilføje yderligere iskold FACS Buffer til hver FACS tube, hvis nødvendigt, pellet celler ved centrifugering ved 751 x g i 5 min (4 ° C). Opsug den supernatanten følgende centrifugering.
  3. Tilføje anti-mus CD16/CD32 Fc receptor blokerende antistof mod alle prøveeksemplarer efter fabrikantens anvisninger. Inkuber i 15 min. ved 4 ° C eller på is.
  4. Tilføj fluorophore-konjugeret primære antistof til cocktail direkte til Fc receptor blokerende antistof-holdige celle suspension og inkuberes prøver ved 4 ° C i 30 min. Protect prøver fra lys til at minimere blegning af fluorophore-konjugerede antistoffer.
    1. I tilfælde af ukonjugeret primære antistoffer blev brugt, Følg disse trin efter at fuldføre trin 2.4.
    2. Vask primære antistof farves prøver ved centrifugering ved 751 x g i 5 min (4 ° C).
    3. Fjern supernatanten ved dekantering og genopslæmmes pellet i 100 µL FACS buffer.
    4. Tilføje konjugeret sekundær antistof til alle nødvendige prøver og Inkuber i 30 min. ved 4 ° C. Fortsæt til trin 2,5.
  5. Følgende antistof inkubation, tilsættes 2 mL af is kold FACS buffer så pellet celler ved 751 x g i 5 minutter (4 ° C). Dekanteres og sørg for ikke at forstyrre pellet.
  6. Bland celler forsigtigt og derefter genopslæmmes med 200-400 µL af FACS buffer, derefter holde det i mørke ved 4 ° C indtil standard flow flowcytometri analyse eller celle sortering.
  7. For kort sigt fiksering af farvede celler, Fortsæt til trin 2.8 til 2.10. Bruge fiksering til standard flowcytometri kun.
  8. Umiddelbart efter trin 2.5, genopslæmmes celler i 0,5 mL 2-4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til 15-30 min i 4 ° C.
    Bemærk: Advarsel: PFA er en kendt irriterende med kræftfremkaldende og giftige virkninger. Når du bruger PFA, håndtere med ekstrem omhu. Sørg for at bruge den passende personlige værnemidler og udsugning.
  9. Følgende fiksering, vask celler ved at tilføje 2 mL FACS buffer til alle prøver og centrifugeres ved 751 x g i 4 ° C i 5 min. Fjern supernatanten følgende centrifugering.
  10. Resuspend fast celler i 200 µL af is kold FACS buffer og opbevares ved 4 ° C. Butik fix celler op til 1 uge på 4 ° C, ideelt udføre flow flowcytometri erhvervelse inden for 48 timer at minimere autofluorescence.
  11. Erhverve flow flowcytometri data efter flow forskellige producentens anvisninger eller udføre fluorescerende aktiveret celle sortering som beskrevet af Basu mfl. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du bruger apolipoprotein E mangelfuld (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) mus opretholdt en høj fedt højt kolesterol kost (HCHFD eller HCD) til 18 uger, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ aorta makrofager kan isoleres, når der er to stikprøver samlet. Lever dissekeret fra HFHCD-fed ApoE KO mus, produceret større end 5 x 105 sorteret Kupffer celler (som afhænger af tilgængelige sorterings tid). Når du bruger højt fedtindhold kost (HFD) fodret vildtype (WT) C57BL/6 mus, kan 5 x 105 til 1 x 106 bosiddende fedtvæv makrofager (hæveautomater) sorteres fra de stromale vaskulære brøkdel (SVF). Den nævnte samlede antal makrofager, der kan sorteres fra en given væv var tilstrækkelige til at udføre gen expression analyse ved hjælp af kvantitative realtid polymerase kædereaktion (qPCR). For væv hvor færre antal makrofag populationer er genoprettet, såsom aorta, anbefales det at bruge Co precipitants (for eksempel glykogen) og overnight nedbør når isolere RNA er behov for disse analyser.

Her, flow virkningerne af kost-induceret stofskiftesygdomme på makrofag fænotype ved hjælp af grundlæggende flowcytometri, fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og downstream indlæg sorter analyser er vist. Disse resultater underbygger tidligere offentliggjorte bemærkninger, mus fodret en HFD eller HFHCD udviser øget infiltration af klassisk aktiveret (M1) makrofager i berørte væv som aorta (figur 1B). At drage fordel af flowcytometri, FACS og gen expression profilering (via kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR), overvejende fænotype for Ron receptor tyrosin kinase-udtrykker CD45+ F4/80+ makrofager stammer fra væv isoleret fra kost-fed mus blev observeret. Ron receptor udtryk for aorta makrofager, som viste en anti-inflammatorisk fænotype var faldet i HFHCD-fed mus (figur 1 c og D). Sorterede Ron receptor-udtrykker makrofager afledt af fordøjet aortas påvist øget arginase 1 (Arg1) genekspression, som er en veletableret M2 makrofag markør (figur 1E). Pro-inflammatoriske makrofager, der blev karakteriseret som CD45+ F4/80+ CD11c+ blev øget i aortas isoleret fra HFHCD-fed mus (figur 1B og D). Kendetegner leveren-resident makrofager yderligere belyst de fremherskende Fænotypen af Ron receptor-udtrykker delpopulationer (figur 2A). CD11c + pro-inflammatoriske makrofag populationer udviste et fald udtryk af gener, der er stærkt forbundet med en anti-inflammatoriske (M2) fænotype som Arg1 og Ron (figur 2B). Lignende tendenser blev observeret i makrofag populationer isoleret fra fordøjet hvidt fedtvæv (figur 3). Makrofag befolkning med en pro-inflammatoriske signatur viste nedsat overflade udtryk for Ron receptor (figur 3). Ved at kombinere de tilgange, grundlæggende flowcytometri og FACS, resulterede i afgørende data, der yderligere validerer Ron receptor som en regulator af alternative (M2) aktivering i makrofager32. Sådanne bias mod en anti-inflammatoriske (M2) fænotype har vist en beskyttende rolle i udvikling og progression af fedme, åreforkalkning og steatohepatitis31.

Figure 1
Figur 1: Karakterisering af makrofager isoleret fra dissocierede aorta fjernet fra ApoE KO mus opretholdt på et HCD til 18 uger. (A) celler blev først låge på CD45+ leukocytter, undtagen celleaffald. (B) CD45 farvning i forbindelse med F4/80 bruges til at afgrænse dobbelt positive populationer formodes at være makrofager. Yderligere gating blev brugt til at vise procentdelen af CD11c+CD45+F4/80+ (M1) og (C) Ron+CD45+F4/80+ (potentielle M2) makrofager i aortas stammer fra mus fodret på enten en normal chow eller højt kolesterol kost for 18 uger. (D) steg andelen af CD11c+CD45+F4/80+ (M1) makrofager, samt en nedsat procentdel af Ron+CD45+F4/80+ (potentielle M2) makrofager blev observeret i aortas afledt fra mus fodret HCD sammenlignet med mus fodret med en normal chow kost. (E) gen expression analyse af sorterede Ron+CD45+F4/80+ makrofager påvist øget udtryk for arginase jeg (en velkendt murine M2 markør). Værdier blev opnået ved hjælp af Student's t-test analyser udføres ved hjælp af statistisk analyse software og repræsenteret som betyder ± SEM. P < 0,05 blev anset for statistisk signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur er blevet ændret fra Yu et al. (2016) 31. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: gen udskrift profilering af Kupffer cellepopulationer sorteret fra fordøjet lever dissekeret fra ApoE KO mus opretholdt på et HCD til 18 uger. (A) almindelige gating ordning for kendetegner og sortering Kupffer cellepopulationer. (B) gen expression analyse af sorterede Ron udtrykker (Ron+) og ikke-udtrykke (Ron-) CD45+F4/80+ makrofager ved kvantitativ RT-PCR. Student's t-test analyser blev udført ved hjælp af statistisk software og værdier var repræsenteret da betyde ± SEM. P < 0,05 blev anset for statistisk signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur er blevet ændret fra Yu et al. (2016) 31 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af pengeautomater isoleret fra hvidt fedtvæv dissekeret fra WT BL6 mus fodret en HFD til 18 uger. (A) almindelige gating ordning for kendetegner og sortering fedtvæv afledt makrofag populationer (B) procent af Ron + celler inden for CD45+F4/80+CD11c- og CD45+F4/80+CD11c+ makrofag populationer sorteret fra WAT. Figur er blevet ændret fra Yu et al. (2016) 31 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kost-induceret stofskiftesygdom modeller, der efterligner Co-morbiditeter såsom åreforkalkning, enkle steatose, steatohepatitis og type 2-diabetes er flittigt brugt til bedre at forstå de underliggende molekylære mekanismer for sygdomsprogression. Collagenase afhængige fordøjelsen er ofte bruges til at adskille væv for at befri celler fra ekstracellulære matrix (ECM)16,27. Enzymer såsom collagenase forstyrre kollagen, som giver strukturel støtte for tilstødende celler. Væv strukturelle sammensætning dikterer væv matrix stivhed (modstand mod deformation) og hvilket rå collagenase produkt er mest effektiv for at sikre vellykket ECM forstyrrelser28. WAT, som er sammensat af "blød matrix" er ofte fordøjes med Collagenase Type II at befri adipocytter og bosiddende immunceller samtidig samtidig bevare integriteten af celle overflade insulin receptorer29. Mikroarkitektur fibril komponenter af aorta bidrager til "stiv matrix", som effektivt aorta fordøjelse med collagenase type XI (som har den højeste collagenase aktivitet) bruges i kombination med ekstra enzymer. I modsætning til aorta bruger leveren fordøjelsen en collagenase med en svagere enzymatisk aktivitet, Collagenase Type IV, at forstyrre matrixen og befri levedygtige parenkymalt og ikke-parenkymalt celler30. Kronisk betændte væv stammer fra kost-fed vildtype eller apolipoprotein E mangelfuld (ApoE KO) mus på en C57BL6 baggrund ofte undergår en remodeling, der kan forhindre korrekt enzymatisk fordøjelse. Dette afsnit vil diskutere strategier for at minimere og/eller fjerne muligheden for forkert væv dissociation og lav celle opsving.

Et fælles træk ved væv stammer fra kost-fed musemodeller, der efterligner fedme, åreforkalkning, og/eller ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, er abnormt væv remodellering. I hvidt fedtvæv, aorta, og leveren ændres ECM sammensætning, hvilket ofte resulterer i overdreven aflejring af fibrillar komponenter såsom collagens. Vildtype C57BL6 mus opretholdt på en høj fedt diæt for 18 uger, opleve væv-specifikke abnormiteter såsom udvidet hvidt fedtvæv og udvidet fedtlever (simpel steatose). Ofte gange disse metaboliske funktioner er ikke generende forhindringer at overvinde i løbet af væv dissociation processen. På den anden side i andre kost induceret modeller, der afspejler mere forværret fænotyper, kan den omfattende ombygning af væv udgøre et problem under væv fordøjelsen. HFHCD fodres ApoE KO mus er ofte brugt til model åreforkalkning og steatohepatitis. Et fælles træk forbundet med avancerede steatohepatitis er overdreven aflejring af ECM i leveren (eller fibrose). Fibrotisk leveren har vist sig at være ganske problematisk under enzymatisk væv dissociation og ofte producerer lav celle udbytte31. For at forbedre celle udbytte, er det kritisk, at protokollerne fordøjelsen følges uden afvigelse. Selv om normal lever kan være hakket og neddykket i fordøjelsen buffer til at opnå dissociation, maksimerer perfusion med fordøjelsen buffer kontakt mellem den ekstracellulære matrix af leveren og collagenase løsning; og derfor denne tilgang kan varmt anbefales. Derudover er 20-30 mL af fordøjelsen buffer ofte et passende volumen for vellykket dissociation af normal lever; med hensyn til musen modeller, der udvikler udvidet og/eller fibrotisk lever, er perfusion med 50 mL af fordøjelsen buffer foretrukket at sikre ordentlig fordøjelse og minimere celledød. Lever med vægte, der betydeligt overstiger 1,5 g, anbefales øge mængden af fordøjelsen buffer for at sikre vellykket fordøjelsen.

Væv Problem Mulig årsag Løsning
Hvidt fedtvæv (WAT) Dårlig celle dissociation Dårlig fordøjelse Sørg for fordøjelsen buffer er på 37° C
Celledød Overdreven collagenase fordøjelsen Reducere tid med fordøjelsen
Reducere mængden af fordøjelsen buffer
Aorta Dårlig celle dissociation Dårlig fordøjelse Sørg for fordøjelsen buffer er ved 37 ° C
Aorta stykker i fordøjelsen buffer var for stor Sørg for aorta er skåret i ca 1 mm stykker
Aorta stykker ikke ryster i dissociation buffer under inkubation Sørg for aorta stykker ryster i opløsningen fordøjelsen
Celledød Overdreven collagenase fordøjelsen Reducere tid med fordøjelsen
Reducere mængden af fordøjelsen buffer
Leveren Dårlig celle dissociation Dårlig fordøjelse Sørg for fordøjelsen buffer er ved 37 ° C
Øge mængden af fordøjelsen buffer
Forkert cannulation af IVC (hævelse af væv omkringliggende IVC opstår) Være sikker på, at nålen er indsat korrekt i IVC
Bristet IVC Korrekt sikker nål i IVC før perfusion
Reducere perfusion hastighed
Bristet væv Reducere perfusion hastighed
Celledød Forkert version af celler fra den Glisson kapsel Vær sikker på at tage celler fra kapsel ved hjælp af tidligere drøftet strøg metode
Overdreven collagenase fordøjelsen Reducere tid med fordøjelsen
Reducere mængden af fordøjelsen buffer

Tabel 3: fejlfinding af mislykkede væv dissociation. Flow flowcytometri baseret celle sortering eller FACS er en effektiv teknik til at isolere cellepopulationer hvor høj renhed er en nødvendighed. Når rensende celler af cellen sortering, kræver at opnå høj celle udbyttet, men også en høj renhed form brug af en korrekt sortering strategier. I dette afsnit, metoder til forbedring af multi-fluorophore flow flowcytometri-baserede celle sortering af væv bosiddende makrofag stammer fra kost-fed mus er beskrevet. For forskellige væv bosiddende makrofag isolation er overflade markør udvælgelse et kritisk skridt. Makrofager stammer fra WAT, aorta, og leveren er ofte kendetegnet ved hjælp af en CD45+, CD11b+, F4/80+ gating strategi. Yderligere flow cytometric paneler kan bruges til at identificere væv bosiddende makrofager. Disse paneler omfatter antistoffer, som sonden til den overflade udtryk for makrofag specifikke glycoproteiner (CD64, CD68 og CD14), store histocompatibility komplekser (MHCII) og apoptotiske celle tyrosin kinase receptorer (MerTK)32, 33. specifikke makrofag fænotype kan derefter være afgrænset af sondering for selektiv overflade udtryk for M2 (CD163, CD209 og CD206) eller M1 markører (CD38, CD40, CD80 og CD86)34,35. Auto-fluorescens genereret af lipid-laden makrofager kan præsentere nogle problemer, når gating populationer. Ved hjælp af antistoffer markeret med fluorokromer der er ophidset af gul-grøn laser (såsom PE, PE/Cy5, PE/Cy7) eller rød laser (såsom APC, APC Cy7) resulterer i udsendte fluorescens, der er betydeligt lysere end auto-fluorescens og dermed kan forbedre resultater36. Når du vælger fluorophore konjugater med sådanne høje farvning indeks og potentiale emission spectra overlapning, er inddragelse af passende kontrol kritisk. Når du identificerer gating grænser, integration af enkelt plet (SS) kontrol og isotype kontrol giver mulighed for afgrænsning af positive/negative befolkninger og måling af ikke-specifik baggrund signal forårsaget af primære antistoffer, henholdsvis 37. for omstændigheder hvor celler er knappe, vi anbefaler at bruge kompensation partikler for SS og isotype kontrol. Kompensation partikler typisk udsender lysere signaler end biologisk kontrol og også har mindre afvigelse i baggrunden fluorescens. Derudover fluorescens minus én (FMO) kontrolelementer er ideelle til skildrer gating grænser. Af herunder FMO kontrol, afsløres den maksimale fluorescens forventet for en farvning delmængde i en given kanal, når specifikke for særlig fluorescens kanalen fluorokrom-mærket antistof er udelukkede38. Vores erfaring, udover enkelt farvede kompensation partikel Kontroller, skal en unstained biologiske sammenligning kontrol medtages for fastsættelse af mere præcise positiv/negativ grænser.

Eksklusive celleaffald og celle aggregater i gating-strategien er også en ekstra metode bruges til at minimere auto-fluorescens. For at skelne cellular vragdele fra befolkningens levedygtig celle, er ved hjælp af forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) den mest almindelige gating strategi. For isolerede celler, der skal bruges til post slags analyser og kræver højere levedygtighed for DNA/RNA ekstraktioner, anbefales det, at levedygtighed pletter ikke bruges med alle procedurer, fiksering og/eller permeabilization. Formaldehyd fastsættelse af celler kan kompromittere nukleinsyre integritet på grund af nukleinsyre-protein crosslinking og dermed begrænse isolation effektivitet, nøjagtig kvantificering og registrering. Celle aggregater som tidligere nævnt ikke kun bidrage til udsendte auto-fluorescerende signaler, men også resultere i "tilfældighed afbryder". Sådan sker for at opretholde høj renhed i en slags men hvis alt for hyppige, det reducerer det sorterede celle udbytte. Sortering buffer (FACS buffer) suppleret med DNAse og MgCl2 i celle farvning kan minimere celle sammenlægning. Det anbefales ikke at bruge EDTA i kombination med DNAse, da det hæmmer det enzym aktivitet. Filtrering af enkelt cellesuspension gennem en 70 µm celle si før sortering kan også befri celler fra aggregater. Det er vigtigt at bemærke, at celle suspensioner for at minimere sammenlægning, bør være i en koncentration på 5 millioner celler pr. mL i en mindstemængde af 0,4 mL. Celler isoleret fra lipid laden væv tendens til at være mere tilbøjelige til akkumulering og dette kan resultere i tilfældighed afbryder og lave sorter udbytte. Det anbefales, at fortyndes prøver yderligere, hvis sammenlægning fortsætter. Sorterede makrofager kan afhentes i polypropylen runde-bunden indsamling rør indeholdende føtal bovin rig medium for at maksimere celle opsving. En høj FBS begyndelseskoncentration sikrer celle opsving, da koncentrationen i sidste ende bliver fortyndet med hver sorteret slipværktøj. Til indsamling af celler, der skal bruges til DNA eller RNA analyser, kan celler sorteres direkte ind i den relevante udvinding reagens (f.eks. TriZol) at forhindre RNAse forurening. Når du sorterer store mængder, anbefales sortering celler først til kultur medier suppleret med lavere koncentrationer af FBS. Umiddelbart efter sortering, celler bør derefter pelleted og mængden for DNA/RNA udvinding. Den isolerede genetiske materiale kan derefter blive profileret for ændrede genekspression. Pro-inflammatoriske gener herunder TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 og MCP1 (CCL2) er ofte upregulated i makrofager udstiller en klassisk aktiveret (M1) fænotype39. På den anden side alternativt aktiveret (M2) fænotype i makrofager er ofte præget af induktion af gener kodning Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 og TGFβ34,40. For nylig, CD38, Fpr2 og Gpr18 er blevet valideret som M1-specifikke gener og c-Myc og Egr2 som M2-specifikke gener34.

Selv om multi-farve flow flowcytometri-baserede celle sortering er et værdifuldt redskab til at isolere makrofager på høj renhed, kan denne tilgang være dyrt. De stærke fordele af FACS medieret sortering er afhængige af operations personale, der kan manøvrere en celle sorteringsanlæg ud over de høje omkostninger ved celle sorteringsanlæg vedligeholdelse reagenser. Alternative metoder kan bruges i erstatning for dyre flow flowcytometri baseret celle sortering. De omfatter magnetisk aktiveret celle sortering (Mac) eller tæthed gradient centrifugering. Den første alternative celle sortering metode nævnt omfatter magnetiske og/eller microbead kolonne isolation kits til separate celler af interesse fra blod eller solid væv41. Den anden celle sortering tilgang adskiller en heterogen cellesuspension baseret på tæthed og kraft af centrifugering. Desværre, tæthed medieret centrifugering er ikke praktisk for isolere makrofager fra aorta - eller WAT-afledte enkelt celle suspensioner. Oftentimes, produkt fremstillet af differential centrifugering er forurenet, og for lavt udbytte. Mindre væv (f.eks aorta eller WAT), der resulterer i nogle celler i første omgang efter enzymatisk fordøjelsen er derfor ikke ideelle kandidater til differentieret centrifugering. På den anden side kan celle suspensioner afledt af dissocierede lever producere et passende antal sorteret makrofager, der kan bruges i indlæg slags forsøg og analyser som kultur stimulering, qPCR eller western blotting analyse. Disse alternative tilgange kan også bruges til at berige populationer før FACS, giver mulighed for renere former. Af note udgør væv bosiddende makrofager en lille procentdel af hele cellen befolkningen i WAT, leveren og aorta. Berigelse af celler før FACS sortering har været en metode, der benyttes når isolere befolkningsgrupper af cellen, som er mindre hyppige. Et spørgsmål, som er fælles i isolere små populationer er store cellen tal skal behandles for at få nok celler til efterfølgende analyse. Berigelse eller forsortering kan bruges til at løse et problem. Denne metode aids i at opnå en mere præcis befolkningen i celler gennem valg af positive og negative, men det giver også bevarelse af tid som FACS sortering kan være en varig proces for tætte væv kilder såsom leveren.

Seneste fremskridt inden for betændelse biologi fremhæve betydningen af fænotypiske og funktionelle karakterisering af makrofag heterogenitet til en yderligere forståelse af den komplekse rolle, disse immunceller i reguleringen af kronisk betændelse. Kort sagt, giver denne omfattende protokol en flerdimensional tilgang til at karakterisere væv bosiddende makrofager fra tre hallmark væv studerede i etablerede kost induceret fedme og inflammation modeller. Endnu vigtigere denne protokol tages hensyn til vanskeligheden og de noedvendige foranstaltninger for at isolere ren enkelt celle suspensioner fra dysregulated betændt væv såsom WAT, aorta plaques og overfedede. Protokollen gør det muligt for forskeren at anvende flowcytometri og FACS sortering værktøjer i en innovativ dimension til at karakterisere væv bosiddende makrofager, centrale regulatorer af betændelse i fedme. Dybdegående karakterisering af makrofag populationsdynamik kan give indsigt i monocyt menneskehandel betændt væv og giver mulighed for fortsatte mekanistiske evalueringer gennem en lang række eksperimentelle metoder på sorteret makrofager. Yderligere karakterisering af makrofag befolkninger kan give en central indsigt i de biologiske fundament, der regulerer makrofag heterogenitet i sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at videregive.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Flow flowcytometri Core facilitet på The Pennsylvania State-Universitet Millennium videnskab Complex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics