Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

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Cancer Research

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Summary

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

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Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

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Abstract

In vielen Fällen Krebspatienten sterben nicht von einem Primärtumor, sondern wegen der Metastasierung. Obwohl zahlreiche Nagetiermodelle zur Untersuchung von Krebsmetastasen in vivo zur Verfügung stehen, andere effizient, zuverlässig, sind Low-Cost - Modelle benötigt , um schnell die möglichen Auswirkungen von (epi) genetischen Veränderungen oder pharmakologischer Verbindungen zugreifen. Als solche wir veranschaulichen und die Machbarkeit der Xenograftmodellen mit menschlichen Brustkrebszellen injiziert in Zebrabärblingembryonen erklären, dieses Ziel zu unterstützen. Unter dem Mikroskop sind in transgene Zebrafischembryonen transplantiert fluoreszierende Proteine oder chemisch markierte menschliche Brustkrebszellen, Tg (FLI: EGFP), am perivitellinen Raum oder Kanal Cuviers (DOC) 48 h nach der Befruchtung. Kurz darauf der räumlich-zeitliche Prozess der Invasion von Krebszellen, die Verbreitung und die Metastasierung im lebenden Fischkörper wird unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Modelle mit unterschiedlichen Injektionsstellen, dh proivitelline Raum oder Doc ist komplementär zueinander, was das frühe Stadium (intravasation Schritt) und Spätstadium (Extravasation Schritt) der vielstufigen metastatischen Kaskade von Ereignissen. Darüber hinaus kann peritumoralen und intratumorale Angiogenese mit der Injektion in den perivitellinen Raum beobachtet werden. Die gesamte Versuchsdauer nicht mehr als 8 Tage. Diese beiden Modelle kombinieren Zellmarkierung, Mikro-Transplantation, und Fluoreszenz-Bildgebungstechniken, ermöglicht die schnelle Auswertung von Krebsmetastasen in Reaktion auf genetische und pharmakologische Manipulationen.

Introduction

Offenkundige Krebsmetastasen in der Klinik weisen eine Reihe von komplexen und mehrstufiges Ereignissen als „metastatic cascade“ bekannt. Die Kaskade wurde ausführlich überprüft und können in aufeinanderfolgende Schritte zerlegt werden: lokale Invasion, intravasation, Verbreitung, Festnahme, Extravasation und Kolonisierung 1, 2. Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Krebsmetastasen und der Entwicklung von möglichen Behandlungsstrategien in vivo erfordert robuste Host - Modelle von Krebszellen zu verbreiten. Nagetiermodelle sind gut etabliert und werden verwendet , weit Metastasierung 3 zu bewerten, aber diese Ansätze haben eine geringe Effizienz und ethische Grenzen und sind teuer als Vordergrund Modell zu bestimmen , ob eine bestimmte Manipulation des metastatischen Phänotyp beeinflussen könnte. Andere effiziente, zuverlässige, kostengünstige Modelle sind notwendig, um schnell die möglichen Auswirkungen des Zugangs (epi) genetische Veränderungen oder pharmacologische Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen genetischen Homologie zu den Menschen und die Transparenz ihrer Embryonen Zebrabärbling (Danio rerio) haben als ein wichtiges wirbel Modell entstanden und zunehmend auf die Untersuchung von Entwicklungsprozessen angewendet werden, mikroben Wirt - Interaktionen, menschliche Krankheiten, Drogen - Screening, etc. . 4. Die Krebsmetastasen Modelle in Zebrabärbling erstellt wurden, können eine Antwort auf die Mängel von Nagetiermodellen bieten 5, 6.

Obwohl spontaner Neoplasie kaum in Wild Zebrabärbling 7 zu sehen ist gibt es mehr Techniken seit langem des gewünschten Krebs in Zebrabärbling zu induzieren. Karzinogen-induzierte Gen - Mutationen oder Signalwegs - Aktivierung können in menschliche Krankheit Zebrabärbling 7, 8, 9 und histologisch molekular Modell des Karzinogenese, nachahmt. durch taking Vorteil von verschiedenen Vorwärts- und Rückwärts genetische Manipulationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, (transgene) Zebrabärbling hat auch potentielle Studien der Krebsentstehung und Wartung 6, 10 aktiviert. Die induzierten Krebsmodelle in Zebrabärbling decken ein breites Spektrum, einschließlich Verdauungs-, Fortpflanzungs-, Blut, Nervensystem, und epithelialen 6.

Die Nutzung von Zebrabärbling in der Krebsforschung hat sich durch die Etablierung von humanen Tumorzell Xenograftmodellen in diesem Organismus vor kurzem erweitert. Dies wurde zuerst mit humanen metastasierenden Melanom - Zellen berichtet , dass im Jahr 2005 11 an dem Blastulastadium in Zebrabärblingembryonen erfolgreich transplantiert wurden. Mehrere unabhängigen Labors haben die Machbarkeit dieser Pionierarbeit validiert durch ein breites Spektrum von Säugetierkrebszelllinien in Zebrabärbling an verschiedenen Standorten und Entwicklungsstadien der Einführung 5 </ Sup>. Zum Beispiel Injektionen in der Nähe der Blastulascheiben und Blastozyste der Blastulastadium; Injektionen in den Dottersack, perivitellinen Raum, Kanal von Cuvier (Doc) und posterioren Kardinalvene von 6-h- bis 5 Tage alten Embryonen; und Injektionen in die Bauchhöhle von 30 Tage alten immunsupprimierten Larven wurden 5 durchgeführt, 12. Zusätzlich wurden allogenen Tumor Transplantationen auch in Zebrabärbling berichtet 12, 13. Einer der großen Vorteile von Xenotransplantaten ist, dass die transplantierten Krebszellen fluoreszenz kann leicht gekennzeichnet und unterscheiden sich von normalen Zellen. Daher Untersuchungen über das dynamische Verhalten von microtumor Bildung 14, Zellinvasion und Metastasierung 15, 16, 17, tumorinduzierte Angiogenese 15, 18, und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Wirtsfaktoren 17 in lebenden Fischen Körper deutlich sichtbar gemacht werden, vor allem , wenn transgene Zebrabärbling Linien 5 angewendet werden.

Angeregt durch das hohe Potential von Zebrabärbling Xenograftmodellen Metastasierung zu bewerten, haben wir gezeigt , die transvaskulärer Extravasation Eigenschaften verschiedener Brustkrebszelllinien in dem tailfin Bereich von Tg (FLI: EGFP) Zebrabärbling - Embryonen durch Doc Injektionen 16. Die Rolle von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 16 und bone morphogenetic protein (BMP) 19 Signalweg in pro- / Anti-Brustkrebs-Zellinvasion und Metastasierung wurden auch in diesem Modell untersucht. Darüber hinaus haben wir rekapituliert auch die intravasation Fähigkeit verschiedener Brustkrebszelllinien in Umlauf Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit perivitellinen Raum Injektionen.

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Protocol

Alle Forschung , um den transgenen fluoreszierenden Zebrabärbling Tg unter Verwendung (fli: EGFP) Stamm, der die grün fluoreszierendes Protein (EGFP) -markierten Gefäß 20, einschließlich Gehäuse und Experimenten verbessert hat, wurde nach den internationalen Richtlinien durchgeführt und wurde von dem lokalen institutionellen Ausschuß genehmigt Tierschutz (Dier Ethische Commissie (DEC) der Leiden University Medical Center.

HINWEIS: Wie in Figur 1 zusammengefaßt, wird das Protokoll grob in vier Schritte: Besamungs (Abbildung 1A), die Mikroinjektion (1B), Screening (1C), und die Analyse (Figur 1D).

1. Bereiten die Injektionsnadeln

  1. Bereiten Injektionsnadeln mit Borosilikatglas Mikrokapillaren. Legen Sie eine Mikrokapillare in eine Mikropipette Abziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Luftdruck, 500; Hitze, 650; ziehen, 100; Geschwindigkeit, 200; Zeit,40. Halten die Injektionsnadeln in einer Nadelhalteplatte, bis sie für die Injektion verwendet werden.

2. Bereiten Sie die Fluorescent, Genetisch Beschriftete Brustkrebszellen zur Injektion

  1. Kultur menschlicher Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen bei 37 ° C in DMEM-Hochglucosemedium, das L-Glutamin, 10% fötalen Rinderserum und 1: 100 Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep).
  2. Kultur, um die Brust-Epithel-Zelllinien, MCF10A (M1) und MCF10A-Ras (M2), bei 37 ° C in DMEM / F12-Medium, das L-Glutamin mit 5% Pferdeserum, 20 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 mg / mL Insulin, 100 ng / ml Cholera-Enterotoxin, 0,5 mg / ml Hydrocortison und 1: 100-Pen-Strep.
  3. Produzieren mCherry Lentivirus durch Cotransfektion PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 und pRSV-REV 22 Plasmid in HEK293T - Zellen. Erntezellüberstände 48 Stunden nach der Transfektion und bei -80 ° C.
  4. ichnfect MDA-MB-231, M1, M2 und Zellen bei 30% Konfluenz für 24 h mit lentiviralen Überstand, verdünnt 1: 1 mit normalen Kulturmedium in Gegenwart von 5 ng / mL Polybren.
  5. Wählen Einzelzellklone von den Zellen in einer 96-Well-Platte verdünnt wird, die das Auswachsen von isolierten Zellklone ermöglicht, bis die stabilen mCherry-exprimierende Zelllinien zu erhalten.
  6. Kultur eines T75-Kolben von Zellen zur Injektion. Ernte der Zellen bei 80% Konfluenz mit einer 0,5% Trypsin-EDTA-Behandlung. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS 2-3 mal.
  7. Resuspendieren der Zellen in etwa 200 & mgr; l PBS. Aufbewahren bei ihnen 4 ° C für weniger als 5 Stunden vor der Injektion.

3. Bereiten Sie Zebrafischembryonen zur Injektion

  1. Richten Sie Zebrabärbling Brutpaare und sammeln Embryonen, wie in einem früheren JoVE Artikel von Rosen gezeigt et al. 23.
  2. Wählen Sie die Embryonen, die bei 0-4 HPF sind durch die unbefruchteten und abnorme Embryonen zu entfernen. Halten Sie die Embryonen in einer Petri-dish voller Ei Wasser (60 & mgr; g / ml Meersalze; ~ 60 Embryonen / Schale) und bei 28 ° C inkubieren.
  3. Dechorionate die Embryonen mit einer feinen Pinzette bei 48 HPF.
  4. Anesthetize die Embryonen von ihnen zu 40 ug / ml Tricaine (3-Aminobenzoesäure), das Ei Wasser etwa 2 min vor der Injektion, aber nicht länger als 2 h vor der Injektion zu übertragen.
    HINWEIS: Tricaine Stammlösung (4 mg / ml, 100x) als 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 ml doppelt destilliertem Wasser und 2,1 ml 1 M Tris-Base (pH 9), wobei der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Speicher in der -20 ° C Gefrierschrank.

4. Inject menschliche Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum

  1. Last 15 ul der Zellsuspension in eine Injektionsnadel. Montieren die Nadel auf den Mikromanipulator und brechen die Nadelspitze mit einem feinen Pinzette off ein Spitzenöffnungsdurchmesser von 5-10 um zu erhalten.
  2. Verwenden eines pneumatischen picopump und einen Manipulator, um die Mikroinjektion durchzuführen. adjust die picopump 400 Zellen jedes Mal zu injizieren. Vor der Injektion Zählen der Zellzahlen von Hand durch die Zellen auf der Oberseite einer Petrischale mit 1% Agarose einzuspritzen.
  3. Line up narkotisierten Embryonen (2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf)) auf einer flachen, 1% igen Injektion Platte, rund 10 Embryonen jedes Mal.
  4. Ausrichten der Einspritzplatte mit der Hand während der Injektionen , die Embryonen zu versetzen , in der bevorzugten Stellung zum Einführen der Nadel (dh diagonal).
  5. Die Nadelspitze an der Injektionsstelle und sanft die Nadelspitze in den perivitellinen Raum zwischen dem Dottersack und dem periderm des Zebrafischembryos (2A) einzufügen.
  6. Einzuspritzen etwa 400 mCherry-markierten Tumorzellen. Achten Sie darauf, dass der Dottersack nicht Implantation in den Dottersack zu vermeiden zerrissen wird.

5. Injizieren menschlichen Brustkrebszellen in die Doc

  1. Bereiten Sie die Injektionsnadel und Zebrafisch-Embryonen als i beschrieben n Protokollschritte 1, 2 und 3.
  2. Verwenden, um einen 45 ° Winkel Nadel, so dass der Doc von der dorsalen Seite des Embryos angefahren werden.
  3. Die Nadel in den Startpunkt der DOC (Figur 3A), um nur dorsal , wo der Kanal beginnt über den Dottersack verbreiterte und injiziert etwa 400 Zellen; die Injektion ist korrekt, wenn das Volumen innerhalb des Kanals unmittelbar nach dem Impuls und den Dottersack expandiert.
    HINWEIS: Mehrere aufeinanderfolgende Injektionen können, ohne Extraktion der Nadel durchgeführt werden.
  4. Übertragen Sie die injizierten Zebrabärblingembryonen zu Ei Wasser.
    HINWEIS: Da erhebliche Unterschiede gibt es zwischen den einzelnen Zebrabärblingembryonen, und wie der Tod von Embryonen nach der Injektion auftreten kann, eine relativ große Anzahl von Zebrabärblingembryonen (ca. 100) soll mit Krebszellen injiziert werden.
  5. Pflegen die Zebrabärblingembryonen bei 33 ° C, die optimalen Temperaturanforderungen für Fische und Säugetierzellen zu ermöglichen.
_title "> 6. Bildschirm, um die injizierten Embryonen

  1. Bildschirm jeden Fisches unter einem Fluoreszenz - Stereomikroskop bei 2 h nach der Injektion (hpi) für die Injektions perivitellinen Raumes (2) oder bei 2-24 hpi für die Doc - Injektion (Abbildung 2) , um sicherzustellen , dass alle der Embryonen mit einem injiziert ähnliche Anzahl von Tumorzellen. Entfernen Sie die Embryonen mit Injektionsfehlern, wie Brüchen (2B) oder Injektionen (3B) des Dottersackes und auszusuchen Embryonen mit injizierten Zellen unter (2C und 3B) oder über (Figuren 2D und 3B) Schwellenwert liegt. Behalten Sie nur die Embryonen mit etwa 400 Zellen in Kultur.
  2. Schließen die Möglichkeit aus, dass die Zellen direkt in den Verkehr während des Injektionsvorgangs eingeführt werden durch die Embryonen zu entfernen mit Zellen, die bereits im Umlauf. Entfernen Sie auch jeden Embryo mit einer Zellmasse nahe dem Doc (2D

7. Bild und Analysieren des metastatischen Prozesses

  1. Sammle mehrere anästhesiert Embryonen mit einer großen Spitze-Pasteur-Pipette und sie auf dem Glasboden eines Polystyrolschale.
  2. überschüssiges Wasser entfernen und eine begrenzte Menge an Ei Wasser halten. Manipulieren des Embryos in einer Position mit einem Haarschleife Werkzeug und legt eine Abdeckung auf der Oberseite des Glases.
  3. Verwenden eines invertierten konfokalen Mikroskop in Kombination mit wasserEintAuchen oder Ferntrocken Ziele. Positionieren Sie den Embryo, so dass die Region von Interesse ist so nahe am Ziel wie möglich.
  4. Führen Bildgebung unmittelbar nach der Anästhesie der Gefahr des Todes zu verringern durch Flüssigkeitsverdampfung.
    1. Capture-Signale von EGFP-markiertem Vaskulatur und mCherry-markierten Tumorzellen an der gleichen Position auf der Embryonen zusammenzuwirken Registerzellen mit Blutgefäße injiziert, indem die beiden bildgebenden Kanäle zu verschmelzen.
    2. Für jeden Zebrafischembryo, sammeln zwei verschiedene Sätze von Bildernvom Kopfbereich und Schwanzbereich.
  5. Quantifizieren der Anzahl von disseminierten Zellen.
    1. Für perivitellinen Raum Injektionen, zählen die Anzahl der Zellen in jedem Fisch, der von der Zellmasse in Richtung der embryonischen Fischkörper in den Kopf- und Schwanzbereichen 4, 15 verbreitet hat; die Regionen über die Grenzen des Herzens Hohlraum auf der Oberseite der Schwimmblase dorsal und jenseits der urogenitalen Öffnung kaudal frontal.
    2. Für die Doc-Injektion, um die Anzahl der einzelnen Zellen zählen, die die Kollagenfasern des tailfin aus dem Kreislauf (MDA-MB-231) oder die Anzahl von Clustern, die durch Zellen gebildet kollektiv (M2) im kaudalen hämatopoetische Geweben (CHT) von eingedrungenen jeder Zebrafisch 19.
  6. Studium der Invasion und Metastasierung im Detail durch konfokale Mikroskopie (sehr empfehlenswert).
    1. Verwenden geringe Vergrößerung (4X Objektiv) das Bild der ganzenKörper und einen Überblick über die Tumorzelldissemination Muster zu erhalten.
      HINWEIS: Ein stärkere Vergrößerung (20X und 40X Ziele) ist geeignet zur Untersuchung von intra- und peri-tumorale Angiogenese und die genaue Lokalisierung von disseminierten Zellen im Embryo Körper.
    2. Verwenden, um einen 488-nm-Laser den Zebrafischembryo Vaskulatur und einen 543 nm-Laser gescannt implantierten Tumorzellen mit roter Fluoreszenz markierte abzutasten. Besorgen Sie sich ein qualitativ hochwertiges Bild durch Abtasten jeden Embryos in acht bis zehn Schritten. Scannen und im Durchschnitt jeden Schritt sechsmal.
  7. Legen Sie das Embryo wieder in das Ei Wasser, wenn es für weitere Experimente erforderlich ist.

8. Führen Sie Statistische Auswertung mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) , gefolgt von Post - Hoc - Analyse

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Representative Results

Im embryonalen Xenotransplantat Zebrabärbling-Modell mit einer perivitellinen Raum Injektion, die hämatogene Verbreitung von markierten Krebszellen im Fischkörper als aktive Migration betrachtet. Dieser Prozess kann unter einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen und quantifiziert werden, wie oben bei den Verfahren beschrieben. Um dieses Xenograftmodell veranschaulicht, folgten wir den Verbreitungsprozess verschiedener Brustkrebs-Zelllinien mit bekannter (oder ohne) invasion / Metastasierung Potential nach in - vitro- und in - vivo - Maus - Studien, einschließlich der gutartigen normalen Brustepithel M1 - Zellen, HRAS transformierte prämalignen M2-Zellen und hochmetastatisch MDA-MB-231-Zellen, 1 Tag nach der Injektion (dpi) weiter. Ein hochauflösendes Bild der konfokalen Mikroskopie zeigte, dass MDA-MB-231-Zellen (rot) einen aggressiven Phänotyp aufweisen, mit unregelmäßigen Grenzen im perivitellinen Raum. Pseudopodia artigen Vorsprüngen und invasive Fronten waren auch häufig vorhanden (4A, links). Einige Zellen in der Blutzirkulation verbreitet so früh wie 1 dpi (4A, rechts). Bei 2 dpi wurde klar Verbreitung in den distalen Teilen des Fisches (4A, rechts) beobachtet. Die Anzahl der disseminierten Zellen weiter erhöht auf 3 dpi (4A und 4D). Wenn im Gegensatz dazu wurden M2 Zellen in Zebrabärbling herausgefordert, zeigten sie bescheiden Ausbreitung in dem Fischkörper nach 2 dpi (4B). Sie zeigten auch erhöhte Verbreitung nach Zeit vergangen (4F). Wie in 4C und 4G gezeigt, selten M1 - Zellen in Zebrabärbling Zirkulation verbreitet und sogar aktive lokale Migration innerhalb des perivitellinen Raumes wurde während der Beobachtungszeit selten. Die M1 Zellmasse wurde praktisch an der ursprünglichen Injektionsstelle festgehalten. Wenn die Definition positive Verbreitung oder Metastasierung als> 5 Zellen in dem Fischkörperss = "Xref"> 4, MDA-MB-231 und M2 Zellmetastasierung wurde in 92% und 57% der Fische beobachtet jeweils bei 3 dpi (Figur 4G). Im Gegensatz dazu wurde keine positive Verbreitung mit M1-Zellen beobachtet. Daher spiegelt das Zebrabärbling Modell des menschlichen Krebszellfortschreitens genau das relative Niveau des metastatischen Potentials der verschiedenen Zellen in Mäusen. Neovaskularisation (grün) , die von der subintestinalen Plexus des embryonalen Zebrabärbling gekeimt und penetriert die MDA-MB-231 oder M2 - Zellmasse nach der um 3 - tägiger Inkubation (4A und 4B, gefolgt perivitellinen Raum Injektion von Tumorzellen auch vorlag links ). In Übereinstimmung mit der Behinderung in der Verbreitung, wurde nur eine geringe Neovaskularisation bei M1 Zellimplantation (4C) erfasst.

Im embryonalen Xenotransplantat Zebrabärbling Modell mit mCherry-markierten MDA-MB-231-Zellen und der Doc-Injektion, das LaborELED Krebszellen in der tailfin des Zebrabärbling sind aktiven Extravasation als repräsentativ. Die mCherry markierten MDA-MB-231-Zellen wurden bei 2 dpf injiziert. Bei 3 dpi begannen die Zellen aus den Gefäßen in die tailfin zu migrieren, die mit Kollagen angereichert ist. Single MDA-MB-231 - Zellen migrierten einzeln, unabhängig von den Gefäßen, in der fernen tailfin (5A). Bei 6 dpi könnte die Invasion durch Zählen der Anzahl von Zellen quantifiziert werden, die in das tailfin Gewebe migriert. Im mCherry markierten M2 Zelle Doc Injektionsmodell wurde die Injektion auch bei 2 dpf durchgeführt. Jedoch wurde ein Clustered-Phänotyp während der aktiven Extravasation Prozess beobachtet. Bei 1 dpi begannen M2-Zellen aus den Gefäßen in die CHT des Zebrabärbling wandern aus. Bei 2 dpi begannen die migrierten Zellen M2 zwischen den Gefäßen in der CHT (5B) einen Cluster zu bilden. Die Quantifizierung der M2 invasiven Zellclusternummer in der CHT Region könnte werden durchgeführt6 dpi.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die wichtigsten Schritte für das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling untersuchen. (A) nach den Eltern Zebrabärbling Kreuzung über Nacht, Tg (FLI1: EGFP) Zebrafischembryos wurden die folgenden Morgen gesammelt und wurden bei 28 ° C gehalten. (B) Die Embryonen wurden mit einer feinen Pinzette unter einem Stereomikroskop 48 h nach der Befruchtung (hpf) dechorionated. Die markierten Brustkrebszellen wurden gesammelt und in einer geringen Menge an PBS resuspendiert. Nach gut Vorbereitung wurden suspendierte Zellen in eine Nadel geladen. Etwa 400 Zellen wurden in die Leitung Cuviers injiziert (DOC) des perivitellinen Raum unter einem Stereomikroskop. Die injizierten Embryonen wurden bei 33 ° C gehalten. (C) 2 h nach der Injektion (hpi), wurden die Embryonen auf ca unterworfenReful Screening unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Embryonen wurden bei 33 ° C für 3 oder 6 Tage gehalten. Während des Intervalls wurden die Embryonen auf die ausgelegt Behandlung unterzogen. (D) von Krebszellen durch Verbreitung perivitellinen Raum Injektion oder Invasion durch Doc Injektion wurde festgestellt, gezählt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet 3 oder 6 Tage nach der Injektion (dpi). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: perivitellinen Raum Injektionsstelle und häufige Fehler. (A) Etwa 400 mCherry-markierte Zellen (MDA-MB-231) wurden in den perivitellinen Raum injiziert. Die Hellfeld- (oberste), grün Vaskulatur (mittlere obere) und rote Zellmasse (Mitte unten) von injected Zebrabärbling Embryonen wurden durch konfokale Mikroskop erfasst. Das fusionierte Bild (untersten) der drei Kanäle zeigt, die Stereo-Position der Zellmasse im Embryo. (B) Die Zellen zielen nicht den perivitellinen Raum angemessen. Der Dottersack wurde aufgebrochen. (C) injizierten Zellen unter dem Schwellenwert (viel weniger als 400). (D) injizierten Zellen über den Schwellenwert (viel mehr als 400). Die Zellmasse war zu nahe an dem Kanal von Cuvier, die ein breites Blutstrom hat. Maßstabsbalken = 50 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Übersicht über den Ductus Cuvier (DOC) Injektion. (A) Schematische Darstellung der Doc Injektion bei 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) mit Brustkrebszellen in Zebrafischembryonen. Der Pfeil zeigt die Doc. (B) Beispiele für positive Injektionen mit etwa 400 - Brustkrebszellen; Negativ Injektionen, einschließlich des Eigelbs misinjection; und eine falsche Anzahl von Zellen bei 4 hpi injiziert. Pfeile und Kreise zeigen injizierten Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Vergleich der Verbreitung Fähigkeit zwischen verschiedenen Brustzellinien. Ungefähr 400 mCherry markierten MDA-MB-231, MCF10Aras (M2) oder MCF10A (M1) Zellen wurden in den perivitellinen Raum von Zebrabärbling-Embryonen 48 hpf injizieren. Die injizierten Embryonen wurden für 3 Tage gefolgt. (A, B, und C) Hoch Resolution Mikrographien der repräsentativen Migration und Verbreitung Prozess der MDA-MB-231 (A), M2 (B) und M1 (C) Zellen in einzelnen embryonalen Körper 1, 2 und 3 Tage nach der Injektion (dpi) zeigt. Links, die Zellmigration in dem perivitellinen Raum (rot) und die peritumoralen und intratumorale Gefäß (grün). Yellow Signale zeigen die Überlappung von Mikrogefßen und Zellen. Mitte, das ganze Bild des Embryos. Recht, Visualisierung von disseminierten Zellen im posterioren des Embryos. Gelbe Pfeile bezeichnen einzelne disseminierte Zellen. Maßstabsbalken = 50 um. (D, E, und F) Quantifizierung der Anzahl von disseminierten Zellen in jedem embryonalen Körper bei 1, 2 und 3 dpi. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Ergebnisse von Einweganalyse der Varianz (ANOVA) mit der post-hoc-Analyse verfolgt werden gezeigt. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen (* 0,01 <P <0,05; ** 0.001 <P <0,01; *** p <.001. (G) Vergleich der Häufigkeit von intravasation für MDA-MB-231, M2 und M1 - Zellen in embryonalen Körpern bei 1, 2 und 3 dpi. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Unterschiedliche Verhaltensweisen von MDA-MB-231 und M2 Zelle Metastasierung in Zebrabärbling mit Kanal von Cuvier Injektion. (A) Repräsentative konfokale Bilder des Zebrabärbling gefolgt bei 3, 4 und 5 dpi Einzelzellmigrationsverhalten der MDA-MB-231 - Zellen im Zebrafisch zu zeigen. Die Pfeile zeigen invasive MDA-MB-231-Zellen, die aus den Gefäßen in die tailfins migriert. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m in der linken Spalte 50 & mgr; m in der rechten Spalte. (B) Vertreterkonfokale Bilder des Zebrabärbling gefolgt nach 1, 2 und 3 dpi die Zellcluster Migrationsverhalten von M2-Zellen im Zebrafisch zu zeigen. Die Pfeile zeigen invasive M2-Zellen, die aus den Gefäßen zum kaudalen hämatopoetische Gewebe (CHT) und einen Cluster gebildet zwischen den Gefäßen migriert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier haben wir beschrieben , zwei Methoden , um das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in Tg (FLI1: EGFP) zu untersuchen Zebrabärblingembryonen, mit perivitellinen Raum und Doc - Injektionen. Durch die Injektion mit chemischen Farbstoff markiert Krebszellen oder fluoreszierendem Protein in transgene Zebrafischembryonen, die dynamischen und räumlichen Eigenschaften der Invasion und Metastasierung können deutlich an der Einzelzelle oder Clusterebene unter einem Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit verfolgt werden. In den meisten Fällen gewährleistet das rasche Fortschreiten der Metastasierung in Zebrabärbling, dass der Test kann innerhalb von 1 Woche nach der Transplantation durchgeführt werden. Darüber hinaus können leistungsfähige Statistiken mit großen Kohorten von Fischen gewonnen werden.

Frühe und späte Ereignisse der metastatischen Kaskade könnten simuliert und durch die Injektion von Krebszellen in den perivitellinen Raum oder Doc bzw. rekapituliert werden. Der Raum ist der perivitelline begrenzte Raum zwischen dem periderm der Fische und dem Dottersack, die allows eine Verbreitung von einzelnen Tumorzellen von primären Stellen im lebenden Körper zu überwachen. Nach der Implantation durchlaufen die Krebszellen lokale Migration und Invasion im perivitellinen Raum (als der primäre Ort) und dann intravasate sie in den Blutgefäße und verbreiten, mit dem Kreislauf zusammen. Am Kopf und tailfin (betrachtet entfernten Zielstellen), reichern sich die Krebszellen in engen Kapillarbetten und extravasate. die Anzahl der Zellen daher, die an den entfernten Stellen im Fischkörper gefunden werden, ist eine Messung der metastatischen Fähigkeit. Darüber hinaus können mehr extravasiert Zellen zu späteren Zeitpunkten beobachtet werden, was auch wahr, der Doc Injektion Test ist.

Der Doc ist eine vergrößerte gemeinsame Kardinalvene mit einem umfangreichen Blutstrom 24. Direkt Targeting der Doc als Injektionsstelle Krebszellen in das Kreislaufsystem eingeführt wird. In der Praxis diffundieren Brustkrebszellen im gesamten embryonalen Körper über dieBlutstrom sofort nach Doc Injektion. Die Zellen werden dann verhaften an der Schwanzvene und dorsalen Aorta. Extravasation, Invasion und Mikrometastasierung Bildung kann innerhalb von 6 Tagen nacheinander beobachtet werden. Wie bereits berichtet , 16 weisen metastatischen MDA-MB-231 - Zellen und präkanzerösen Brust M2 Zellen verschiedene invasive Phänotypen. MDA-MB-231-Zellen unterziehen Einzelzellinvasion der Kollagenmatrix reicht tailfin. Somit kann das Invasionspotential von MDA-MB-231-Zellen durch Zählen der Anzahl der Zellen gemessen werden, die die tailfin Gewebe extravasiert und überfallen haben. Im Gegensatz dazu bilden M2-Zellen-Cluster unterschiedlicher Größe und unterliegen kollektive Invasion der CHT. Quantifizieren der Invasionspotential von M2-Zellen durch die Anzahl der Cluster in diesem Protokoll zu zählen ist schwierig und wird vorzugsweise durch Herstellung eines 3D-Bildes unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie und Bestimmung des Volumens von gruppierten Tumorzellen durchgeführt.

Die technische Herausforderung in der Krebszelle MikroInjektions zielt erfolgreich den perivitellinen Raum oder Doc. Die Mikroinjektion von einer großen Anzahl von Embryonen ist eine mühsame Prozedur einen hoch qualifizierten und Patienten Bediener erfordert. Faktoren, die zu Abweichungen in den Ergebnissen der einzelnen Fische gehören das Entwicklungsstadium des Embryos beitragen, wenn die Injektion, Unterschiede in der Anzahl der Zellen injizierten, und das Austreten von Zellen in den Dottersack. Obwohl selten, könnte die Manipulation unbeabsichtigt das Gefäßsystem eindringen und einführte Zellen in das Kreislaufsystem direkt, vor allem in der perivitellinen Raum Injektion. Um weitere Variation zu reduzieren und die Zuverlässigkeit der Analysen zu gewährleisten, ist eine mikroskopische Untersuchung notwendig, um unqualifizierte Fisch zu den Zeitpunkten während des gesamten Prozesses auszuschließen. Darüber hinaus verblendet Analyse von einem Fachmann ohne Kenntnis der Einstellung stark zu erreichen unvoreingenommene Quantifizierung vorgeschlagen.

Zusammengefasst vergießen die beiden Modelle, die wir hier Licht eingeführt aufVisualisierung der Prozesse der Zellinvasion und Metastasierung in vivo ohne invasive Verfahren. Obwohl wir nur Brustkrebszellen in zwei Modellen in Bezug auf metastatische Potential untersucht, können sie auf andere Arten von Krebs übertragen werden. Darüber hinaus weisen die Modelle könnten breitere Anwendungen in die Mechanismen zu bestimmen und neue molekulare Ziele Metastasierung von Krebszellen zu steuern unter Verwendung von (epi) genetische Manipulation. Aufgrund der höheren Durchlässigkeit von Zebrabärblingembryonen durch niedermolekulare Verbindungen , wie 25 zum Zuführen oder Injektion von Nagetieren verglichen, haben die beide vorgestellten Modelle auch Vorteile in Bezug auf das Hochdurchsatz - Screening von potenziellen neuen anti-Invasion / Metastasierung Drogen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Untersuchungen an TGF-β-Familie Mitglieder werden vom Cancer Genomics Center Niederlanden unterstützt. Sijia Liu und Jiang Ren werden von der China Scholarship Council für 4 Jahre Studium an der Universität von Leiden unterstützt. Wir danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) für die MCF10A Zelllinien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

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References

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