Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Göz dolaşımındaki etiketli kan hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi, diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyonda inflamasyon ve iskemi hakkında bilgi sağlayabilir. Kan hücrelerini etiketlemek ve retinal dolaşımda etiketli hücreleri imal etmek için bir protokol tarif edilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Retinal ve koroidal kan akımı dinamikleri, glokom, diyabetik retinopati, yaşla ilişkili maküla dejenerasyonu (AMD) ve diğer oküler inflamatuvar durumlar gibi çeşitli göz hastalıklarının patofizyolojisi ve sekeli hakkında fikir sağlayabilir. Ayrıca, gözdeki terapötik tepkilerin izlenmesine yardımcı olabilir. Etiketlenmiş hücrelerin canlı hücre görüntülemesi ile birleştirilmiş kan hücrelerinin doğru şekilde etiketlenmesi, retina ve koroid sirkülasyonundaki akış dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Burada, sırasıyla, farelerde eritrositler ve lökositler için% 1.5 indosiyanin yeşili (ICG) ve% 1 sodyum fluorescein'in standart protokollerini açıklıyoruz. Taramalı lazer oftalmoskopi (SLO), C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retina dolaşımındaki etiketli hücreleri görselleştirmek için uygulandı. Her iki yöntem fare retinal dolaşımında farklı floresanla etiketlenmiş hücreler gösterdi. Bu etiketleme yöntemleri çeşitli oküler hastalıklarda daha geniş uygulamalara sahip olabilirmodelleri.

Introduction

Retina ve koroid sirkülasyonunda kan hücrelerinin akış dinamiklerini incelemek, görme engelli göz hastalıkları ve diğer oküler inflamatuvar durumların patogenezini anlamak için şarttır. Bununla birlikte, floresan boyaların plazma proteinlerine bağlanmasını içeren geleneksel anjiyografi teknikleri, eritrositlerin veya lökositlerin dinamikleri ile ilgili herhangi bir bilgi sağlamaz 1 . Eritrosit retina akışı dinamikleri, çeşitli inflamatuar koşullarda hücre göçü, tanıma, adezyon ve yıkımı anlamak için retinadaki metabolik olarak etkili dolaşımı ve lökosit akış dinamiğini incelemek için önemlidir 2 . Çeşitli hücre tiplerinin tanımlanmasında ve tanımlanmasında kullanılan çeşitli floresan molekülleri vardır 3 . Kan hücrelerinin hemodinamiği, uygun floresanla boyanarak ölçülebilirSent boyalar ve uygun görüntüleme tekniklerinin uygulanması 4 .

Yaşa bağlı maküler dejenerasyon (AMD) ve diyabetik retinopati (DR) gibi göz içi hastalıklarında inflamatuar yanıtların varlığı, hastalıklı bölgedeki lenfosit birikimini içerir 5,6 . Dokulardaki bağışıklık hücrelerinin takibi, hastalık patogenezi mekanizması içerisinde yer alan karmaşık olayları anlamaya yardımcı olabilir. Erken çalışmalarda hücre izleyicileri olarak 51 Cr ve 125 I gibi radyoaktif izotoplar kullanılmıştır. Bu boyalar toksiktir ve hücre yaşayabilirliğini etkiler. Radyoaktif işaretleyiciler 3 H ve 14 C, düşük emisyon enerjileri nedeniyle hücrelere karşı daha az toksik olmasına rağmen, sistemdeki sinyallerini algılamak zordur 7,8. Bir dizi florokrom boyası, w ile ilgili potansiyel problemlerin üstesinden gelmek için getirildi.İth radyoaktif işaretleyiciler ve flöresif mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak in vitro lenfosit göçünü izlemek 9,10. Hoechst 33342 ve thiazole orange, in vivo olarak lenfositleri izlemek için kullanılan DNA bağlayıcı flüoresan boyalardır . Hoechst 33342, DNA'daki AT zengini bölgelere bağlanır, membrana geçirgentir, flüoresan sinyallerini 2-4 gün korur ve söndürmeye dirençlidir 9 , 10 . Hoechst 33342 ve tiazol portakalın dezavantajları, sırasıyla lenfosit proliferasyonunun inhibisyonu 11 ve kısa yarılanma ömrüdür.

Calcein-AM, floresein diasetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -karboksifloresen, asetoksimetil ester (BCECF-AM), 5- (ve-6) - Karboksiflüoresein diasetat (CFDA) ve 5- (ve-6) -karboksiflüoresein diasetat asetoksimetil ester (CFDA-AM)Lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan sitoplazmik floresan boyalardır. Bununla birlikte, FDA, CFDA ve CFDA-AM, hücrelerde daha düşük saklama süresine sahiptir 9 . BCECF-AM proliferatif yanıtı azaltır ve kemotaksi ve süperoksit üretimini etkiler 9,12. Calcein-AM flüoresan bir boyadır ve kısa süreli in vivo lenfosit göç çalışmaları için yararlıdır. Güçlü floresan sinyalleri yayar, hücresel işlevlerin çoğuna müdahale etmez ve floresan sinyallerini 3 güne kadar korur 12,13. Floresan izotiyosiyanat (FITC) ve karboksiflüoresein diasetat sukkinimidil ester (CFDA-SE), lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan kovalent bağlama floresan boyalarıdır. FITC, hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki göstermez ve B lenfositleri ile T lenfositlerine kıyasla daha güçlü bir afiniteye sahiptir. 14 , 15 9 , 16'ya kadar in vivo izlenebilir. C18 DiI (1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat), DiO (3,3'-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 ve PKH26, Lökositler ve eritrositlerin etiketlenmesinde kullanılan floresan lipofilik karbosiyanin boyalarının yerleştirilmesi. C18 Dil ve DiO, hücre zarına dahil edildiğinde daha yüksek sinyaller verirler ve nispeten toksik olmayan 12,17 dir. PKH2, PKH3 ve PKH26 etiketli hücreler, flüoresan sinyallerinin iyi tutulmasını, daha az toksisite 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ile sergilemektedir. Bununla birlikte, PKH2, CD62L ekspresyonunu düzenler ve Mfosit canlılığı 23 .

Yukarıda bahsedilen çalışmaların çoğu, lenfatiklerde lenfosit göçü ve proliferasyonunun izlenmesi ve oküler olmayan dolaşımdaki etiketli eritrositlerin incelenmesi için yapılmıştır. Oküler dolaşımdaki kan hücrelerini incelemek için etiketleme tekniklerini uygulayan çok az çalışma bulunmaktadır. Taramalı lazer oftalmoskopinin (SLO) uygulanması, fundus anjiyografi vasıtasıyla in vivo retinal ve koroid sirkülasyonundaki etiketli hücrelerin incelenmesinde büyük bir avantaja sahiptir. Retinal dolaşımdaki lökositleri incelemek için kullanılan ICG, akridin portakalı, FITC, sodyum floresein ve CFDA gibi birkaç floresan boyası, 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Akridin portakal 26 , 27'nin fototoksisite ve karsinojenisitesi, FITC'nin hücresel aktiviteye müdahalesi ve retinal ve koroidal kan damarlarının çözünürlüğü için intravasküler kontrast madde gereksinimi, in vivo hayvan deneylerinde uygulamalarını sınırlar 29 . Sodyum fluorosein ve ICG toksik değildir, Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır ve insanlardaki testler 32 , 35 için güvenlidir. Akışın dinamik çalışmalarının çoğu, lökositlerin veya eritrositlerin etiketlenmesi ve retinal ve koroidal kan damarlarında görselleştirilmesi ile ilgilidir 36,37,38,39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, SingHealth, Singapur'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Oftalmikte ve Vizyonda Hayvanların Kullanımı İçin Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Kurumu (ARVO) Beyannamesi uyarınca uyulmuştur Araştırma.

1. Eritrositlerin ve Lökositlerin Floresan Boyalarla Etiketlenmesi

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. 3 mg ICG'yi 1800 μL sterilize edilmiş damıtılmış suda eriterek ICG'yi (1.5 mg / mL) hazırlayın. 200 uL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
    2. 6 mL steril damıtılmış suya 4 mL 1x PBS ekleyerek% 40 1x PBS hazırlayın. 10 ml 1x PBS 100 mg BSA ekleyerek PBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. BSA çözünene kadar iyice karıştırın.
  2. Deriştirme gradyanı santrifüjü kullanılarak eritrositler ve lökositler izolasyonu
    1. Fareleri uyuşturun (vahşi tay(50 mg / kg) ve ksilazin hidroklorit (0.5 mg / kg) kombinasyonunu kullanarak (ARVO kılavuz ilkeleri uyarınca program 1'e göre), pe C57BL / 6) Pedal çekme refleksiyle anestezi onaylayın ( yani , ayak parmağı çimdiktir).
    2. 29 gauge iğneyi (1 mL'lik şırıngaya bağlı) kalbe doğru kostal bir açı ile yavaşça yerleştirin. İğnenin kalpte olduğunu doğrulamak için, pistonu hafifçe çekin ve kanın şırıngaya çekilip kesilmediğini kontrol edin. Kalpten doğrudan 0.8 - 1 mL kan çıkarın.
    3. Hemen kanı, kan alma tüpünü içeren bir etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) (1.8 mg / mL kan) içine aktarın ve kan pıhtılaşmasını önlemek için nazikçe karıştırın.
    4. Fareler, intraperitoneal enjeksiyon ile pentobarbital (80 mg / kg) uygulayarak euthanize edin.
    5. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüjde tüm kanı bir polisükroz ve sodyum diatrizoat çözeltisinin (1: 1 oranında, yoğunluk 1.077 g / mL) üzerine kat edinLökositlerin ve eritrositlerin plazmadan ayrılmasına izin vermek için fuge (450 xg, 30 dakika).
    6. Bir pipet kullanarak süpernatanı (plazma) çıkarın ve atın. Tampon katını (lökositler) ve eritrositleri (kırmızı kan hücresi tabakası) pipetleri kullanarak dikkatli bir şekilde yeni ve ayrı tüplere aktarın.
  3. Eritrositlerin ICG (% 1.5) etiketlenmesi
    1. Herhangi bir kirleticiyi çıkarmak için eritrositleri 1x PBS ile yıkayın. % 50 hematokrit yapmak için eritrositleri 1x PBS (1: 1) içinde tekrar süspanse edin. Mikro santrifüj tüplerine 0.5 mL% 50 hematokrit (~ 250 uL paketlenmiş eritrositler) ilave edin. Eritrositler (750 xg, 5 dakika) santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
    2. Pelleted eritrositler 200 mcL% 40 1x PBS ekleyin, iyice karıştırın ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Eritrosit süspansiyonuna 100 μL ICG (1.5 mg / mL) ilave edin, tüp ters çevirerek yavaşça karıştırın ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 1x PBS 300 mcL ekleyin ve inkübe edin.37 ° C'de bir çalkalayıcı inkübatöründe 60 dakika süre ile inkübe edildi.
    3. Taşıyıcı eritrositler (750 xg, 3 dakika) santrifüjleyin ve 1 mL 1x PBS'de süspansiyon haline getirin.
    4. Süpernatant berrak olana kadar (adım 1.3.3), hücreleri 1x PBS ile 3 - 5 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra süpernatantı boşaltın ve% 50 hematokrit (1.25 x 108 hücre / mL) ICG etiketli eritrosit elde etmek için önceden şişmiş kırmızı eritrositlere% 1 BSA PBS (1: 1) ekleyin.
  4. Lökositlerin sodyum fluorescein (% 1) etiketlenmesi
    1. Yoğunluk gradyanlı santrifüj (adım 1.2.6'dan) ile tampon katın kandan ayrıldıktan sonra, herhangi bir bulaşmayı gidermek için 10 dakika boyunca 450 x g'de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri bir kez 10 mL 1x PBS ile yıkayın. Pelleti 1x PBS'nin 900 μL'sinde tekrar süspanse edin.
    2. Lökosit süspansiyon 900 mcL 100 mcL% 10 sodyum fluorescein ekleyin ve 2 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Etiketli hücreleri üç kez 10 mL 1X PBS ile santrifüjle yıkayın(450 xg, 10 dakika). Hücreleri 100 uL 1x PBS içine tekrar süspanse edin.

2. Floresanla Etiketli Hücrelerin Canlı Görüntüsü

  1. ICG etiketli eritrositlerin canlı hücre görüntülemesi
    1. Sırasıyla kuyruk damarı veya retro-orbital yolu ile enjeksiyon için hücreler hazırlamak için sırasıyla% 5 ve% 1 hematokrit hücreleri yapmak için 1x PBS ile ICG etiketli eritrositlerin% 50 hematokritini 10 kat ve 50 kat seyreltin.
    2. Kuyruk damarını dilate bırakmak için fare kızılötesi ışığın (250W yoğunluk) 5 dakika boyunca yerleştirin. Fare, intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin hidroklorür (50 mg / kg) ve ksilazin hidroklorür (0.5 mg / kg) ile anestezi altına alın (burada, tarifname 1'e göre ARVO kuralları uyarınca).
    3. Her göz bebeğini% 0.5 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin hidroklorür damlasıyla dilate edin.
    4. Görüntüleme için kontak lensi tek gözün üzerine yerleştirin. Görüntüleme ve kuru oluşumları önleme aracı olarak oftalmik jel kullanınKornea s. Fare göz kırılmasını telafi etmek için konfokal lazer tarama oftalmoskopi (SLO) kamerayı +25 diopter lens ile düzeltin.
    5. Fareyi SLO görüntüleme platformunun üzerine yerleştirin. Fare korneasının SLO makinesinin optik kafasına doğru baktığından emin olun.
    6. Görüntüleme modülünü açın. İlgili görüntüleme modülü yazılımını kullanarak, "Yeni Hasta" düğmesine tıklayın ve fare kulak etiketi numarası, doğum tarihi, floresan boyanın yüzdesi ve etiketli hücre türünün hayvan tanımlama ayrıntılarını ekleyin.
      1. Görüntüleme modülünü manevra ettirerek hayvanın optik sinirini görüntüleme ekranının ortasına yerleştirin. İlgili görüntüleme modülü yazılımını kullanarak 30 ° veya 15 ° açılı görüntü ayarıyla kızılötesi (IR) fundus görüntüsünü almak için "Acquire" düğmesine tıklayın. Retinanın merkezini, öğrenciyi ve lazerin optik yolunu en iyi kalitede görüntü elde etmek için hizalandırın.
    7. ICG fundus videosunu al.
      1. ICG filtresini (790 nm) açın, kamerayı 30 ° veya 15 ° görüş açısı ile yüksek hızlı moda getirin ve standartlaştırma için tüm okumalar için ICG yoğunluğunu 85'e ayarlayın. Videoyu (ana kontrol) 8.8 / 15 kare / saniye hızında 1 dakika boyunca almak için kontrol panelinde "Acquire" düğmesine tıklayın.
    8. ICG etiketli eritrositler 100 mcL'yi 30 gauge iğneye bağlı bir insülin şırınga içine yükleyin.
      1. Kuyruk damarı yolu üzerinden enjeksiyon için iğne şevini kuyruk damarına yerleştirin. Şırınganın içine kan akışını kontrol ederek damar içi erişimi doğrulayın ve etiketli hücreleri dolaşıma enjekte edin.
      2. Retro-orbital yol yoluyla enjeksiyon için iğneyi gözün bitişiğinde retro-yörünge aralığa yerleştirine. Kanın geri akışını şırınga içine kontrol ederek retro-yörünge erişimi teyit edin ve etiketli hücreleri dolaşıma enjekte edin.
    9. Enjeksiyondan sonra fareyi yeniden konumlandırın ve IR fundus görüntüsünü (adım 2.1.6.1'e bakın) ve videoyu ICG filtresini kullanarak alın (bkz. Adım 2.1.7.1). Retinal dolaşımdaki etiketli hücreler, hücrelerin enjeksiyonundan hemen sonra görselleştirilebilir.
    10. Video karelerini elde ettikten sonra, SLO görüntüleme modülü yazılımını kullanarak videoyu dışa aktarırken .tiff biçimini seçerek video dizilerinin .tiff görüntülerini ayıklayın. Dosyaları istediğiniz klasöre kaydedin.
    11. Kontakt lensi çıkarın, diğer gözün üzerine yerleştirin ve görüntülemeyi adımlar 2.1.4 - 2.1.7'de açıklandığı gibi tamamlayın.
    12. Görüntüleme sonrasında, anesteziden kurtulana kadar vücut ısısını korumak için anestezi altındaki hayvanı kızılötesi ışığın (250W) altına koyun. Hayvan tamamen kurtarıldığında fareyi tutma kafesine geri koyun.
  2. % 1 sodyum fluorescein ile işaretlenmiş lökositlerin canlı hücre görüntülemesi
    1. Fareyi hazırlayın ve cihazı, bölüm 2.1'de açıklandığı gibi kurun.
    2. Fareyi konumlandırın ve IR fundus görüntülerini adımlar 2.1.4 - 2.1.6'da açıklandığı gibi alın.
      1. Standartlaştırma için tüm okumalar için 30 ° veya 15 ° açı ve standart fluorescencein yoğunluğu 85 olan yüksek hızlı kamera modu ile fluorescein filtresi (488 nm) kullanarak fare floresein anjiyogramını elde edin. Videoyu 8.8 / 15 kareye / s'ye kaydedin (bkz. Adım 2.1.7.1).
        NOT: Burada, birden fazla video parçası (1 dak video) farklı zaman aralıklarında elde edilmiştir.
    3. Bölüm 2.1.8'de açıklandığı gibi kuyruk damarı veya retro-orbital enjeksiyon yoluyla fare içine 100 mcL etiketli lökositler enjekte edin.
    4. Enjeksiyondan hemen sonra fareyi konumlandırın ve IR fundus görüntüsünü alın (bkz. Adımlar 2.1.5 ve 2.1.6) ve fluoFare anjiyogramını ressein (bkz. Bölüm 2.2.2).
    5. Görüntüleme modülü üzerindeki odaklama düğmesini çevirerek tarama lazerinin odak noktasını ayarlayarak retina veya koroid kan damarlarındaki etiketli hücrelere dikkat edin.
    6. SLO görüntüleme modülü yazılımını kullanarak video kareleri ve görüntüleri elde edin (bkz. Adım 2.1.10) ve istenen bir klasöre kaydedin.
    7. Prosedürden sonra, hayvan bakımı için 2.1.12. Adıma dikkat edin.
  3. MtrackJ yazılımı ile görüntü analizi
    1. ImageJ'de "Dosya" yı tıklayarak resim sırasını açın. "Al" ı seçin ve "Resim sekansı" nı seçin, istediğiniz görüntü klasörünü seçin ve "Aç" ı tıklayın. Ekranda "Sıra seçenekleri" adlı bir açılır pencere belirecektir. "Tamam" ı tıklayın; Görüntü sırası açılacaktır.
    2. Resim videosunun çerçeve aralığını "Resim" i tıklayarak seçin ve hız ölçümleri için "Özellikler" i seçin. Burada, 8.8 çerçevees / s.
    3. "Eklentiler" i seçerek MTrackJ eklentisini açın. "İzleme" yi seçin ve ardından "MtrackJ" öğesini seçin. Bir menü görünmelidir.
    4. İzleme ayarlarını yapmak için, "İzleme" yi (menü altında) seçin ve "Nokta ekledikten sonra bir sonraki çerçeve dizinine taşı" kutusunu işaretleyin.
    5. İlk hücrenin yolunu izleyin.
      1. Bir hücreyi bulun ve sonraki hücrelerde aynı hücrenin izini takip edin. Menüde yeni bir parça eklemek için "Ekle" yi tıklayın.
      2. İmleci imajın üzerine getirin (+ işareti) ve uygun hücrenin üzerine tıklayın.
        NOT: MTrackJ otomatik olarak sonraki zaman aralığına atlar ve yörüngenin ilk noktasının konumunu işaretleyen küçük bir daire ekler.
      3. Görüntü sırası çerçeveleri arasında gezinirken hücrenin geçerli konumunu tıklayarak devam edin.
        NOT: Bazen, yörüngedeki önceki noktaları işaretleyen daireler, geçerli konumu görüntüleme yeteneğini etkiler. Bu gerçekleşirse,Adım 2.3.5.3.1'e geçin.
        1. Yörüngenin görüntüleme seçeneğini, menüde "Görüntüleme" yi tıklayarak ve "şu andaki saatte yalnızca iz noktalarını göster" seçeneğini belirleyerek değiştirin. Tüm yörüngeleri görmek için bu seçeneğin seçimini kaldırın.
      4. İlk hücrenin yörüngesi görene kadar tıklaymaya devam edin. Daha sonra "Kaydet" i tıklayarak parçayı kaydedin.
    6. İkinci hücrenin yolunu izleyin.
      1. Menüde yeni bir parça başlatmak için "Ekle" yi tıklayın. Yeni hücreyi izlemek için 2.3.5.1 - 2.3.5.4 adımlarını tekrarlayın. İkinci parçayı kaydetmek için "Kaydet" i tıklayın.
      2. Gözlemlenebilir tüm izlenebilir hücreler için bu adımları uygulayın. Hücreleri takib ettikten sonra, sonuçları almak için menü sekmesindeki "Ölçme" ve "Tamam" ı tıklayın.
        NOT: Bir sonuç penceresi otomatik olarak açılır; daha fazla analiz için kaydedilebilir ve bir elektronik tabloya açılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositler, C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retinal dolaşımında görselleştirildi. Retinal dolaşımda,% 1.5 ICG etiketli eritrositlerden% 1 ve% 5 hematokrit ayırdedilebilirdi. Bununla birlikte, bireysel etiketli hücreler,% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositlerin% 1'lik hematoktriti ile daha net görselleştirildi ( Şekil 1 ). % 5 hematokritte, retina damarlarındaki çok sayıda etiketlenmiş hücre yüzünden, tek tek hücreleri işaretlemek mümkün değildir. Peripapiller bölgede her iki koşulda da bazı eritrostaz gözlenirken, etiketli eritrositlerin% 5 hematokritinde daha belirgindi ( Şekil 2 ).

Yukarıdaki protokolün ardından lökositler% 1 sodyum floresein ile başarıyla etiketlendi ve floresan mikroskobu kullanılarak yeşil etiketli hücreler olarak görüldü ( Class = "xfig"> Şekil 3). Etiketli numunelerde küçük hücrelerin kümeleri (birlikte 4-5 hücre) gözlenmiştir. Hücreler fare dolaşımına enjekte edildiğinde, etiketli lökositler retinal dolaşımda görselleştirildi ( Şekil 4 ). Etiketlemeden sonra hem eritrositler hem de lökositler hemen farelere enjekte edildi ve 30 ve 60 dakika zaman aralıklarında görselleştirildi. Floresanla işaretlenmiş hücreler enjeksiyondan hemen sonra gözlemlendi, ancak floresan yoğunlukları 30 ve 60 dakika aralıklarla yavaş yavaş azaldı. Ayrıca, eritrositlerde lökosit boyama protokolünü (% 1 sodyum floresein) kullandık ve eritrositlerin etiketlenmesini gözlemledik. Image J genel alan yazılımındaki Mtrack J eklentisini kullanarak, hücreler retinal dolaşımda izlendi ( Şekil 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
Şekil 1 : Retinal Dolaşımda% 1.5 ICG ile Etiketlenen Eritrositlerin% 1 Hematokriti. ICG, retinal damarlarda parlak sinyaller gösteren bireysel eritrositleri etiketledi. Peripapiller bölgede bazı eritrostaz izlendi. Ölçek = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : Retinal Dolaşımda% 1.5 ICG ile Etiketlenen Eritrositlerin% 5 Hematokriti. Birçok ICG etiketli eritrositler retinal damarlarda parlak sinyaller sergilemektedir; Peripapiller bölgede eritrosit büyük miktarda gözlendi. Ölçek = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3 :% 1 Sodyum Florosein Etiketli Lökositlerin Floresan Mikroskopi Görüntüsü. Küçük kümeler (20X büyütme, ölçek = 50 μm) ile yeşil floresan sinyalleri gösteren sodyum fluorosein etiketli lökositler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4 : Retina Sirkülasyonunda% 1 Sodyum Floresein ile Lökosit Bulunması. Retinal damarlarda parlak sinyal gösteren sodyum fluorosein etiketli lökosit (ok). Ölçek = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5 : Görüntü Analiz yazılımı kullanılarak Retinal Sirkülasyonda Etiketli Bireysel Hücrelerin İzlenmesi. Retinal dolaşımdaki etiketli hücrelerin ortalama hızını hesaplamak için farklı parçalar (renkli daireler ve görüntü üzerinde gösterilen çizgiler) ölçülmüştür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birçok oküler hastalığın patofizyolojisini anlamak için retinal ve koroid sirkülasyonundaki hemodinamiğin araştırılması hayati önem taşımaktadır. Retinal dolaşımdaki kan akımı dinamikleri Fourier domain optik koherens tomografi (FD-OCT), lazer speckle flowgraphy (LSFG) ve retinal oksimetre ile incelenebilir. Bu yöntemler, retinal dolaşımdaki toplam kan akışını incelemek için farklı yaklaşımlar kullansalar da, 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , bireysel hücre tiplerinin akış dinamiğini inceleme yetersizliğinin kısıtlılığını paylaşmaktadırlar. Retinaya ve koroid dokularına besin maddeleri ve oksijen temininin yanısıra, göz enflamasyonlu hastalıklardaki immün hücrelerin migrasyonu ve hastalık patogenezindeki rolü, eritrositlerin akış dinamikleri incelenerek incelenebilirYitrositler ve lökositler, sırasıyla retinal ve koroid sirkülasyonunda. Görüntüleme yöntemleriyle birleştirilmiş etiketleme teknikleri, dolaşımdaki etiketli hücreleri izlemeye ve etiketli hücrelerin akış dinamiklerini incelemeye yardımcı olacaktır. Dolaşımdaki akış dinamikleri 3 , 17 , 18 , 19'da incelenmek üzere lökositlerin ve eritrositlerin etiketlenmesinde çeşitli fluoresan boyaları başarıyla uygulanmıştır.

Burada, sırasıyla, retinal dolaşımdaki eritrositlerin ve lökositlerin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için, sırasıyla toksik olmayan floresan boyalar, indosiyanin yeşili ve sodyum fluoresceini onaylayan Yiyecek ve İlaç Uygulamasının uygulanmasını rapor ettik. Sodyum floresein, lökositlerin izlenmesi için en sık kullanılan boya olmasına rağmen 31 , 32 , 33 46 .

SLO'da kaliteli görüntüler elde etmek için, nemli bir kornea korumak ve katarakt oluşumunu önlemek için öğrencilerin oftalmik jel ile birlikte tamamen genişlemeleri ve kontakt lens kullanılmaları gerekir. Kalın fundus ve anjiyogram görüntüleri elde etmek için gözlerin konumu ve kameranın optik yolu düz olmalıdır. Görüntüleme sırasında hareketi en aza indirgemek için hayvan derince sedasyona tabi tutulmalıdır. Hem% 1 hem de% 5 ICG'nin% 5 hematokritiEtiketli eritrositler, retinal dolaşımdaki floresanla işaretlenmiş hücrelerin görselleştirilmesini göstermiş,% 1'lik hematokrit, tek tek hücrelerin izlenmesi için daha uygundu. Enjekte edilen lökositler sayısı çok düşükse, flüoresan etiketli hücreler görselleştirilemez. Bu nedenle, retinal dolaşımdaki etiketli hücrelerin izlenmesinde daha iyi sonuçlar elde etmek için, en az 4 fareden lökosit toplamak,% 1 sodyum fluorescein ile etiketlemek ve tek bir fareye enjekte etmek önerilir. Sodyum fluorescein (Calcein, FITC, DIO, FDA ve CFDA'ya sodyum flöresine benzer veya yakın absorbsiyon / emisyon maksimumu) için bazı alternatif boyalar olmasına rağmen, göz tutma oranı ve göz dokularına toksisite değerlendirilmelidir 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

Bildirilen tekniğin sınırlaması,60 dakika sonra dolaşımdaki flüoresan sinyalinin solması. Bu nedenle, etiketli hücrelerin akış dinamiği 60 dakika içinde analiz edilmelidir. Burada, lökositleri etiketlemek için bir fareden kan çekildi, hücreler izole edildi, etiketlendi, başka bir fare içine enjekte edildi ve SLO ile görselleştirildi. Bununla birlikte, SLO'da retina kan damarlarında çerçeve başına sadece 0-1 hücre gözlenmiştir. Bu, yetersiz lökosit hücre sayısına bağlı olabilir ve bu nedenle, her çerçeve için daha yüksek bir hücre sayısını görselleştirmek için en az 3 - 4 fareden kan toplamayı öneririz. Çalışmada 8.8 kare / sn kamera hızı kullanıldı, ancak etiketlenmiş hücrelerin daha ardışık görüntüleri ve videoları elde etmek için bu arttırılabilir.

Daha önce yapılan çalışmalarda, DR'nin farklı evrelerindeki diyabetik hastaların retinal dolaşımındaki kan akış hızındaki değişiklikler bildirilmiştir. Clermont ve ark. DR 47'nin erken dönemindeki hastalarda retinal kan akışında% 33'lük bir düşüş bildirdi ve Nguyen ve ark.ark. Proliferatif DR 48 olan diyabetik hastalarda retinal kan akışında bir artış bildirdi. Artan glokom 49 ile ilişkili olarak azalmış bir kan akış hızı bildirilmiştir 49 . Daha önce bahsedilen çalışmalarda, yazarlar retinal dolaşımdaki tüm kan akış hızlarını araştırmışlardır. Her bir hücre türünün akış hızlarının incelenmesi, farklı hastalıklarda ve hastalığın farklı evrelerindeki hücresel etkileşimler hakkında bilgi sağlayabilir ve prognozda yardımcı olabilir. Burada sırasıyla ICG ve sodyum fluorescein ile eritrositler ve lökositlerin etiketlenmesi için bir yöntem ve bunların retinal dolaşımdaki görselleştirilmesi; Bu yöntem, in vivo çalışmalar için herhangi bir hastalık modelinde uygulanabilir.

Gelecekteki araştırmalar, farklı ilaç tedavisi koşulları altında etiketlenmiş eritrositlerin ve lökositlerin akış dinamiklerindeki değişimi incelemek için SLO'yu kullanarak etiketleme tekniklerimizi kullanabilirHastalığın çeşitli evrelerinde görülür. Ayrıca, yöntemlerimiz, hastalık fenotiplerinde eritrositlerin ve lökositlerin rolünü anlamamıza yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok. Mali veya çıkar çatışması yok.

Acknowledgements

Araştırma projesi Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC), Singapur'dan Yeni Araştırmacı tarafından finanse edildi. Ekip, Kasım 2012'den Ekim 2014'e kadar Prof. Dr. Rahibe Gül'ün danışmanlığı altında Ulusal Tıbbi Araştırmalar Konseyi (NMRC) Yurtdışı Araştırma Eğitim Bursu kapsamında Gözlemevi Enstitüsü (Io), Londra Üniversitesi Koleji (UCL) üzerinde Dr Agrawal'a verilen araştırma eğitimini onaylamak istiyor. David Shima. Agrawal, Dr. Shima'nın laboratuvarında hücrelerin etiketlenmesi ve canlı görüntüleme konsepti ve becerileri edinmiştir. Ekip, dolayısıyla Prof. David Shima, Kenit Meissner, Dr. Peter Lundh ve Dr. Daiju Iwata'nın eğitim arkadaşlığı sırasında gözetim ve rehberliği kabul etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics