Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler produceret af jern begrænsede mykobakterier
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Mycobacterium tuberkulose viser øget produktion og frigivelse af ekstracellulære vesikler som reaktion på lave jern forhold. Dette arbejde beskriver en protokol til generering af lave jern forhold og metoder til rensning og karakterisering af mykobakterielle ekstracellulære vesikler frigivet som reaktion på jernmangel.
Transcript
Denne metode tillader dyrkning Mycobacterium tuberkulose under strenge lave jernbetingelser og rensende membran vesicles fra den lave jernkultur filtrat. Fordi jern begrænsning er kendt for at stimulere membran vesicle produktion, denne protokol giver høj overflod af ren membran vesikler, der kan udnyttes til yderligere biokemiske eller funktionelle analyser. Når vi demonstrerer protokollen ved hjælp af Mycobacterium smegmatis, den ikke-virulente stamme, kan denne protokol følges i BSL-2 faciliteter ved hjælp af Mycobacterium tuberkulose, den virulente stamme.
Til at begynde, forberede en liter minimal medium ved at opløse fem gram monopotassium fosfat, fem gram L-asparagine, 20 milliliter glycerol, og to gram dextrose i 900 milliliter deioniseret vand i en plastbeholder. Juster pH-chloren til 6,8 med fem normale natriumhydroxid og juster lydstyrken til en liter med deioniseret vand. Derefter tilsættes 50 gram metal chelaterende harpiks og forsigtigt omrøres ved hjælp af en magnetisk røre bar i 24 timer ved fire grader Celsius.
Den næste dag, stoppe omrøring og lad harpiks sediment i ca 30 minutter. Den resterende harpiks steriliseres og fjernes fra opløsningen ved filtrering gennem en 22 mikronfilterenhed med en plastikmodtager. Nu, supplere minimal medium med 0.5 milligram per liter zinkchlorid, 40 milligram per liter magnesiumsulfat, og 0.1 milligram per liter mangan sulfat.
Inokuler en enkelt koloni MTB i to milliliter mycobakteriel bouillon medium suppleret med ADN berigelse. Inkubere med omrøring ved 37 grader Celsius. Når der er synlig vækst, udtrækkes to milliliter af kulturen og mål OD 540 på et spektrofotometer.
Stop inkubationen, når OD 540 når 0,8, hvilket angiver den sene logaritmiske fase. Spred 200 mikroliter af den sene logaritmiske kultur på mycobakterielle agar plader suppleret med 0,2 glycerol, 0,5% Tween 80, og ADN. Inokuler mindst fem plader.
Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius. Og efter en uge er bakterievæksten synlig som et sammenløbslag. Derefter våd en steril vatpind i et lavt jern minimalt medium.
Brug denne podepind til at indsamle bakterier fra agarpladerne. Inokuler bakterierne i 100 milliliter lavt jern minimalt medie i et rør. Indsamle tilstrækkelige bakterier til at forberede en suspension med en OD 540 af en.
Fortynd suspensionen 10 gange til en liter med lavt jern minimalt medium og del den i to sterile plastflasker. Dernæst overføre to milliliter af kulturen til en fem milliliter kultur rør. Der tilsættes 10 mikroliter med 10 % volumen efter volumentyloxapol.
Inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius i 14 dage. Overfør kulturen til fem 225 milliliter koniske centrifugerør og centrifuge ved 2, 850 gange g i syv minutter ved 20 grader Celsius. Opsaml kultursupernatanten med en 50 milliliterpipette, og filtrer den steriliseres gennem et 0,22 mikronfilter.
For at isolere MEV'er skal kulturfiltratet overføres til et omrørt celle ultrafiltreringssystem placeret ved fire grader Celsius og filtreres koncentratet ved et tryk på mindre end 50 PSI gennem en 100 kilodalton cutoff-membran. Derefter centrifuge den koncentrerede kultur filtrat ved 15, 000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius og indsamle supernatant i polycarbonat ultracentrifugering rør. Centrifuge supernatant ved 100, 000 gange g i to timer ved fire grader Celsius.
Derefter fjernes supernatanten og opsbruges de membranøse pellets i i alt en milliliter steril PBS ved skånsom pipettering. Bland 0,5 milliliter pellet suspension med 1,5 milliliter 60% iodixanol opløsning i bunden af en polypropylen tynd walled ultracentrifuge rør. Overlejr denne MVE iodixanol 45%suspension med en milliliter på 40%35%30%25% og 20% iodixanol opløsninger og en milliliter PBS øverst.
Centrifuge ved 100, 000 gange g i 18 timer ved fire grader Celsius. Brug derefter en en milliliter Hamilton-sprøjte til at indsamle de ene millilitertæthedsgradfraktioner, der starter fra toppen. Hver opsamlet fraktion fortyndes til 20 milliliter med PBS og centrifugeres ved 100,000 gange g i to timer ved fire grader Celsius.
Fjern supernatanten og resuspend i 0,5 milliliter PBS. Opbevar rørene ved fire grader Celsius. For at udføre membran lipid analyse, kombinere 10 mikroliter af hver gradient fraktion med fluorescerende membran sonde TMA-DPH ved en endelig koncentration af et mikrogram per milliliter i 50 mikroliter af PBS i hver brønd af en 96-godt sort plade.
Inkuber pladerne ved 33 grader Celsius i 20 minutter. Fluorescensen måles ved 360 nanometer for excitation og 430 nanometer for emission. I denne protokol blev MEVs renset ved differentialsedimentering i en tæthedsgradient.
Under de beskrevne betingelser blev MEVs for det meste adskilt i gradient fraktion tre, som svarer til 25% iodixanol. Vesicle-associerede proteiner var koncentreret i fraktion tre vist ved dot blot analyse. Negativ farvning bekræftede også tilstedeværelsen af MEVs i fraktion tre og nanopartikel analyse viste størrelsen af MEV var omkring 100 nanometer.
Protein og lipid koncentration normaliseret til koloni danner enheder viste en ca otte gange stigning i MEV udbytte i lavt jern i forhold til høje jernforhold. Dot blot analyse viste et mere intenst signal fra MEV-associerede markører i densitet gradient fraktioner fra jern begrænset MTB kultur end fra jern tilstrækkelig MTB kulturer. Følg instruktionerne for fremstilling af minimal medium for at sikre jern begrænsede betingelser og forhindre forurening af membranen vesikler med lipoprotein aggregater.
Den mykobakterielle membran vesicles renset på denne måde kan bruges til biokemisk karakterisering og funktionel analyse.
Tags
Immunologi og infektion mycobakterier vesikler jernmangel sekretion membran virulens isolationRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
