A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Olig�ero

Biochemistry

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Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

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Abstract

Introduction

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que os efeitos de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Implicado fortemente no início e desenvolvimento da doença, é altamente propensos a agregação, peptídeo hidrofóbico beta-amilóide (Ap). Ap 2 varia de 36 a 43 aminoácidos de comprimento, no entanto, pensa-se que o 42-amino ácido variante, beta amilóide 42 (Aβ42), é a forma mais tóxica da proteína. 3 Isto é devido em grande parte à capacidade de Aβ42 para formar prontamente difus�eis, espécies oligoméricas que se acredita ser entidades particularmente neurotóxicos. 4 A fim de promover nossa compreensão do peptídeo Aâ, é essencial para obter rotineiramente material de alta pureza. A presença de vestígios de impurezas foi mostrado para alterar drasticamente as propriedades de agregação propensão do péptido. 5

Traditionally, a cromatografia líquida (HPLC) de separação dos péptidos hidrofóbicos, tais como Ap alto desempenho tem sido feito através da utilização de uma combinação de C 4 ou C 8 fases estacionárias à base de sílica e uma fase móvel de ácido. 6 No entanto, tais condições podem apresentar um desafio para a purificação do péptido. O ponto isoeléctrico baixo do péptido Ap (pi de aproximadamente 5,5) 7 significa que, sob condições ácidas, a agregação peptídica é aumentada e, como resultado grandes picos de HPLC, não resolvidas que são muitas vezes difíceis de isolar são produzidas (Figura 2A). Além disso, esses picos largos contêm frequentemente impurezas que podem ter impacto no perfil de agregação do peptídeo, e geralmente requerem ciclos subsequentes de purificação, que podem ter impacto dramaticamente a quantidade de péptido produzida.

O poli (estireno / divinilbenzeno) de fase estacionária, PLRP-S, representa um meio alternativo de PurifYing péptidos hidrofóbicos. A fase estacionária foi utilizado na purificação de um número de diferentes proteínas e ácidos ribonucleicos mensageiro (mRNA). 8, 9 A fase estacionária PLRP-S requer nenhum ligando de alquilo adicional para a separação de fase reversa, e o mais importante é quimicamente estável a um pH elevado, que leva a desagregação do péptido. 7 Relata-se um protocolo de purificação HPLC adaptado que produz alta pureza amyloid beta 42 (Aβ42) e beta 40 peptídeos amilóides (Aβ40).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

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References

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