在斑马鱼胚胎人乳腺癌细胞的侵袭行为

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

在这里,我们将介绍使用两个不同的注射部位, 卵周隙和居维叶管道,调查侵入行为,并分别评估人类乳腺癌细胞的血管内和外渗潜力,异种移植模型斑马鱼。

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Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

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Abstract

在许多情况下,癌症病人不要原发性肿瘤的死亡,而是转移的原因。尽管众多的啮齿动物模型可用于体内研究癌症转移,需要其它有效的,可靠的,低成本的模型来快速访问的(EPI)的遗传变化或药理学化合物的潜在影响。因此,我们说明和解释采用注入斑马鱼胚胎,以支持这一目标的人类乳腺癌细胞异种移植模型的可行性。在显微镜下,荧光蛋白或化学标记的人乳腺癌细胞移植到转基因斑马鱼胚胎,TG(FLI:EGFP),在受精后48个小时的卵周隙或居维叶(DOC)的导管。不久之后,癌细胞侵袭,传播和转移在活鱼体内的时空处理在荧光显微镜下观察。使用不同的注射部位, 模型每ivitelline空间或文件是彼此互补,这反映了早期(血管内步骤)和晚期事件的多步转移级联的(外渗工序)。此外,瘤周和瘤内血管生成可与注入卵周隙被观察到。整个实验时间不超过8天。这两种模式相结合的细胞标记,微移植和荧光成像技术,使癌转移的快速评估响应于遗传学和药理学操作。

Introduction

在临床上明显的癌转移包括一系列被称为“转移级联”复杂和多步事件。级联已经被广泛审查,并可以分割成连续的步骤:局部浸润,血管内,传播,逮捕,外渗,和殖民1,2。更好地了解癌症转移的发病机理和潜在的治疗策略体内的发展需要癌细胞扩散的强大的主机型号。啮齿动物模型已经非常成熟和被广泛用于评估转移3,但是这些方法效率低和道德的限制和昂贵的最前沿模型,以确定一个特定的操作是否会影响转移表型。需要其他高效,可靠,低成本的模式,以快速访问(EPI)的遗传变化或pharmacolog的潜在影响的iCal化合物。由于其较高的遗传同源性,人类和他们的胚胎斑马鱼( 斑马鱼 )的透明度已经成为一个重要的脊椎动物模型,并正在越来越多地应用于发育过程,微生物-宿主相互作用,人类疾病,药物筛选方面的研究4。建立在斑马鱼的癌转移模型可以提供一个答案的啮齿动物模型5,6的缺点。

虽然自发瘤形成在野生斑马鱼7几乎看不到,有几种技术长期以诱导所希望的癌症在斑马鱼。致癌物诱导的基因中的突变或信号传导途径的激活可以在组织学和分子模型癌变,在斑马鱼7,8,9模仿人类疾病。通过德向前荷兰国际集团优势的多样化和反向癌基因或肿瘤抑制基因的基因操作,(转基因)斑马鱼也启用的癌症形成和维持6,10潜力的研究。在斑马鱼的诱发癌症模型涵盖广泛,包括消化,生殖,血液,神经系统和上皮6。

在癌症研究斑马鱼的利用最近扩大归因于这个有机体建立人肿瘤细胞异种移植模型中。这首先与成功,2005年11嫁接在斑马鱼胚胎的囊胚阶段的人类转移性黑素瘤细胞的报道。几个独立的实验室已经通过在不同位点和发育阶段引入哺乳动物癌细胞系不同范围到斑马鱼验证了该开创性工作的可行性5 </ SUP>。例如,胚盘和囊胚期的囊胚注射附近;注射入卵黄囊,卵周隙,居维叶(DOC)的导管,和6-H-后主静脉〜5天龄的胚胎;和注射到30日龄免疫抑制幼虫的腹膜腔中已经执行5,12。此外,还报告了斑马鱼12,13同种异体肿瘤移植。对使用异种移植物的巨大优势是,移植的癌细胞可以很容易地荧光标记,并从正常细胞区分开来。因此,调查的microtumor地层14,细胞侵入和转移15,16,17,肿瘤诱导的血管生成15,1的动态行为8,和癌细胞和宿主之间的相互作用因子17可以在活鱼体被清晰可见,特别是当转基因斑马鱼线被施加5。

通过斑马鱼异种移植物模型的高电位启发来评价转移,我们证明在TG(FLI:EGFP)的尾翼区域不同的乳腺癌细胞系的经血管外渗性质通过文件注射16斑马鱼胚胎。转化生长因子β(TGF-β)16和骨形态发生蛋白的作用(BMP)在促/抗乳腺癌细胞的侵袭和转移19个信号传导途径进行了研究在该模型中。此外,我们还利用概括移植斑马鱼模型与卵周隙注射各种乳腺癌细胞系的血管内的能力进入流通。

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Protocol

使用转基因斑马鱼的荧光TG(FLI:EGFP)所有的研究株(EGFP)已增强型绿色荧光蛋白标记的脉管系统20,包括住房和实验,进行了按照国际准则,并批准由当地机构委员会在莱顿大学医学中心的动物福利(底儿Ethische Commissie(DEC)。

注意:作为总结在图1中,协议被大致分为四个步骤:胚胎收集( 图1A),显微注射( 图1B),筛选( 图1C),并分析( 图1D)。

1.准备注射针头

  1. 准备用硼硅酸盐玻璃微毛细管注射针。把微毛细管到微量牵引装置具有以下设置:空气压力,500,热,650;拉,100;速度,200;时间,40.保存在针保持器板的注射针,直到它们被用于注射。

2.准备注射的荧光灯,遗传标记乳腺癌细胞

  1. 培养的人乳腺癌MDA-MB-231的DMEM高葡萄糖培养基中的细胞在37℃的含有L-谷氨酰胺,10%胎牛血清和1:100的青霉素 - 链霉素(青霉素 - 链霉素)。
  2. 培养物中的乳腺上皮细胞系,MCF10A(M1)和MCF10A-RAS(M2),在37℃在DMEM / F12培养基含有L-谷氨酰胺,5%马血清,20ng / mL的表皮生长因子,10毫克/毫升胰岛素,100纳克/毫升的霍乱肠毒素,0.5mg / mL的氢化可的松,和1:100青霉素 - 链霉素。
  3. 通过共转染PLV-mCherry的,的pCMV-VSVG 21,pMDLg-RRE(GAG / POL)22和PRSV-REV 22质粒导入HEK293T细胞产生的mCherry慢病毒。收获细胞上清液转染,并储存在-80℃下48小时后。
  4. 一世nfect MDA-MB-231,M1及M2的细胞在30%汇合时用慢病毒上清液24小时1:1稀释,在5毫微克/ ml聚凝胺存在正常培养基。
  5. 通过稀释的细胞在96孔板中,这允许分离的细胞克隆的生长,直到获得稳定的mCherry表达细胞系选择单细胞克隆。
  6. 细胞注射的培养一个T75烧瓶中。收获细胞,在用0.5%胰蛋白酶-EDTA处理80%汇合。洗净用1x PBS 2-3倍的细胞。
  7. 重新悬浮细胞在约200 PBS的微升。储存在他们4℃注射前不到5小时。

3.准备斑马鱼胚胎注射

  1. 建立斑马鱼繁殖对收集胚胎,如通过罗森等人以前的朱庇特的文章 23。
  2. 选择在0-4 HPF除去未受精和胚胎异常的胚胎。保持胚胎在Petri DISH全蛋水(60μg/ mL的海盐;〜60个胚/皿)的孵育在28℃。
  3. Dechorionate用细镊子胚胎在48高倍视野。
  4. 通过将它们转移至含有水卵大约2分钟注射前,但不长于2小时注射前40微克/毫升三卡因(3-氨基苯甲酸)麻醉胚胎。
    注:三卡因储备溶液(4毫克/毫升,100×)被制备成400毫克三卡因粉末在97.9毫升双蒸水和2.1毫升的1摩尔Tris碱(pH为9),具有调节至7.4的pH值。商店在-20℃冷冻机中。

4.进样人乳腺癌细胞进入卵周隙

  1. 负载15μL细胞悬浮液到注射针的。安装针到显微操纵器和断绝与细镊子针尖以获得5-10微米的前端开口的直径。
  2. 使用气动picopump和机械手进行显微注射。 AdjuST的picopump注入每次400个细胞。在注射之前,通过注射将细胞在含有1%琼脂糖的培养皿中的顶部手动计数细胞数。
  3. 排队麻醉胚胎(2-3天受精后(DPF))上的平坦的,1%琼脂糖注入板,围绕每个时间10个胚胎。
  4. 定向注射期间由手注入板放置在优选位置上的胚胎插入针( ,对角)。
  5. 指向针尖在注射部位和针尖轻轻插入卵黄囊和斑马鱼胚胎( 图2A)的周皮之间的卵周隙。
  6. 注入大约400 mCherry-标记的肿瘤细胞。确保卵黄囊不破裂,避免注入卵黄囊。

5.注射人乳腺癌细胞到文件

  1. 如所描述的我准备注射针和斑马鱼的胚胎 N协议步骤1,2,和3。
  2. 使用一个45°针的角度,使该文档可从胚胎的背侧接近。
  3. 针插入的文件( 图3A)的起点,只是背侧到管道开始扩大在卵黄囊,并注入大约400个细胞;注射是正确的,如果在管道内的体积的脉冲和卵黄囊后直接膨胀。
    注:连续几个注射可以不提取针来进行。
  4. 转移注入斑马鱼胚胎蛋水。
    存在单独的斑马鱼胚胎中作为相当大的变化,并且如胚胎后可出现注射的死亡,相对大量的斑马鱼胚胎(约100),应与癌细胞注射:注意。
  5. 保持在33℃的斑马鱼的胚胎以容纳鱼和哺乳动物细胞的最佳温度要求。
_title“> 6。屏幕上的注射的胚胎

  1. 筛选荧光立体显微镜下每条鱼在2小时后注射(HPI)为卵周隙注射( 图2)或在2-24 HPI的文档注射( 图2),以确保所有的胚胎都与一个注射类似数量的肿瘤细胞。与注射的错误,如破裂( 图2B)或卵黄囊的注射( 图3B)中取出胚胎,并挑选出具有低于注射的细胞( 图2C图3B),或上述( 图2D 3B)的阈值的胚胎。只保留与文化大约400个细胞胚胎。
  2. 排除该小区由已经在循环与细胞取出胚胎在注射过程中直接引入循环的可能性。此外,除去任何胚胎与质量接近文件的小区( 图2D

7.图像和分析转移过程

  1. 收集几个麻醉胚胎用宽尖端的巴斯德吸管,并将它们传送到聚苯乙烯皿的玻璃底部。
  2. 去除多余的水,并保持蛋水的数量有限。操纵胚胎成位置与头发循环工具放置一个覆盖在玻璃之上。
  3. 与水浸泡或长途干目标组合使用倒置共焦显微镜。胚胎这样的感兴趣区域是接近目标的可能位置。
  4. 立即执行成像麻醉后死亡的风险减少由于液体蒸发。
    1. 在对胚胎的相同位置从EGFP标记的脉管系统和mCherry-标记的肿瘤细胞的捕获信号,以通过合并所述两个成像通道共同寄存器注射血管细胞。
    2. 对于每个斑马鱼胚胎,收集两套不同的图像从头部区域和尾部区域。
  5. 量化播散细胞的数量。
    1. 用于卵周隙注射,计数已经从细胞块散布朝向胚胎鱼体的头部和尾部区域4,15内的细胞中每条鱼的数目;该区域是超出了心脏腔的边界正面,对鱼鳔背部的顶部,超越泌尿生殖开放尾端。
    2. 对于文件注射,计算已侵入尾翼的胶原纤维从循环(MDA-MB-231)的单个细胞或通过在尾部造血组织(CHT)细胞统称(M2)形成簇的数目的数目每个斑马鱼19。
  6. 研究侵袭和转移中,通过使用共聚焦显微镜更详细地(强烈推荐)。
    1. 使用低倍率(4X目标),以图像的全体和以获得肿瘤细胞传播模式的概述。
      注:较高的放大倍数(20X 40X和目标)是适用于研究区域内和肿瘤周围血管生成和传播细胞在胚体的精确定位。
    2. 使用488nm的激光来扫描斑马鱼胚胎脉管系统和一个543纳米的激光来扫描标记有红色荧光植入肿瘤细胞。在八到十步扫描每个胚胎获得高品质的图像。扫描和平均每步六倍。
  7. 小心地将胚胎放回蛋水,如果需要进一步的实验。

8.采用方差(ANOVA)的单向分析进行统计分析,随后是事后分析

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Representative Results

在具有周隙注射胚胎异种移植物模型的斑马鱼,标记的癌细胞在鱼体内的血行播散被认为是活性迁移。这个过程可以被检测到并在荧光显微镜下进行定量,如上述方法中所述。为了说明这一点异种移植模型中,我们遵循不同的乳腺癌细胞系的具有根据体外体内小鼠研究,包括良性正常乳腺上皮M1细胞,HRAS转化癌前已知的(或不加)浸润/转移潜在传播过程中M2细胞和高度转移性的MDA-MB-231细胞,每天1次后喷射(dpi)的向前。高分辨率共焦显微图像表明,MDA-MB-231细胞(红色)显示出侵袭性的表型,并在卵周隙边界不规则。伪足状突起和侵入方面也经常存在 ( 图4A,左)。少数细胞散布到血液循环早1个dpi的( 图4A,右)。在2 DPI,在鱼的远侧部分中观察到清晰的传播( 图4A,右)。弥散性细胞的数量在3 dpi的( 图4A4D)进一步增加。相反,当M2细胞在斑马鱼中受到挑战,他们后2 dpi的( 图4B)显示出在鱼体适度传播。他们还发现增加了传播后时间的推移( 图4F)。 如图4C4G中所示,M1细胞很少散发到斑马鱼循环,并且在观察期的卵周隙内连活动的本地迁移是不频繁的。在M1细胞团在原来的注射部位几乎被拘留。如果在鱼主体限定正面传播或转移为> 5个细胞SS = “外部参照”> 4,在分别为92%和鱼的57%时,观察到MDA-MB-231和M2细胞转移,在3 DPI( 图4G)。相比之下,与M1细胞中观察到没有正面传播。因此,人肿瘤细胞的进展此斑马鱼模型准确地反映在小鼠中不同细胞的转移潜力的相对水平。新血管形成(绿色),其从胚胎斑马鱼的肠下丛发芽和穿透MDA-MB-231或M2细胞块也肿瘤细胞的卵周隙注射,然后温育( 图4A4B的3天后本,左)。与传播残疾一致,被在M1细胞植入( 图4C)仅检测到轻微的新血管形成。

在具有mCherry-标记的MDA-MB-231细胞中的胚胎异种移植模型斑马鱼和文件注射,实验室ELED癌细胞在斑马鱼的尾鳍都被认为代表活性外渗。的mCherry-标记的MDA-MB-231细胞以2 DPF注射。在3个DPI,细胞开始迁移出船只尾翼,其富含胶原蛋白。单MDA-MB-231细胞迁移的一个接一个,独立于容器,向远处尾翼( 图5A)。在6个DPI,侵袭可以通过计数迁移到尾翼组织细胞的数量进行定量。在mCherry-标记M2细胞文件注射模型,所述注射也以2 DPF进行。然而,在有源外渗过程中观察到聚集的表型。在1个DPI,M2细胞开始从血管到斑马鱼的CHT迁移出来。在2 DPI,迁移的细胞M2开始形成在CHT( 图5B)的容器之间的集群。在CHT区域M2侵袭细胞簇数的定量可以在进行6个dpi的。

图1
图1: 用于研究乳腺癌细胞在胚胎斑马鱼侵入行为主要步骤。 (A)过夜交叉亲斑马鱼后,TG(FLI1:EGFP)斑马鱼胚胎收集第二天早晨和保持在28℃。 (B)将胚用立体显微镜48小时后受精(HPF)下细镊子dechorionated。收集标记的乳腺癌细胞,并重新悬浮在PBS中的量小。精心制备后,悬浮的细胞装入一个针。大约400个细胞注射到围卵腔的居维叶(DOC)的立体显微镜下所述管道。在注射的胚胎保持在33℃。 (C)2小时后喷射(HPI),将胚胎进行CA荧光体视显微镜下reful筛选。将胚维持在33℃下进行3或6天。期间的时间间隔,将胚进行设计的治疗。检测到(D)癌细胞传播通过卵周隙注射或入侵文件注射,计数,并通过共聚焦显微镜3或6天注射后(dpi)的成像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2: 卵周隙注射部位和常见错误。 (A)约400 mCherry-标记的细胞(MDA-MB-231)注射到卵周隙。注射的亮区(最上面的),绿血管(中上),和红细胞团(中间低级)ED斑马鱼的胚胎通过共聚焦显微镜捕获。三个通道的合并图像(最下层)表示在胚胎的细胞块的立体位置。 (B)的细胞没有适当地定位的卵周隙。卵黄囊呈破裂。 (C)注射细胞低于阈值(远小于400)。 (D)注射的细胞在阈值以上(远远超过400)。细胞块太接近居维叶的导管,其具有宽的血液流。比例尺=50μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3: 居维叶(DOC)注射的所述管道的概述。在DOC注射的(A)在原理后2天受精(DPF)与乳腺癌细胞在斑马鱼胚胎。箭头指示的文件。 (B)阳性的注射的例子,大约有400乳腺癌细胞;负注射剂,包括卵黄misinjection;并注射于4 HPI细胞的一个不正确的数。箭头和圆圈表示注射的细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4: 各种乳房细胞系中的传播能力的比较。大约400 mCherry-标记的MDA-MB-231,MCF10Aras(M2),或MCF10A(M1)细胞注射到斑马鱼胚胎48 HPF的卵周隙。注入的胚胎,随后3天。 (A,B,C)高RESOlution显微照片,显示MDA-MB-231(A),M2(B)的代表性的迁移和传播过程中,并且在个人胚胎体1,2 M1(C)细胞中,3天注射后(DPI)。左,在卵周隙(红色)和肿瘤周围和肿瘤内血管(绿色)细胞迁移。黄色信号指示微血管和细胞的重叠。中东,胚胎的整体形象。右键,在胚胎后播散细胞的可视化。黄色箭头指示单弥散性细胞。比例尺=50μm以下。 (D,E,F)在1,2,和3 DPI在每个胚胎体传播的细胞数的定量。结果表示为平均值±SEM。从随后事后分析方差分析(ANOVA)的单向分析结果示。 P <0.05被接受为统计学显著(* 0.01 <P <0.05; ** 0。001 <P <0.01; *** P <0.001。 (G)在1,2,和3 dpi的血管内对MDA-MB-231,M2及M1细胞胚胎体的发生率的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5: 在用居维叶注射的导管斑马鱼MDA-MB-231和M2细胞转移的不同的行为。 (A)斑马鱼的代表性共聚焦图像,然后在3,4,和5 DPI以显示MDA-MB-231细胞在斑马鱼中的单细胞迁移行为。箭头指示迁移出血管进入尾翼侵入MDA-MB-231细胞。比例尺=200μm的左列中,在右列50微米。 (B)代表斑马鱼的共焦图像,接着在1,2,和3 DPI以显示在斑马鱼M2细胞的细胞簇迁移行为。箭头指示迁移出血管对于尾部造血组织(CHT)和形成于血管之间的簇侵入M2细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在这里,我们描述了两个方法来研究乳腺癌细胞中的Tg(FLI1:EGFP)的侵入行为斑马鱼的胚胎,同卵周隙和Doc注射。通过注射标记有化学染料或荧光蛋白引入转基因斑马鱼胚胎癌细胞,侵袭和转移的动态和空间特性可以清楚地在实时的在荧光显微镜下的单细胞或群集水平跟踪。在大多数情况下,转移的斑马鱼中的快速进展确保所述测定法可以在1周内移植之后进行。此外,强大的统计数据可以与鱼的大同伙获得。

早期和晚期的事件转移级联的,可以模拟和癌细胞注入分别卵周隙或文件,概括。卵周隙是鱼的周皮和卵黄囊,其异体之间的密闭空间WS一个以监测来自于活体的主站点单个肿瘤细胞的传播。植入后,癌细胞经历卵周隙内的局部迁移和侵袭(被认为是主站点),然后他们intravasate进入血管,并与循环传播一起。在头部和尾翼(考虑遥远的靶位点),肿瘤细胞堆积在狭窄的毛细血管床和外渗。因此,在在鱼体内的远端部位中发现的细胞的数量是转移性能力的测量。此外,更多的渗出细胞可以在稍后的时间点,这也是文件注射试验的真正被观察到。

在DOC是放大共同主静脉具有广泛的血液流24。直接靶向文件作为注射部位引入了癌细胞进入循环系统。在实践中,乳腺癌细胞通过扩散在整个胚胎体文件注射后血流瞬间。然后将细胞阻滞于尾静脉和背主动脉。外渗,侵入和微转移的形成可以依次在6天内观察到。如先前所报道的16,转移性MDA-MB-231细胞和恶变前乳腺M2细胞表现出不同的表型的侵入。 MDA-MB-231细胞经历的富胶原基质尾翼的单细胞的入侵。因此,MDA-MB-231细胞的侵袭电势可以通过计数已外渗和侵入尾翼组织细胞的数量来测量。与此相反,M2细胞形成不同大小的簇和经历CHT的集体入侵。通过计数在这个协议中的簇的数目定量M2细胞的侵袭能力是困难的,优选地通过使用共焦显微镜使3D图像和确定簇的肿瘤细胞的体积进行。

在肿瘤细胞微技术挑战注射成功靶向卵周隙或文件。大量的胚胎的微注射是一个繁琐的过程需要高度熟练的和患者操作。有助于在个人鱼的结果变化的因素包括胚胎的发育阶段喷射的情况下,在注射的细胞的数量的差异,并且细胞的漏入卵黄囊。虽然少见,操作可能无意地穿透脉管系统和直接引入细胞进入循环系统,特别是在卵周隙注射。为了进一步减少的变化,并确保分析的可靠性,显微镜检查是必要的,在整个过程中的时间点,排除不合格的鱼。此外,蒙蔽分析由专业不设置的知识强烈建议,以实现公正的量化。

综上所述,我们这里介绍的两款车型上揭示可视化细胞侵入和转移的体内过程,而不侵入性程序。虽然我们只研究了乳腺癌细胞转移方面的潜力两种型号,它们可以被推广到其他类型的癌症。此外,该模型可以在确定的机制和使用(EPI)遗传操纵控制癌细胞转移的新分子靶标更广泛的应用。由于相比于馈送或啮齿动物25的注射斑马鱼胚胎通过小分子化合物的较高渗透性,这两个给出的模型也具有优势的新的潜在的抗浸润/转移的药物的高通量筛选的条款。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

研究TGF-β家族成员是由癌症基因组学中心荷兰的支持。锡济亚·利和匠人通过在莱顿大学的中国留学基金管理委员会4年的研究支持。我们感谢弗雷德·米勒博士(芭芭拉·安Karmanos癌症研究所,底特律,MI,USA)的MCF10A细胞系。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

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